中間錦雞兒CiDR1的克隆及干旱脅迫下的表達分析

武苾菲，李萬峰，徐海燕，張立峰，齊力旺，韓素英*

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091； 2.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

中間錦雞兒CiDR1的克隆及干旱脅迫下的表達分析

武苾菲1，李萬峰2，徐海燕2，張立峰2，齊力旺2，韓素英1*

(1.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091； 2.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

[目的]研究并了解中間錦雞兒CiDR1基因功能及其對干旱脅迫的響應，為抗性育種提供候選基因。[方法]通過RACE技術從中間錦雞兒中克隆CiDR1基因的cDNA全長，利用生物信息學分析軟件對其基因結(jié)構(gòu)及功能進行分析和預測。再通過qRT-PCR技術對干旱脅迫后的幼苗中的CiDR1表達模式進行研究。[結(jié)果]從中間錦雞兒中克隆到CiDR1基因的cDNA全長共計4 297 bp，GenBank登錄號為KP277100。生物信息學分析表明，預測的CiDR1蛋白序列中含有1 243個氨基酸殘基，具有抗病基因特征結(jié)構(gòu)域TIR、NB-ARC、LRR等，其等電點為6.35，不穩(wěn)定指數(shù)為42.91，不具備信號肽，為非分泌蛋白，定位于細胞質(zhì)中。定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，CiDR1基因在幼年期的莖中表達量較低，在成年期的葉片中表達量較高；在干旱脅迫處理后的幼苗中，CiDR1表達水平有明顯下降，表明該基因的表達受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應干旱相關。[結(jié)論]中間錦雞兒在干旱脅迫后其根、莖和葉中CiDR1的表達均明顯下降，表明CiDR1的表達受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應干旱相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)CiDR1在根、莖、葉中的表達水平可能受發(fā)育階段調(diào)控。

中間錦雞兒；CiDR1； TIR-NBS-LRR；干旱

中間錦雞兒(CaraganaintermediaKuang et H.C.Fu)，俗稱檸條，為豆科、錦雞兒屬旱生落葉灌木，分布在我國西部荒漠草原、干旱草原地區(qū)，是這些地區(qū)的建群植物種[1]。中間錦雞兒耐寒、耐熱、抗干旱、耐貧瘠，對沙地環(huán)境有很強的適應能力，可防風固沙、保持水土、改善局部小環(huán)境[2]。近年來，對中間錦雞兒的研究日益增多，特別是對其干旱適應性方面。

目前，對中間錦雞兒干旱適應性的研究大致可分為生理機制研究和分子機制研究兩類。生理研究發(fā)現(xiàn)，檸條氣孔開度較小，全天開啟進行不間斷的蒸騰，這與一般植物中氣孔白天開、晚間閉有明顯的差異[3]；當土壤、葉片間的水分關系緊張系數(shù)低于1.0以后，檸條蒸騰速率會自動調(diào)低，以避免大量失水[4]，另有文章進一步證實檸條的抗旱性與蒸騰速率、小葉水勢和葉含水率呈負相關[5]；在受到干旱脅迫時，檸條胞間二氧化碳體積分數(shù)先輕微下降，而后上升，這與凈光合速率的變化趨勢相反[6]；在不同CO2濃度下，干旱脅迫均會造成檸條生物量的減少，且根、莖、葉中生物量下降的程度不同[7-8]。分子機制方面，檸條錦雞兒水分脅迫下葉片均一化全長cDNA文庫及葉片抑制性差減雜交文庫已被構(gòu)建[9-10]，且已經(jīng)篩選出適合干旱脅迫下進行基因表達分析的內(nèi)參基因[11]。綜上，目前對檸條抗旱性的研究大多集中在生理方面，而對分子方面的研究相對較少。為探究中間錦雞兒適應干旱的分子機理及進行抗性育種，尋找中間錦雞兒抗旱相關基因并對其功能進行解析顯得十分必要。

大豆miR2118被證實與干旱脅迫顯著相關，推測miR2118通過對其靶基因TG01的調(diào)控參與到大豆的干旱脅迫響應[12]。通過分析中間錦雞兒小RNA測序數(shù)據(jù)，我們獲得了中間錦雞兒miR2118全長[13]，并預測了其靶基因cDNA序列片段。為了明確中間錦雞兒miR2118靶基因是否參與干旱脅迫響應，我們克隆了其靶基因CiDR1的cDNA全長序列，并分析了它在中間錦雞兒遭受干旱脅迫時的表達模式。本研究為了解中間錦雞兒CiDR1基因表達與耐旱性的關系提供了借鑒，并為進一步進行中間錦雞兒抗性育種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

中間錦雞兒種子于2013年7月中旬采集自中國林科院玉泉苗圃，用無菌水反復清洗后種植于含有蛭石、珍珠巖的營養(yǎng)土中于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(晝溫28℃，夜溫25℃，相對濕度60%)。生長3周后，將幼苗從土壤中取出，清水洗凈后分根、莖、葉，分別保存于液氮中，用于基因克隆和幼年期基因表達分析。

從中國林科院玉泉苗圃5年生中間錦雞兒植株上取根、莖、葉、花和種子，分別于液氮中保存，用于成年期營養(yǎng)器官和生殖器官中基因表達分析。

中間錦雞兒種子在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，選取長勢一致的幼苗，用無菌水清洗干凈后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland ’s 營養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，期間每天更換培養(yǎng)液，以保證氧氣充足。5天后將小苗取出，進行干旱脅迫處理。具體處理辦法[12]：將小苗用清水洗凈后，先用濾紙將表面殘余水分吸干，而后用雙層滅菌濾紙包裹根部放入干凈錐形瓶中，于室溫下放置。放置0、2、4、8、12、24、48 h后，分根、莖、葉取材，保存于液氮中，用于干旱脅迫下基因的表達分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 將中間錦雞兒根、莖、葉混合樣于液氮中磨碎后，稱取材料100 mg，按照TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit說明書進行總RNA的提取。樣品總RNA的濃度和純度用ND-1000分光光度計(Nanodrop Technologies，USA)進行檢測；RNA的完整性用1.5%的凝膠電泳檢測。cDNA第一鏈的合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，#K1621)進行，反應產(chǎn)物用于目的基因全長cDNA的擴增和基因表達分析。用于Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)的cDNA采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(clontech，USA)進行合成。

1.2.2 Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE) 將已有中間錦雞兒序列片段經(jīng)PCR檢測，確認真實表達后，用Primer 5.0設計引物，使用Advantage2 PCR Kit(Clontech，USA)進行RACE擴增。特異引物5’-GTCCCCGTTAACCTCCGCACATCAA-3’ 和5’-GGCAAAACAGATCGACCCTTGTCCT-3’分別為5’RACE的第一輪引物和第二輪引物。第一輪反應條件為94℃ 2 min預變性，循環(huán)1次；之后94℃ 30 s變性，65℃ 30 s退火；72℃ 2 min延伸，循環(huán)30次。第二輪反應程序不變，退火溫度改為61℃。特異引物5’-GGATTCATGGAGTTGGTGGGA-3’和5’-TGGGTTGCCATATCTCCAAA-3’分別為3’ RACE的第一輪引物和第二輪引物。第一輪反應條件為94℃ 2 min預變性，循環(huán)1次；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 3 min，循環(huán)30次。第二輪反應程序不變，退火溫度改為66℃。電泳檢測后，將擴增到的目的產(chǎn)物回收、連入pEASY-T1載體中送公司測序。

將3’RACE和5’RACE測序獲得的片段與中間片段拼接后，設計引物5’-TTCATCCTTTTGCTTACAAGAAC-3’和5’-GACATGGACTCCGATTATCTCACA-3’，擴增cDNA全長進行驗證。反應使用超保真DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)進行，擴增條件為98℃初始變性30 s，98℃變性8 s，59℃復性20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后72℃終延伸8 min。電泳檢測后，將擴增到的目的產(chǎn)物回收、連入pEASY-Blunt載體中送公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 使用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析CiDR1基因開放閱讀框，并用Pfam(http://pfam.xfam.org/)對預測到的CiDR1蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域分析。編碼蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性分別采用Protparam和ProtScale(http://web.expasy.org)程序進行分析，跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽的查找及亞細胞定位分別使用TMHMM2.0、SignalP 4.1和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services)進行，使用DNAMAN進行多序列比對及同源性分析，最后采用CLUSTAL X和Mega5.05軟件進行進化樹構(gòu)建。

1.2.4CiDR1基因的表達分析 中間錦雞兒CiDR1基因在生長發(fā)育各個時期、不同器官內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達及干旱脅迫下的表達均以UNK2[11]為內(nèi)參基因，采用SYBR Green熒光染料法，在BioRad CFX96TM實時熒光定量PCR儀上進行。定量PCR引物為5’-GAACGGGGATGGATATGAGC-3’和5’-CCAACTCCATGAATCCCTACCA-3’。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒說明書配制反應體系，每個反應做三次重復；反應程序為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，59.5℃退火34 s，循環(huán)40次，之后95℃ 5 s，60℃ 30 s，反應結(jié)束后做溶解曲線分析。實驗數(shù)據(jù)用BioRad實時熒光定量PCR系統(tǒng)軟件和Excel 2010進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間錦雞兒CiDR1基因全長cDNA克隆及生物信息學分析

通過3’ RACE和5’RACE巢式擴增，分別獲得3 383 bp和463 bp的序列片段，與中間片段拼接之后，得到了CiDR1基因的全長cDNA序列共計4 297 bp，全長引物驗證結(jié)果如下(圖1)。將CiDR1基因的cDNA序列提交至GenBank，登錄號為KP277100。分析表明，CiDR1基因的cDNA序列包含一個完整的開放閱讀框，為3 732 bp，共編碼1 243個氨基酸殘基。經(jīng)psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)分析，這段序列中含有miR2118的結(jié)合位點(圖2)，表明CiDR1可能是miR2118的靶基因。

M：DNA標記 M：DNA marker圖1 CiDR1基因cDNA全長克隆電泳結(jié)果Fig.1 PCR product of CiDR1 cDNA sequence

圖2 CiDR1基因中miR2118靶位點示意圖
Fig.2 The alignment of miR2118 and CiDR1 transcript sequences

ExPASy ProtParam分析表明，CiDR1蛋白的分子量約為141 069.6 Da，等電點為6.35；氨基酸組成中亮氨酸所占比例最高，達到14.1%，其余氨基酸含量均在10% 以下；CiDR1蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.91。ProtScale軟件的分析結(jié)果表明CiDR1蛋白平均親水性為-0.126，該蛋白既有親水區(qū)又有疏水區(qū)，且親水性較強而疏水性較弱?？缒ゎA測顯示CiDR1無跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)SignalP4.1的神經(jīng)網(wǎng)絡算法預測CiDR1蛋白的信號肽，發(fā)現(xiàn)其信號肽分值為0.098，遠低于0.5據(jù)此可以推測該蛋白不具備信號肽，可能為非分泌蛋白。亞細胞定位分析表明，該蛋白極有可能定位于細胞質(zhì)中。

2.2 不同植物中DR1同源基因的系統(tǒng)進化分析

Pfam結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示，CiDR1蛋白具有TIR-NBS-LRR家族共有的TIR、NB-ARC、LRR等幾個保守結(jié)構(gòu)域[14-15]，據(jù)此可進一步確認CiDR1為NBS型抗病基因。保守結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，其與GenBank中已登錄的植物TIR-NBS-LRR類抗病基因具有一定同源性(圖3)。利用保守結(jié)構(gòu)域在NCBI中BLAST其他植物中已知的TIR-NBS類抗病基因，剔除親緣關系較遠的物種后，最終選定14種植物，包括苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)、大豆(Glycinemax(L.) Merr.)、蕓豆(PhaseolusvulgarisL.)、鷹嘴豆(CicerarietinumL.)、山荊子(Malusbaccata(L.) Borkh.)、黃瓜(CucumissativusL.)、擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)等進行系統(tǒng)進化分析。

(a)TIR 結(jié)構(gòu)域;(b)NBS結(jié)構(gòu)域(a) TIR domain; (b) NBS domain圖3 CiDR1基因保守結(jié)構(gòu)域與其他已知物種抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的比較Fig.3 Comparison of conserved domain of CiDR1 in C. intermedia with other species

采用CLUSTAL X進行多序列比對，將比對結(jié)果在Mega5.05軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果表明，中間錦雞兒和苜蓿、鷹嘴豆親緣關系最近，其次是大豆和蕓豆(圖4)，這五個物種同屬于豆科蝶形花亞科，該結(jié)果與植物形態(tài)學分類結(jié)果相一致。與豆科植物在同一分支上的是黃瓜、可可(TheobromacacaoL.)和山荊子，說明它們中的DR1基因相似性較高。而在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離中間錦雞兒CiDR1基因最遠的是山白松(PinusmonticolaDouglas ex D. Don)、火炬松(PinustaedaL.)和毛果楊(PopulusrihocarpaTorr. & A.Gray ex. Hook.)，它們從起源處就處于不同分支，尤其是火炬松，其DR1基因與CiDR1基因相似性只有19.3%。

注：Medicago truncatula苜蓿(XM_003620157)；Cicer arietinum鷹嘴豆(XM_004512741)；Glycine max大豆(XM_006603803)；Phaseolus vulgaris菜豆(XM_007151169)；Cucumis sativus黃瓜(HM124891)；Theobroma cacao可可(XM_007044371)；Malus baccata山荊子(AY363617)；Arabidopsis thaliana擬南芥(AY522496)；Malus x domestica蘋果(KC693054)；Helianthus annuus向日葵(GU085221)；Populus trichocarpa毛果楊(DQ513250)；Pinus monticola山白松(HQ840715)；Pinus taeda火炬松(AY091566)圖4 CiDR1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of CiDR1 protein

2.3CiDR1基因在不同發(fā)育時期及干旱脅迫下的表達分析

定量PCR分析表明，CiDR1基因在中間錦雞兒幼年期及成年期的各個器官中均有表達，且在每個器官中，幼年期的表達量都低于成年期(圖5)；無論是在幼年期還是在成年期，莖中的表達量相對較低，葉中的表達量相對較高(圖5)。干旱脅迫后，CiDR1表達量迅速下降，到第8小時左右表達量有小幅回升，到第12小時表達量又下降到比之前更低的水平；且在中間錦雞兒根、莖和葉中，CiDR1基因響應干旱脅迫時的表達變化呈現(xiàn)相似的模式(圖6 (a)，(b)，(c))。

R：根；S：莖；L：葉；F：花；SE：種子R:Root; S:Stem; L:Leaf; F:Flower; SE:Seed圖5 CiDR1基因在不同器官中的表達分析Fig.5 The relative expression of CiDR1 gene in different tissues

圖6 CiDR1基因在干旱脅迫下的表達分析
Fig.6 The relative expression of CiDR1 gene under drought stress

3 討論

干旱嚴重影響到植物的生長和發(fā)育，有報道稱干旱對作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位[16-17]。為最大限度地減輕干旱脅迫造成的傷害，植物中表達了一系列干旱適應相關基因，目前已克隆的干旱脅迫相關基因大致可分為兩類[18-21]：一類基因編碼的蛋白質(zhì)在信號傳導和基因表達中起調(diào)節(jié)作用，為調(diào)控基因，包括：轉(zhuǎn)錄因子，如DREB[22-23]等；蛋白激酶，如MAP激酶等[24]和其他一些信號分子如鈣結(jié)合蛋白CDPK[25]等。另一類基因編碼的蛋白質(zhì)對干旱脅迫中的植物起直接的保護作用，為功能基因。這類基因包括脫水響應基因RD29A，RD29B等[26]；水通道蛋白MIP等[27]；滲透蛋白LEA蛋白等[28]及COR、KIN、LTI等晚期響應基因[29-30]。這些基因在植物遭受干旱脅迫時，其表達被快速誘導或抑制，以保障植物的生存。本研究發(fā)現(xiàn)，中間錦雞兒在干旱脅迫后僅2 h，其根、莖和葉中CiDR1的表達均明顯下降，表明CiDR1的表達受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應干旱相關。值得關注的是，幼年期植物根、莖、葉中CiDR1的表達水平均低于成年期植物對應器官中的表達，表明CiDR1的轉(zhuǎn)錄受發(fā)育階段調(diào)控。

CiDR1基因編碼的產(chǎn)物為TIR-NBS-LRR類抗病相關蛋白。該蛋白的NBS結(jié)構(gòu)域包含一些非常保守的基序，如p-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDD)、Kinase-3a(GSRII)及跨膜區(qū)GLPL[31]，因此常被用于植物抗病基因的識別和分類[32]。由生物信息學分析可以初步認定，CiDR1基因的編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，為親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)且屬于非分泌蛋白，定位于細胞質(zhì)中。編碼氨基酸序列多重比對分析發(fā)現(xiàn)，CiDR1與其他植物有很高的同源性，特別是豆科植物苜蓿、鷹嘴豆、大豆等，相似性均達到60%以上，表明CiDR1可能與豆科植物苜蓿、大豆等有同一起源。有報道稱大豆NBS抗病基因TG01受到干旱脅迫誘導表達[12]，這更加為我們的實驗結(jié)果提供了佐證。

植物抗旱基因的發(fā)掘及抗旱機制的研究一直是人們關注的焦點。中間錦雞兒對干旱脅迫的響應涉及到體內(nèi)各類物質(zhì)代謝、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導和物質(zhì)運輸?shù)榷鄠€方面[10]。本研究對CiDR1基因進行了初步研究，下一步對其功能的深入分析將有利于我們解析中間錦雞兒干旱適應性的分子機理。

4 結(jié)論

本研究中，中間錦雞兒在干旱脅迫后其根、莖和葉中CiDR1的表達均明顯下降，表明CiDR1的表達受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應干旱相關，進一步研究發(fā)現(xiàn)CiDR1在根、莖、葉中的表達水平可能受發(fā)育階段調(diào)控。相關研究為中間錦雞兒抗旱基因工程和遺傳改良提供了參考，并為進一步揭示其抗旱分子調(diào)控機制奠定了基礎。

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(責任編輯：張 研)

Cloning ofCiDR1 fromCaraganaintermediaand Its Expression under Drought Stress

WUBi-fei1，LIWan-feng2，XUHai-yan2，ZHANGLi-feng2，QILi-wang2，HANSu-ying1

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

[Objective]To study the function ofCiDR1 gene inCaraganaintermediaand its response to drought stress.[Method]The full-length cDNA sequence of CiDR1 gene was cloned using RACE methods, and then the bioinformatics analysis were carried out to predict gene structure. Finally,CiDR1 expression patterns under drought stress was investigated by qRT-PCR. [Result]The full-length cDNA sequence ofCiDR1 gene was 4 297 bp. The deduced amino-acid sequence forCiDR1 was 1 243 amino acids long and contained toll/interluekin receptor (TIR), nucleotide binding site (NBS) and leucine-rich repeats (LRR) motif, which are the characteristics of plant resistance genes. The theoretical isoelectric point and instability index ofCiDR1 protein was 6.35 and 42.91, respectively. Further analysis showed thatCiDR1 protein had no signal peptide, was a non-secretary protein and located in the cytoplasmic matrix. The qPCR analysis showed that theCiDR1 transcripts were expressed strongly in adult leaves and weakly in juvenile stems, and after drought treatments the levels ofCiDR1 transcripts decreased. [Conclusion]The results indicate thatCiDR1 might play an role in response ofC.intermediatodrought and could be used for molecular breeding.

Caraganaintermedia;CiDR1; TIR-NBS-LRR; drought

2014-12-30

2016-12-22 基金項目： 國家高技術研究發(fā)展計劃(863)項目(2013AA102704)、國家自然科學基金(31330017)。 作者簡介： 武苾菲，女，碩士研究生。主要研究方向：林木遺傳育種。電話：18810750915，E-mail：wufaye_1229@163.com * 通訊作者：韓素英，教授，碩士生導師。主要研究方向：樹木生物技術。E-mail：syhan@caf.ac.cn

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.008

S718.46

A

1001-1498(2017)02-0238-07