肉桂酸對蠶豆枯萎病發(fā)生的影響及間作緩解機制*

董 艷董 坤楊智仙朱錦惠湯 利鄭 毅，4?

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

（2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，昆明 650201）

（3 云南大學(xué)圖書館，昆明 650091）

（4 西南林業(yè)大學(xué)國家高原濕地中心，昆明 650224）

肉桂酸對蠶豆枯萎病發(fā)生的影響及間作緩解機制*

董 艷1董 坤2楊智仙3朱錦惠1湯 利1鄭 毅1，4?

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201）

（2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，昆明 650201）

（3 云南大學(xué)圖書館，昆明 650091）

（4 西南林業(yè)大學(xué)國家高原濕地中心，昆明 650224）

采用盆栽試驗，研究了肉桂酸不同濃度（C0（0.0 mg kg-1）、C1（14.0 mg kg-1）、C2（28.0 mg kg-1）和C3（56.0 mg kg-1））處理對蠶豆枯萎病發(fā)生的影響及小麥與蠶豆間作對肉桂酸自毒效應(yīng)的緩解機制。結(jié)果表明：（1）蠶豆單作條件下，肉桂酸處理顯著降低了根系的過氧化物酶（POD）活性并增加了丙二醛（MDA）含量，導(dǎo)致根系脂質(zhì)過氧化傷害加?。蝗夤鹚崽幚斫档土烁H微生物的活性（AWCD值）、香農(nóng)（Shannon）多樣性指數(shù)（H）和豐富度指數(shù)（S）并改變了微生物群落結(jié)構(gòu)；肉桂酸處理顯著增加蠶豆根際土壤中鐮刀菌數(shù)量，提高了枯萎病病情指數(shù)并降低根系干重。（2）肉桂酸脅迫下，與單作蠶豆相比，小麥與蠶豆間作提高了蠶豆根系的POD活性，降低了MDA含量，提高了根際微生物對碳源的利用能力及根際微生物的H和S，明顯改變了根際微生物群落結(jié)構(gòu)；間作顯著降低了蠶豆根際土壤中鐮刀菌數(shù)量及枯萎病病情指數(shù)，顯著增加了蠶豆地上部干重和根系干重。表明小麥與蠶豆間作一方面提高蠶豆對枯萎病菌的生理抗性，另一方面有效調(diào)節(jié)根際微生物活性和多樣性，從而緩解了肉桂酸引起的枯萎病危害，促進了蠶豆生長，但間作減輕枯萎病危害的效果受肉桂酸處理濃度的影響。因此，利用非寄主作物小麥的化感效應(yīng)而采取的間作模式是緩解蠶豆自毒效應(yīng)的有效措施。

肉桂酸；蠶豆枯萎病；間作；微生物代謝功能多樣性；抗氧化酶活性

連作障礙是長期以來困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的復(fù)雜問題，作物連作障礙形成機理一直是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點［1-2］。連作土壤中酚酸類物質(zhì)的累積是導(dǎo)致多種作物連作障礙發(fā)生的重要原因，目前研究者已從多種作物根系分泌物和連作土壤中檢測出肉桂酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸等多種酚酸物質(zhì)［3-4］，其中肉桂酸是西瓜、黃瓜等作物連作土壤中常見的一種酚酸物質(zhì)［1，5］，且在黃瓜連作障礙中已經(jīng)證明肉桂酸能顯著促進黃瓜枯萎病的發(fā)生［6］。長期連作條件下，土壤中積累了大量的植物分泌物和腐解物，其釋放的酚酸不斷累積，極大地控制著土壤中優(yōu)勢微生物種群［1］。連作花生根系分泌物改變了花生根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，致使病原真菌富集，微生物群落結(jié)構(gòu)惡化，使得土壤中的酚酸物質(zhì)降解緩慢，造成酚酸物質(zhì)積累，積累的酚酸不僅繼續(xù)改變微生物群落結(jié)構(gòu)，而且會抑制花生生長，提高花生發(fā)病率，如此惡性循環(huán)，產(chǎn)生花生連作障礙［7-8］。

蠶豆是典型的忌連作作物，近年來隨著蠶豆生產(chǎn)的不斷發(fā)展，主產(chǎn)區(qū)的連作障礙現(xiàn)象非常普遍且日益嚴(yán)重，造成蠶豆生長矮小、瘦弱、病害加重、結(jié)莢少、產(chǎn)量低，連作障礙已成為制約全球蠶豆可持續(xù)發(fā)展的重要因子［9］?？菸∈切Q豆連作障礙中最主要的病害之一，該病在德國、日本和英國等均有報道，在中國蠶豆主產(chǎn)區(qū)發(fā)病非常普遍，云南是枯萎病發(fā)生最重的省份［10］。本課題組在前期研究中從蠶豆連作土壤中檢測到肉桂酸，且其在連作土壤中含量最高［11］，但肉桂酸是否是誘導(dǎo)蠶豆連作障礙發(fā)生的自毒物質(zhì)尚不清楚。

間作是利用種間互作控制病蟲害發(fā)生、提高糧食產(chǎn)量的傳統(tǒng)農(nóng)作措施。近年來研究者相繼在旱作水稻與西瓜間作［5］、小麥與黃瓜間作［12］及大蒜與十字花科蔬菜［13］等體系發(fā)現(xiàn)間作緩解了作物連作障礙，并從間作系統(tǒng)中根際養(yǎng)分和微生物變化［13-14］、田間微氣候改變［15］、病原菌的物理阻隔［16］以及非寄主間作作物根系分泌物中糖和氨基酸的變化［5］等方面開展了一些研究并取得了顯著進展。最近，Dai等［17］在中藥材茅蒼術(shù)與花生間作系統(tǒng)的研究表明，間作緩解了花生連作障礙，原因是間作顯著降低了花生根際土壤中對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量，且茅蒼術(shù)與花生間作時距離越近，降低花生根際酚酸含量的效果越好。小麥與蠶豆間作是云南乃至西南地區(qū)重要的間作種植模式，其具有顯著的增產(chǎn)和控病優(yōu)勢，是農(nóng)民增產(chǎn)增收的重要手段之一［11，14］。本課題組的前期研究表明，小麥與蠶豆間作改變了蠶豆根際土壤中酚酸的累積［18］，減輕了枯萎病的發(fā)生，提高了產(chǎn)量［14］，但有關(guān)肉桂酸脅迫下間作對蠶豆枯萎病發(fā)生的影響尚未見報道。本試驗通過肉桂酸外源添加處理，研究其對蠶豆根系抗氧化酶活性、膜質(zhì)過氧化、根際土壤微生物代謝功能多樣性及病原菌生長的影響，從土壤微生物多樣性和蠶豆生理抗性角度探討肉桂酸促進蠶豆枯萎病發(fā)生的機制及間作減輕蠶豆枯萎病的機理。同時也為應(yīng)用生物多樣性持續(xù)控制作物病害、提高產(chǎn)量及實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蠶豆品種為89-147（Vicia faba L. cv. 89-147），小麥品種為云麥53（Triticum aestivum L. cv. Yunmai 53），均購于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院糧食作物研究所。

供試土壤采自云南省安寧市祿脿鎮(zhèn)上村。土壤為水稻土（水耕人為土），有機質(zhì)含量23.2 g kg-1，全氮1.90 g kg-1，堿解氮119.0 mg kg-1，有效磷56.5 mg kg-1，速效鉀123.4 mg kg-1，pH 6.4。

尖孢鐮刀菌菌種為尖孢鐮刀菌蠶豆?；虵usarium oxysporum f. fabae（FOF），由本實驗室篩選和保存，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上培養(yǎng)。

1.2 盆栽試驗

盆栽試驗于2014年10月至2015年2月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進行。

試驗為雙因素設(shè)計，設(shè)2種種植模式（蠶豆單作、蠶豆與小麥間作）和肉桂酸4濃度處理（C0 （0.0 mg kg-1）、C1（14.0 mg kg-1）、C2（28.0 mg kg-1）和C3（56.0 mg kg-1）），組合為8個處理。每個處理均接種尖孢鐮刀菌，分別為：單作接種鐮刀菌不加肉桂酸，MFC0；間作接種鐮刀菌不加肉桂酸，IFC0；單作接種鐮刀菌+14.0 mg kg-1的肉桂酸，MFC1；間作接種鐮刀菌+14.0 mg kg-1的肉桂酸，IFC1；單作接種鐮刀菌+28.0 mg kg-1的肉桂酸，MFC2；間作接種鐮刀菌+28.0 mg kg-1的肉桂酸，IFC2；單作接種鐮刀菌+56.0 mg kg-1的肉桂酸，MFC3；間作接種鐮刀菌+56.0 mg kg-1的肉桂酸，IFC3；每個處理3次重復(fù)，共計24盆。

從大田中采集蠶豆非連作土壤（即水稻土（水耕人為土）），去除雜質(zhì)，過篩。每盆裝入2.0 kg土壤，裝盆之前先與肥料混和均勻。所施肥料為尿素、普鈣和硫酸鉀，各處理氮磷鉀肥用量相同（N∶100 mg kg-1；P2O5∶100 mg kg-1；K2O∶100 mg kg-1）。將蠶豆和小麥種子消毒催芽后播種于盆缽中，單作條件下每盆播種蠶豆6株，間作條件下每盆播種蠶豆3株，小麥6株。待蠶豆幼苗生長至8 cm高時，向單作蠶豆和間作蠶豆的盆缽中澆灌不同濃度（0.0、50、100和200 mg L-1）的肉桂酸溶液，每盆每次澆灌80 ml溶液，每3 d澆灌1次，共計7次（相當(dāng)于盆栽土壤中肉桂酸含量分別為0.0、14.0、28.0、56.0 mg kg-1）。待蠶豆長至12 cm高時，接種鐮刀菌。設(shè)只接種鐮刀菌而不加酚酸處理為對照（C0），接菌后進行正常管理。

接種尖孢鐮刀菌30 d后采樣，倒扣盆缽，小心取出小麥和蠶豆植株，抖掉與根系松散結(jié)合的土壤后，將與根系緊密結(jié)合的土壤用軟刷子刷下來作為根際土壤樣品，用于測定鐮刀菌數(shù)量和微生物代謝功能多樣性。

1.3 蠶豆枯萎病調(diào)查

蠶豆枯萎病發(fā)病程度分為5級：“0級”：莖基部及根無病斑，表觀無癥狀；“1級”：莖基部或根的局部（除主根外）稍顯病斑或稍變色；“2級”：莖基部或主側(cè)根有病斑，但不連片；“3級”：1/3～1/2的莖基部或根部出現(xiàn)病斑、變色或腐爛，側(cè)根明顯減少；“4級”：莖基部被病斑環(huán)繞或根系大部分變色腐爛；“5級”：植株枯萎死亡。調(diào)查完成后計算病情指數(shù)。

病情指數(shù)= Σ（各級病株數(shù)×相應(yīng)級值）/（最高級值×調(diào)查總株數(shù)）×100

1.4 根際鐮刀菌數(shù)量測定

鐮刀菌數(shù)量測定采用稀釋平板法進行，所用培養(yǎng)基為尖孢鐮刀菌的選擇性培養(yǎng)基。具體配方為：KH2PO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)e-Na-EDTA 0.01 g，L-天門冬氨酸2.0 g，D-半乳糖20.0 g，蒸餾水1 000 ml（121℃滅菌20 min）。滅菌后加入：二硝基苯（75%WP）1.0 g，牛膽汁0.5 g，Na2B4O7·10H2O 1.0 g，硫酸鏈霉素0.3 g（培養(yǎng)基用10%磷酸調(diào)節(jié)pH至3.8 ± 0.2）。每平板涂布0.1 ml孢子懸液，28℃培養(yǎng)3 d后記錄平板菌落數(shù)，每處理重復(fù)3次。

1.5 抗氧化酶活性和膜質(zhì)過氧化程度測定

蠶豆根系過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量測定參照李合生［19］的方法。

1.6 微生物代謝功能多樣性測定

土壤微生物代謝功能多樣性采用Biolog ECO板（ECO MicroPlate，美國）進行測定。稱取10.0 g土壤加入90 ml無菌的0.85%的NaC1溶液中，在搖床上振蕩30 min，將土壤樣品稀釋至10-3，吸取150 μl稀釋液至ECO板的微孔中，接種好的板置于25℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h在Biolog EmaxTM自動讀盤機上用Biolog Reader 4.2軟件（Biolog，Hayward，CA，美國）讀取590 nm波長的光密度值，培養(yǎng)時間為168 h。以31個孔的平均光密度值（AWCD）作為整體活性的有效指標(biāo)之一。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)計算香農(nóng)（Shannon） 多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（S），進行微生物碳源利用分析及主成分（PCA）分析。

式中，Ci為各反應(yīng)孔在590 nm下的光密度值；R為ECO板對照孔的光密度值；Ci-R小于0的孔在計算中均記為零，即Ci-R的值均大于或等于0。

Shannon多樣性指數(shù)（H）

式中，Pi=（Ci-R）/Σ（Ci-R）。

群落豐富度指數(shù)（S）用碳源代謝孔的數(shù)目表示。

微生物碳源利用強度：Biolog ECO板中有31種碳源，可將31種碳源按功能團的不同分為六類：糖類10種、氨基酸類6種、羧酸類7種、聚合物4種、酚酸類2種以及胺類2種［14］。首先對六類碳源的C-R值分別進行求和，即可得到六類碳源的利用強度；對31種碳源的C-R值進行求和，即可得到碳源總利用強度。

采用Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理，采用SAS 9.0軟件進行方差分析、主成分分析和相關(guān)分析，方差分析為單因素方差分析，最小顯著差異法（LSD）檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 肉桂酸對蠶豆生長的影響及間作效應(yīng)

單作條件下，與不添加肉桂酸的對照（C0）相比，肉桂酸C3處理時，蠶豆幼苗地上部干重較對照降低40.2%（p＜0.05）。蠶豆幼苗根系對肉桂酸處理較地上部敏感，肉桂酸C2和C3處理蠶豆根系干重較對照分別降低31.7%和54.1%（p ＜0.05），表明肉桂酸處理抑制了蠶豆幼苗生長，尤其對根系的抑制效應(yīng)更為明顯（圖1）。

肉桂酸C0、 C1、 C2和C3濃度脅迫下，與單作蠶豆相比，間作使地上部干重分別增加32.5%、11.3%、23.6%和21.3%；使根系干重分別增加52.9%、72.9%、115.5%和154.9%，以上差異均達顯著水平（p＜0.05）。表明間作顯著改善了蠶豆生長，緩解了肉桂酸對蠶豆生長的抑制效應(yīng)（圖1）。

2.2 肉桂酸對蠶豆枯萎病發(fā)生的影響及間作效應(yīng)

單作條件下，與C0處理相比，肉桂酸C1處理對蠶豆枯萎病病情指數(shù)無顯著影響，但C2和C3處理使枯萎病病情指數(shù)分別提高110.0%和180.0% （p＜0.05），使蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量分別增加40.4%和108.1%（p＜0.05）。表明肉桂酸能顯著提高蠶豆枯萎病的發(fā)病嚴(yán)重程度，同時病情指數(shù)隨肉桂酸處理濃度增加而顯著提高（圖2）。

圖1 肉桂酸脅迫下間作對蠶豆生長的影響Fig. 1 Effects of intercropping of wheat with faba bean on growth of faba bean under cinnamic acid stress

與單作相比，肉桂酸不同濃度處理下小麥與蠶豆間作均顯著降低了蠶豆枯萎病的病情指數(shù)和根際鐮刀菌數(shù)量。肉桂酸C0、C1、C2和C3處理下，與單作蠶豆相比，間作使蠶豆枯萎病病情指數(shù)分別降低50.5%、41.1%、42.9%和51.8% （p＜0.05），使蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量分別降低24.2%、16.7%、11.5%和20.2%（p＜0.05），表明間作能緩解由肉桂酸促進的蠶豆枯萎病的危害（圖2）。

圖2 肉桂酸脅迫下間作對蠶豆枯萎病病情指數(shù)和鐮刀菌數(shù)量的影響Fig. 2 Effects of intercropping of wheat with faba bean on faba bean Fusarium wilt index and number of Fusarium oxysporum in soil under cinnamic acid stress

2.3 肉桂酸對蠶豆根系抗氧化酶和膜質(zhì)過氧化的影響及間作效應(yīng)

單作條件下，與C0處理相比，肉桂酸C1、C2 和 C3濃度處理下，蠶豆根系的POD活性分別降低19.0%、53.5%和61.5%（p＜0.05），CAT活性與對照相比無顯著差異（圖3）。肉桂酸C1、 C2和C3處理下間作蠶豆根系的POD活性分別較單作提高22.4%、81.0%和100.0%（p＜0.05），表明隨肉桂酸處理濃度提高，間作對蠶豆根系POD活性的促進效應(yīng)更大。肉桂酸各濃度處理下，間作均有提高蠶豆根系CAT活性的趨勢，但單間作處理間CAT活性均無顯著差異（圖3）。

單作條件下，肉桂酸C1處理顯著提高了蠶豆根系的MDA含量，且隨肉桂酸處理濃度提高，MDA含量顯著增加。與C0相比，肉桂酸C1、C2 和C3處理使蠶豆根系MDA含量分別提高45.1%、92.4%和145.1%（p＜0.05）（圖3）。與單作相比，肉桂酸C1、C2和C3濃度脅迫下，間作使蠶豆根系的MDA含量分別降低54.0%、62.7%和67.6% （p＜0.05），表明小麥與蠶豆間作降低了蠶豆根系的膜質(zhì)過氧化程度，提高了根系細胞膜的穩(wěn)定性（圖3）。

圖3 肉桂酸脅迫下間作對蠶豆根系過氧化物酶、過氧化氫酶活性和丙二醛含量的影響Fig. 3 Effects of intercropping of wheat with faba bean on peroxidase（POD）and catalase（CAT）activities and malondialdehyde （MDA）content in faba bean roots under cinnamic acid stress

2.4 肉桂酸對蠶豆根際微生物活性（AWCD）的影響及間作效應(yīng)

從圖4可看出，隨肉桂酸處理濃度增加，蠶豆根際微生物的活性（AWCD值）明顯降低，表現(xiàn)為MFC0＞MFC1＞MFC2＞MFC3的趨勢，表明肉桂酸處理降低了蠶豆根際微生物的活性。培養(yǎng)96 h時，肉桂酸C0、C1、C2和C3濃度處理下，間作分別提高蠶豆微生物活性144.3%、44.4%、156.7%和75.3%。

2.5 肉桂酸對蠶豆根際微生物碳源利用強度的影響及間作效應(yīng)

間作對蠶豆根際微生物的碳源利用強度有顯著影響（p＜0.05）。但肉桂酸不同濃度處理條件下間作效應(yīng)不同，肉桂酸C0、C1和C2處理下，間作使蠶豆根際微生物對碳源的利用較單作分別提高了185.9%、110.5%和83.9%（p＜0.05），C3處理下，間作蠶豆根際微生物對碳源的總利用強度與單作相比無顯著差異（圖5A）。

圖4 肉桂酸脅迫下間作對蠶豆根際微生物平均顏色變化率的影響Fig. 4 Effects of intercropping of wheat with faba bean on AWCD in the rhizosphere soil of faba bean under cinnamic acid stress

從間作蠶豆根際微生物對Biolog ECO板中六類碳源的利用來看，肉桂酸C0、C1和C2處理下，與單作相比，間作使蠶豆根際微生物對糖（CH）類碳源的利用強度分別提高405.3%、309.6%和32.0%；對氨基酸（AA）類碳源的利用強度分別提高216.5%、52.7%和214.2%；對羧酸（CA）類碳源的利用強度分別提高206.2%、57.0%和43.2%，以C0濃度下間作對碳源利用的提高幅度最大。但C3處理下，間作蠶豆根際微生物對CH、AA和CA碳源的利用均無明顯影響（圖5B）。

圖5 肉桂酸脅迫下間作蠶豆根際微生物對碳源的利用強度Fig. 5 Carbon source utilization intensity of soil microbes in intercropped faba bean rhizosphere under cinnamic acid stress

2.6 肉桂酸對蠶豆根際微生物功能多樣性指數(shù)的影響及間作效應(yīng)

從表1可看出，單作條件下，肉桂酸處理降低了蠶豆根際微生物的Shannon多樣性指數(shù)（H）和豐富度指數(shù)（S）。肉桂酸C2和C3處理時，蠶豆根際微生物的H較對照降低了5.1%和13.3% （p＜0.05），S較對照降低了21.3%和36.2%（p ＜0.05）。肉桂酸不同濃度處理下間作較單作H提高2.7%～7.9%（p＜0.05），S提高17.1%～27.0%（表1）。

2.7 肉桂酸和間作對蠶豆根際微生物群落碳源利用的主成分分析

從圖6可看出，蠶豆單作條件下，C1、C2與C0在第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）上均無明顯分離，表明肉桂酸C1和C2處理對蠶豆微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著影響；而C3與C0、C1和C2在PC2上有一定的分離，表明C3濃度肉桂酸處理改變了根際微生物群落結(jié)構(gòu)。

肉桂酸脅迫下，與單作相比，間作對蠶豆根際微生物具有重要的影響，但間作效果受肉桂酸處理濃度的調(diào)控。肉桂酸C1和C2處理下，間作蠶豆和單作蠶豆根際微生物群落在PC1上有較好的分離，表明肉桂酸脅迫下間作明顯改變了蠶豆根際微生物的群落結(jié)構(gòu)；當(dāng)肉桂酸添加量達到C3濃度時，單間作蠶豆根際微生物在PC1和PC2上均無明顯分離，表明高濃度肉桂酸處理下，間作對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響變?。▓D6）。

為了找到對PC1和PC2影響較大的碳源種類，進一步利用PC1和PC2得分系數(shù)與31種碳源的吸光度值進行主成分相關(guān)分析得到相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)絕對值越大，表示該碳源對主成分的影響越大。從表2可看出，與PC1有較高相關(guān)性的碳源有8個（相關(guān)系數(shù)︱r︱＞0.6），主要包括糖類（2個） 、氨基酸類（3個）、羧酸類（1個）、聚合物類（1個）和胺類（1個）；其中達到顯著差異的碳源分別是糖類中的D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、氨基酸類碳源中的L-精氨酸和L-絲氨酸、聚合物碳源中的聚山梨醇酯40及胺類碳源中的腐胺。而與PC2具有較高相關(guān)性的碳源有5個，主要包括糖類（4個）和聚合物（1個）。以上分析表明，在PC1和PC2上相關(guān)性較高的碳源主要是糖類和氨基酸類碳源，這兩類碳源是區(qū)分肉桂酸脅迫下單間作處理間差異的敏感碳源。

表1 肉桂酸脅迫下間作對蠶豆根際微生物多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的影響Table 1 Effects of intercropping on microbial diversity index and richness index in the rhizosphere soil of faba bean under cinnamic acid stress

圖6 肉桂酸脅迫下單間作蠶豆根際微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig. 6 Principal component analysis（PCA）of community structure of the soil microbes in the rhizosphere soil of monocropped and intercropped faba beans under cinnamic acid stress

肉桂酸不同濃度處理下蠶豆單間作處理間根際微生物群落功能多樣性的改變主要是由微生物利用糖類碳源（D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、D-木糖）、氨基酸類碳源（L-精氨酸、L-絲氨酸和L-蘇氨酸）、羧酸類碳源（D-半乳糖醛酸）、聚合物碳源（聚山梨醇酯40）和胺類碳源（腐胺）的差異引起的（表2和圖6）。

3 討 論

3. 1 肉桂酸對蠶豆枯萎病發(fā)生的助長效應(yīng)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，許多作物連作種植均導(dǎo)致土傳病害嚴(yán)重發(fā)生，致使作物產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣［1，8，10］。土傳病害一直是連作障礙的研究重點，多年來被認為是大多數(shù)作物產(chǎn)生連作障礙的主要原因之一［20-21］。近年來的研究結(jié)果表明，凡容易引起自毒作用的作物一般也易引起土傳病害產(chǎn)生而導(dǎo)致連作障礙，即化感自毒物質(zhì)對土傳病害發(fā)生具有重要影響［22］。自毒物質(zhì)對羥基苯甲酸脅迫下，尖孢鐮刀菌對草莓根系的感染率顯著提高，枯萎病發(fā)生明顯加重［23］。萵苣根系的滲出液可抑制萵苣種子發(fā)芽和幼苗生長，并可增強鐮刀菌枯萎病菌的感染能力，二者的共同作用導(dǎo)致萵苣生長緩慢［24］。本研究結(jié)果表明，與不添加肉桂酸的對照（C0）處

理相比，肉桂酸中、高濃度處理分別使根際鐮刀菌數(shù)量增加40.4%和108.1%（p＜0.05），蠶豆枯萎病病情指數(shù)提高110.0%和180.0%（p＜0.05）（圖2），幼苗地上部和根系干重均低于對照（圖1），證實了肉桂酸能促進土傳病害發(fā)生而抑制蠶豆生長，加劇蠶豆連作障礙。

表2 31 種碳源與PC1、PC2 的相關(guān)系數(shù)（r＞0.6或r＜-0.6）Table 2 Pearson’s correlation coefficients of 31 types of carbon sources with PC1 and PC2（r＞0.6 or r＜- 0.6）

自毒物質(zhì)助長土傳病害發(fā)生的原因，一方面是化感自毒物質(zhì)通過改變根際微生物區(qū)系組成等間接影響病原微生物生長繁殖［25-26］。自毒物質(zhì)酚酸是土壤微生物群落演變的重要推動者，酚酸物質(zhì)在土壤中表現(xiàn)出的化感作用是通過改變土壤微生物群落變化而實現(xiàn)的［7］。隨著對根際微生態(tài)環(huán)境中植物―土壤―微生物相互作用各過程的深入了解，研究者認為土傳病害的發(fā)生和植株發(fā)育不良是作物連作障礙的直觀表象，但其致病的根本原因是作物根系分泌物和腐解物中酚酸類化感物質(zhì)引起的根際微生物區(qū)系失衡和多樣性下降，最終導(dǎo)致土壤中病原菌激增而引發(fā)嚴(yán)重的土傳病害［1，4，25］。Zhou和Wu［27］通過外源添加黃瓜連作自毒物質(zhì)——香豆酸至土壤中，發(fā)現(xiàn)香豆酸對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，導(dǎo)致厚壁菌門和β變形菌門等細菌大量增加，而使擬桿菌門、δ變形菌門和浮霉菌門等細菌顯著減少，同時還造成土壤中病原菌大量繁殖增長。土壤外源添加3 μg kg-1的苯甲酸或8 μg kg-1的3-苯丙酸時，土壤微生物功能多樣性顯著下降，病原菌對苯甲酸和3-苯丙酸的利用優(yōu)于拮抗菌，這是煙草長期連作引起青枯病暴發(fā)流行的機理之一［28］。本研究結(jié)果表明，與不添加肉桂酸的對照相比，隨肉桂酸處理濃度增加，蠶豆根際微生物活性、Shannon多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均顯著下降（圖4和表1），微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化（圖6），表明肉桂酸降低蠶豆根際微生物活性和多樣性從而降低其對根際能源和碳源的利用（圖5）；對病原菌而言可用的碳源較多而大量增殖（圖2），最終促進鐮刀菌的生長而加劇枯萎病的發(fā)生。表明，連作自毒物質(zhì)是連作障礙產(chǎn)生的初始誘因，其通過改變根際微生物活性、多樣性和群落結(jié)構(gòu)而在連作障礙形成中發(fā)揮重要作用。

自毒物質(zhì)助長土傳病害發(fā)生的另一方面原因是，隨著土壤中自毒物質(zhì)的逐漸積累，達到一定量時就會對該作物產(chǎn)生自毒作用。POD和CAT等被認為是清除活性氧過程中最主要的抗氧化酶類，可幫助植物維持體內(nèi)活性氧代謝平衡，增強抗性，因此CAT和POD活性可作為植物抗病的生理指標(biāo)［29］。酚酸外源添加后，花生幼苗的細胞膜受到損傷，細胞內(nèi)活性氧自由基增加，導(dǎo)致MDA含量增加，使連作土壤中的土傳病原菌更容易入侵，造成花生發(fā)病率增加［8］。本研究中，與對照相比，肉桂酸處理下蠶豆根系的POD活性降低19.0%～61.5% （p＜0.05），MDA含量提高45.1%～145.1%（p ＜0.05）（圖3），表明肉桂酸處理降低了蠶豆根系的生理抗性并加速膜脂過氧化，不僅造成營養(yǎng)元素的泄漏，同時也刺激了病原菌，使其更易侵入蠶豆而促進枯萎病發(fā)生。本研究結(jié)果與下述結(jié)論相同：連作土壤上栽培的西瓜，由于受到土壤中尖孢鐮刀菌等病原菌的侵害，膜系統(tǒng)的氧自由基升高，導(dǎo)致西瓜體內(nèi)MDA含量上升，西瓜啟動CAT和POD以抑制病原菌的破壞，保護自身生長和代謝［29］。

3.2 小麥與蠶豆間作對肉桂酸助長效應(yīng)的緩解效果及機理

利用植物化感作用而采用的間作模式，是以植物為藥源取代化學(xué)殺菌劑，去弊存利的植物保護措施，是解除連作障礙的有效手段［15，17，29］。小麥、毛苕子和三葉草分別與黃瓜間作均降低了黃瓜根際尖孢鐮刀菌數(shù)量，降低了黃瓜枯萎病的病情指數(shù)并提高黃瓜產(chǎn)量［12］。西瓜與旱作水稻間作有效減輕了西瓜枯萎病的危害，改善了西瓜連作障礙［29］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂酸脅迫下，小麥與蠶豆間作顯著降低了蠶豆枯萎病的病情指數(shù)，表明小麥與蠶豆間作緩解了肉桂酸引起的蠶豆枯萎病危害。在菇菜套作體系也同樣觀察到套作可抑制某些病原菌（如稻黑孢菌、尖孢鐮刀菌等）而降低了番茄土傳病害的發(fā)病率［30］。

Bais等［31］的研究表明，根際微生物數(shù)量的富集和種群特征的顯現(xiàn)是由根系分泌物啟動和調(diào)節(jié)的，因此，間作改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)與間作系統(tǒng)根系分泌物密切相關(guān)。Biolog ECO微平板中的碳源利用了許多與生態(tài)有關(guān)的化合物，31種碳源中至少有9種是植物根系分泌物的組分，如精氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、蘋果酸、2-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲酸等，這在一定程度能夠模擬根際微生物對根系分泌物的利用情況［32］。因此，深入分析根際微生物對Biolog ECO板中碳源利用情況對理解間作控制土傳病害有重要意義。通過分析根際微生物對單一碳源的相對利用率及六類碳源的利用強度，發(fā)現(xiàn)肉桂酸脅迫下間作蠶豆根際微生物活性及根際微生物對碳源的總利用強度顯著高于單作（圖4和圖5），表明肉桂酸脅迫下小麥與蠶豆間作系統(tǒng)根際微生物能夠利用多種碳源且具有較高的利用效率（圖5），可對根際能源和碳源進行迅速消耗而旺盛生長，與根際尖孢鐮刀菌進行“營養(yǎng)競爭”，使鐮刀菌因為可用碳源較少而不能大量增殖；尤其是糖類和氨基酸類碳源是區(qū)分蠶豆單間作處理間根際微生物群落結(jié)構(gòu)差異的敏感碳源（表2），表明肉桂酸脅迫下間作對枯萎病的控制與糖類和氨基酸類碳源的利用密切相關(guān)，原因是作物根系分泌物中糖和氨基酸類物質(zhì)對尖孢鐮刀菌生長具有顯著的促進作用，如西瓜根系分泌物中高糖和游離氨基酸供給可為其致病菌提供豐富的營養(yǎng)，利于其增殖而促進枯萎病發(fā)生［33］。綜上，肉桂酸脅迫下小麥與蠶豆間作極大促進了以利用糖類和氨基酸為碳源的微生物繁殖而對其大量消耗，最終減輕糖和氨基酸對尖孢鐮刀菌的刺激而減輕枯萎病發(fā)生。

除“營養(yǎng)競爭”外，根際酚酸的降解也是間作緩解連作障礙的重要原因。前期研究中發(fā)現(xiàn)間作蠶豆根際酚酸含量顯著低于單作蠶豆［18］。本研究中，肉桂酸脅迫下間作蠶豆根際微生物活性高于單作，間作系統(tǒng)較高的微生物活性可能對連作蠶豆根際累積的肉桂酸具有降解效果，反映了間作系統(tǒng)較高的微生物活性在連作障礙緩解中發(fā)揮著重要的作用。間作系統(tǒng)較高的微生物活性形成原因是，間作系統(tǒng)中不同作物會產(chǎn)生不同的特異根系分泌物，并形成與之相適應(yīng)的根際微生物群落，同時間作作物根系相互交錯，產(chǎn)生了豐富多樣的根際分泌物，從而提高土壤微生物的整體代謝活性，促進土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣化的形成［34］，但小麥與蠶豆間作究竟提高了哪些微生物的活性而緩解蠶豆連作障礙還需進一步研究。

菇菜套作不僅影響土壤微生物活性，對其群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了影響，真菌群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大差異而抑制了土壤中尖孢鐮刀菌和稻黑孢菌的生長，降低了土傳病害發(fā)病率而維系土壤健康，進而顯著提高番茄地上和地下生物量［30］。本研究中，小麥與蠶豆間作明顯改變了蠶豆根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)并降低了蠶豆根際尖孢鐮刀菌數(shù)量（圖6和圖2），緩解了連作障礙而促進蠶豆生長（圖1）。但肉桂酸高濃度處理下單間作處理間微生物群落結(jié)構(gòu)的變化相對較小，表明間作對連作障礙的緩解效果受自毒物質(zhì)濃度的影響，自毒物質(zhì)濃度較高時，間作緩解連作障礙的效果不明顯。本研究中小麥與蠶豆間作顯著提高了蠶豆根際微生物的H和S，降低了蠶豆枯萎病的危害，該研究結(jié)果與微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富、多樣性越高時對抗病原菌的綜合能力就越強［35］的結(jié)論相同。因此，間作調(diào)控作物根際微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)是減輕土傳病害的關(guān)鍵。

從蠶豆生理抗性角度來看，小麥與蠶豆間作有效緩解了蠶豆植株所受到的連作脅迫程度，表現(xiàn)為蠶豆根系的CAT和POD活性顯著高于單作，說明間作引起蠶豆根系內(nèi)抗氧化酶類活性升高，同時顯著降低根系的MDA含量，表明間作從生理上提高了蠶豆自身的抗性。

4 結(jié) 論

肉桂酸在根際土壤的累積加劇了土傳枯萎病的發(fā)生并抑制了蠶豆生長，而肉桂酸脅迫下小麥與蠶豆間作可提高蠶豆根際微生物的活性和碳源的利用強度，改變根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，改善連作蠶豆的根際微生態(tài)環(huán)境而抑制尖孢鐮刀菌的增殖。同時，間作還提高蠶豆根系的防御酶活性并降低膜脂過氧化程度，提高蠶豆植株抗性而減輕枯萎病的發(fā)生與危害，緩解蠶豆連作障礙，促進蠶豆生長。本研究結(jié)果可為選擇合理間作模式以持續(xù)控制病害、提高作物產(chǎn)量、減少農(nóng)藥施用、實現(xiàn)土壤健康和環(huán)境友好的可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)理論依據(jù)。

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Effect of Cinnamic Acid on Incidence of Faba Bean Fusarium Wilt and Incidence-Mitigating Mechanisms of Wheat and Faba Bean Intercropping

DONG Yan1DONG Kun2YANG Zhixian3ZHU Jinhui1TANG Li1ZHENG Yi1，4?
（1 College of Resources and Environment，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）
（2 College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）
（3 The Library of Yunnan University，Kunming 650091，China）
（4 The National Center for Plateau Wetland of Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

【Objective】The aim of this work is to investigate 1）whether the amendment of cinnamic acid could mitigate the incidence of Fusarium wilt and 2）how wheat and faba bean intercropping alleviates cinnamic acid autotoxicity. 【Method】A pot experiment was conducted on wheat and faba bean intercropping and amendment of cinnamic acid at a varying rate（C0（0.0 mg kg-1），C1（14.0 mg kg-1），C2（28.0 mg kg-1） and C3（56.0 mg kg-1））. 【Result】1）In comparison with Treatment C0，amendment of cinnamic acid decreased the activity of peroxidase（POD），but significantly increased the content of malondialdehyde （MDA），thus leading to disorder of metabolic and physiological functions and aggravation of the damage of membrane lipid by peroxidation in the treatments under monocropping of faba bean．2）The amendment of cinn-acid amic decreased the average well color development（AWCD），Shannon-Wiener diversity index （H）and substrate richness（S），thus altering soil microbe community structure in faba bean rhizosphere，by increasing the number of Fusarium oxysporum；and increasing the incidence index of faba bean Fusarium wilt. As a result，dry weight of the root system of monocropped faba bean decreased. 3）Among the treatments amended with cinnamic acid at the rate of C1，C2 and C3，the treatments of mtercropped faba bean，were 22.4%，81.0% and 100.0% higher in POD activity of faba bean，and 45.1%，92.4% and 145.1% lower in MDA content than their corresponding ones of monocropped faba bean. 4）Treatments C1 and C2 of intercropped faba bean were 110.5% and 83.9% higher in total carbon utilization ability than their corresponding ones of monocropped faba bean，especially in utilization of carbohydrates，amino acids，and carboxylic acids. Besides，they were also much higher in Shannon-Wiener diversity index and substrate richness，had soil microbe community structure in the rhizosphere significantly changed by decreasing the population of Fusarium oxysporum in the faba bean rhizosphere by 16.7%～20.2% and 41.1%～51.8%，and increased root dry weight by 11.3%～23.6% and 72.9%～154.9%，respectively. 【Conclusion】Intercropping of faba bean with wheat significantly increases physiological resistance of faba bean to Fusarium oxysporum f. fabae，and significantly lowers the incidence of Fusarium wilt on one hand and effectively regulates soil microbial activity and diversity in the faba bean rhizosphere soil，on the other，thus alleviating the harm of Fusarium wilt caused by cinnamic acid and promoting growth of the crop. However，the effect is affected by concentration of cinnamic acid. By making use of the allelopathic effect of wheat as non-host crop，the intercropping of faba bean with wheat is an effective measure to alleviate autotoxicity of cinnamic acid.

Cinnamic acid；Faba bean wilt disease；Intercropping；Metabolic functional diversity of microbial community；Antioxidant enzymes activity

S643.6

A

10.11766/trxb201605030043

（責(zé)任編輯：陳榮府）

* 國家自然科學(xué)基金項目（31360507，31560586，31460551）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos. 31360507，31560586 and 31460551）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：zhengyi-64@163.com

董 艷（1975—），女，云南安寧人，博士，副教授，主要研究方向為間作系統(tǒng)根際微生態(tài)與病害控制。E-mail：dongyanyx@163.com

2016-05-03；

2016-09-27；優(yōu)先數(shù)字出版日期（www.cnki.net）：2016-11-21