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    影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的因素及其評價(jià)方法

    2017-04-19 05:57:56劉華杰
    家禽科學(xué) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:乳狀液乳劑活疫苗

    劉華杰

    (佛山市三水灝誠合成樹脂有限公司,廣東 佛山 528143)

    影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的因素及其評價(jià)方法

    劉華杰

    (佛山市三水灝誠合成樹脂有限公司,廣東 佛山 528143)

    本文介紹了各種影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的因素。從物化性質(zhì)方面指出了混合乳化劑的HLB值與濃度、油水相比、助懸劑(硬脂酸鋁)的濃度等對油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的影響;又從儀器和操作指標(biāo)方面指出了儀器乳化強(qiáng)度、乳化時(shí)間、制備方式等對油乳劑疫苗穩(wěn)定性的影響。結(jié)合乳狀液的穩(wěn)定性分析方法,總結(jié)出適合油乳劑滅活疫苗穩(wěn)定性的評價(jià)方法,如離心破乳法、靜置高溫或冷凍沉降法、電導(dǎo)率法、相對分布法等。

    油乳劑;滅活疫苗;乳化技術(shù);穩(wěn)定性

    禽類傳染病,尤其是病毒性傳染病主要靠疫苗接種進(jìn)行預(yù)防。滅活疫苗是指將病原微生物經(jīng)物理或化學(xué)方法滅活后,失去其感染能力,但仍然保持其免疫原性,接種后能使動物產(chǎn)生特異性抵抗力的生物制劑。由于滅活疫苗接種后不能在動物體內(nèi)繁殖,因此使用劑量較大,免疫期較短,但加入適當(dāng)?shù)淖魟┖罂稍鰪?qiáng)免疫效果,延長免疫期。油乳劑乳液疫苗[1]是以礦物油為佐劑與滅活后的抗原液混合乳化制成的,它以其吸收緩慢、免疫刺激持續(xù),免疫保護(hù)期長的特點(diǎn)在疫苗的應(yīng)用方面有著不可替代的作用,但油乳劑乳液疫苗在制作過程中由于儀器與操作指標(biāo)、油乳劑本身物理化學(xué)性質(zhì)和保存條件等因素的影響,往往造成油乳劑乳液疫苗的不穩(wěn)定性,影響了油乳劑乳液疫苗的實(shí)際應(yīng)用,這一問題已經(jīng)極大的影響了疫苗的免疫效果。本文從油乳劑本身的物理化學(xué)性質(zhì)與儀器和操作指標(biāo)方面分析各種影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的因素,同時(shí)結(jié)合了乳狀液的穩(wěn)定性分析方法,總結(jié)出適合油乳劑疫苗穩(wěn)定性的評價(jià)方法。

    1 影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的因素

    1.1 物化性質(zhì) 它包括界面膜的物理性質(zhì)、粘度、油水相比以及助懸劑等,是影響油乳劑滅活疫苗穩(wěn)定性的最主要的因素。

    1.1.1 表面活性劑 非離子表面活性劑具有低毒性、低刺激性等特點(diǎn),大量用于醫(yī)藥乳狀液中。油乳劑滅活疫苗中使用的表面活性劑大多為非離子表面活性劑中的Span-80與Tween-80混合表面活性劑,其中Span-80是親油性的表面活性劑,Tween-80是親水性的表面活性劑。表面活性劑對油乳劑的穩(wěn)定性影響方面主要有界面張力、HLB值、界面膜的大小厚薄和粘度、液滴顆粒的大小等。要獲得優(yōu)良的油乳劑,應(yīng)將滅活液高度分散于白油中,就要使油與水的界面張力降低,表面活性劑的一個(gè)主要功能就是降低界面張力,從而使水相分散于油相之中。但是,單純的水/油界面張力的高低主要表明了油乳劑形成之難易,并非油乳劑穩(wěn)定性的必然衡量標(biāo)志[2]。

    自從Griffin[3]提出HLB方法作為選擇乳化劑的標(biāo)準(zhǔn)后,混合乳化劑的HLB值就成為制備穩(wěn)定乳狀液的重要參數(shù),油乳劑中的HLB值的調(diào)整主要利用Span-80與Tween-80的配比來進(jìn)行。具有良好免疫效果的油乳劑多為W/O型,油相為白油,這需要在一定的 HLB值范圍內(nèi)達(dá)到,一般HLB值小于8。HLB值對油乳劑的穩(wěn)定性有著非常大的影響,且不同的活性劑用量所需要的最佳的 HLB值也不同,一般來說[4],活性劑的用量越大,體系的最佳HLB值是增加的。

    在滅活液(以下簡稱水相)/油體系中加入表面活性劑后,界面張力降低,同時(shí)界面發(fā)生吸附,形成界面膜。界面膜具有一定強(qiáng)度,對分散相液珠在有保護(hù)作用,使得液珠在相互碰撞時(shí)不易聚結(jié)。當(dāng)表面活性劑濃度低時(shí),界面上吸附的分子少,界面膜的強(qiáng)度差,形成的油乳劑穩(wěn)定性亦差。表面活性劑濃度升高至一定程度后,液珠的粒徑顯著減小,界面膜由比較緊密排列的、定向的吸附分子所組成,膜的強(qiáng)度相應(yīng)較大,油乳劑液珠聚結(jié)時(shí)受到的阻力較大,故形成的油乳劑穩(wěn)定性較好。隨著表面活性劑濃度的進(jìn)一步上升,活性劑分子之間相互凝聚下沉而導(dǎo)致油乳劑分層。在制備油乳劑時(shí),表面活性劑需要加入足夠量,才能有最佳的乳化效果,同時(shí)必需考慮到生產(chǎn)效益和油乳劑的穩(wěn)定加入最佳濃度的表面活性劑。研究發(fā)現(xiàn),單一、純凈的表面活性劑所形成的界面吸附膜的膜排列不夠緊密,膜強(qiáng)度不高。而混合的表面活性劑,以及混有雜質(zhì)的表面活性劑,則比單一、純凈的膜強(qiáng)度大為提高,表面吸附分子排列緊密。Span-80與Tween-80組成的混合表面活性劑在油乳劑滅活疫苗中得到了廣泛的使用。一般認(rèn)為[3],在混合表面活性劑使用后,界面上有“復(fù)合物”生成,膜的強(qiáng)度增加,表面張力降至極低值且不易破裂,因此液珠不易聚結(jié),油乳劑更穩(wěn)定。

    1.1.2 油水相比 油水相比對液珠顆粒大小、粘度以及油乳劑乳狀液的類型都有重要影響。油乳劑粘度影響油乳劑滅活疫苗的穩(wěn)定性,粘度越大,則分散相液珠運(yùn)動速度越慢,有利于油乳劑的穩(wěn)定。在油乳劑滅活疫苗中,滅活液是內(nèi)相,白油是分散相,滅活液的比例越高,粘度越大[3]。低粘度容易造成油乳劑不穩(wěn)定,高粘度不能用于機(jī)體免疫,不適合靜脈注射,因此油水相比的大小有一定范圍。由于不同油乳劑中表面活性劑的量與油水相比不同,液珠的大小分布也不同,適中的液珠大小有利于油乳劑的穩(wěn)定,大液珠在重力場中容易沉降,小液珠由于布朗運(yùn)動相撞引起聚結(jié)。此外油乳劑中液珠顆粒大小分布情況也會影響油乳劑的穩(wěn)定性,液珠顆粒大小平均的油乳劑較液珠顆粒大小分布較不均的油乳劑穩(wěn)定得多。對于油乳劑來說,理想的液珠是大小適中且均勻的球形,此時(shí)油乳劑疫苗最為穩(wěn)定。油水相比的改變能影響液珠顆粒大小,使得液珠大小不均勻。這是因?yàn)闃O端情況下液珠被擠成大小形狀皆不同的多面體,這種油乳劑極不穩(wěn)定;并且油水相比低則不能充分利用油乳劑,造成浪費(fèi)。多數(shù)的生產(chǎn)中的滅活液與白油的體積之比為 1:1、1:2、1:3,比例的大小視所需的滅活疫苗的劑量、需要的粘度以及穩(wěn)定性來定。

    1.1.3 硬脂酸鋁 硬脂酸鋁作為助懸劑用于油乳劑之中。加入適量可減少液珠的沉降,增強(qiáng)油乳劑的內(nèi)相粘度,降低液珠之間的碰撞幾率,最終影響油乳劑的穩(wěn)定性。但硬脂酸鋁加入過多后粘度上升過快導(dǎo)致油乳劑滅活疫苗不適合注射。用1ml的吸管吸取25℃左右的疫苗1ml,另其自然流出,記錄流出0.4ml所需要的時(shí)間,3次流出時(shí)間平均在6~8s為宜,因此加入油乳劑滅活疫苗中的硬脂酸鋁必須適量,根據(jù)油/水相比的不同而進(jìn)行調(diào)整。資料顯示[5]當(dāng)油相中硬脂酸鋁含量與油/水比分別為2%和3:1、1%和2:1以及0.5%和1:1時(shí),制備的質(zhì)量達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2 儀器和操作指標(biāo)

    1.2.1 制備油乳劑的方式 油乳劑的制備方式較為簡單,通用的方法一般有兩種,一種是劑在油中法:將水相和油相分別配制,油相的主要成分為白油、Span-80和硬脂酸鋁;水相主要為病毒滅活液、Tween-80、生理鹽水。在激烈的持續(xù)攪拌下將水相加入油相,加入的時(shí)間宜長,使得兩相能充分混合,較短則對油乳劑的穩(wěn)定性不利[6],一般 60s以內(nèi)為宜;另一種為劑在水中法:配置方法大致相同,加入時(shí)是在激烈的持續(xù)攪拌下將油相加入水相,油乳液由O/W型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閃/O型。兩種方法都能制備出穩(wěn)定的油乳液。此外,在HLB值不變的情況下,不同的方法制備水相和油相以及白油、Span-80和硬脂酸鋁的加入與加熱的先后對油乳劑疫苗的穩(wěn)定性也有影響。

    1.2.2 乳化強(qiáng)度和時(shí)間 制備油乳劑的設(shè)備一般有攪拌器、均化器、齒輪泵、超聲乳化器、膠體磨等。對于大規(guī)模的油乳劑滅活疫苗制備,一般采用均質(zhì)器。高壓均質(zhì)器可快速的制備比較均勻的油乳劑。實(shí)驗(yàn)室研究中常采用高速均質(zhì)器。

    儀器乳化速率和時(shí)間對油乳劑穩(wěn)定性的影響極大,分散相在強(qiáng)大機(jī)械力的作用下分散越來越均勻,故形成的油乳劑顆粒越均勻細(xì)密[7],油乳劑就越穩(wěn)定。但當(dāng)乳化強(qiáng)度達(dá)到一定程度后繼續(xù)增大強(qiáng)度,油乳劑的穩(wěn)定性提高較小,顆粒之間碰撞較多,容易破乳;再者高速剪切攪拌對于高粘度體系生熱更為明顯,大量的機(jī)械能被轉(zhuǎn)化為熱的形式散失掉。從經(jīng)濟(jì)性角度出發(fā),實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用合適的乳化速率一般為8000rpm為佳,對于膠體磨和高壓均質(zhì)器來說,還要有一定的乳化壓力,這需要乳化速率與乳化壓力的配比,即為乳化強(qiáng)度,乳化壓力為30P為宜[8]。

    混合乳化劑存在下,油水兩相經(jīng)強(qiáng)烈攪拌乳化形成比較穩(wěn)定的乳狀液需要一定時(shí)間,約為10~15min。在到達(dá)該時(shí)間之前,油乳劑的穩(wěn)定性隨著攪拌乳化時(shí)間的增加而增加,超出該時(shí)間后,油乳劑中的液珠可能因?yàn)橄嗷ヅ鲎埠碗x心沉降的作用有聚結(jié)的趨勢,影響油乳劑的穩(wěn)定性。

    1.2.3 乳化溫度 油乳劑為O/W型,使用非離子乳化劑,它隨溫度的降低親油性減弱,親水性增強(qiáng),同時(shí)在某一臨界溫度下會發(fā)生相轉(zhuǎn)變,即相轉(zhuǎn)變溫度[9]。對于用非離子表面活性劑穩(wěn)定的O/W型油乳劑滅活疫苗來說,PIT(相轉(zhuǎn)變溫度)應(yīng)當(dāng)比室溫低10~40℃,因此乳化溫度在25℃以下效果較好,才可保證在儲存過程中不因溫度降低而發(fā)生向O/W乳狀液的轉(zhuǎn)向。乳化溫度越接近PIT,液珠越均勻,油乳劑越穩(wěn)定。

    2 油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性的評價(jià)方法

    油乳劑是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系,長期放置必然會導(dǎo)致破乳。油乳劑的不穩(wěn)定性一般有5種表現(xiàn)形式:分層、聚結(jié)、絮凝、破乳和變形[10]。油乳劑滅活疫苗的穩(wěn)定性與油乳劑滅活疫苗的免疫效力密切相關(guān),油乳劑滅活疫苗不穩(wěn)定,滅活疫苗的吸收就不好,對機(jī)體的刺激不夠,免疫效果大大降低,不能使用。

    由于油相和水相密度不同,在重力作用下液珠將下沉并在乳狀液中建立起平衡的濃度梯度,這個(gè)過程稱為分層,它是油乳劑的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)。雖然分層使乳狀液的均勻性遭到破壞,但乳狀液并未真正破壞,上層清油比原來多,而下層比原來少。由重力作用引起的分層,其沉降速度與內(nèi)外相密度差、外相的粘度、液珠的大小等因素有關(guān)。分層的速度符合 Stokes定律[3]:

    Stokes定律中的重力常數(shù)g為w2R所代替,式中w是離心器的角速度,R是試樣與轉(zhuǎn)動軸的距離,r為粒子半徑,d1為水相密度,d2為油相密度,η為油相的粘度。油乳劑在靜置狀態(tài)下分層的速度與重力常數(shù)成正比,粒子半徑和密度相差越大,粘度越小則越易分層。當(dāng)分層到達(dá)一定程度后就會產(chǎn)生破乳,這是油乳劑最后變成油水兩相分離狀態(tài)的過程,這時(shí)兩相界面清晰可見。

    油乳劑的穩(wěn)定性可采用是否分層或者分層的程度來定義[11],通常有靜置實(shí)驗(yàn)、離心分離、靜置高溫或冷凍沉降、電導(dǎo)率測定和粒度分布等測定方法。下面介紹幾種常用的穩(wěn)定性檢測方法。

    2.1 離心分離法 離心破乳法是目前常用的油乳劑穩(wěn)定性評價(jià)方法,離心的作用可使分層加速。在此情形下,Stokes定律中的重力常數(shù)g為w2R所代替。

    顯然,我們可使w2R比g大許多倍(事實(shí)上比地心引力大數(shù)千倍并非難事)。倘若假設(shè)普通的分層速度與重力成正比,則在離心力場中的速度可以預(yù)知。離心法的測定結(jié)果受兩個(gè)因素的影響,即離心時(shí)間和離心速度。一般情況下將油乳劑在3000rpm的速度下離心15~20min,如果在此狀況下油乳劑滅活疫苗不分層則可認(rèn)為穩(wěn)定性達(dá)到要求。

    2.2 靜置高溫或冷凍沉降法 這是較為常用的試驗(yàn)方法,是通過體系的熱負(fù)荷變化,了解并判斷油乳劑的穩(wěn)定性[9]。高溫有利于降低油乳劑的粘度,降低液膜厚度,增加液珠碰撞幾率。冷凍使得液珠的體積增大,液膜的厚度減少;表面活性劑聚結(jié),出現(xiàn)裂縫,增加了破乳率。高溫或低溫的方法使油乳劑分層較一般的靜置分層快10倍以上。一般來說,高溫沉降法所需要的溫度為40℃~60℃,冷凍沉降法所需要的溫度為0~-10℃。該法可以較為直觀的分析出不同油乳劑的穩(wěn)定性,比較出任何時(shí)刻不同油乳劑的分層現(xiàn)象。

    2.3 電導(dǎo)率法 與以上兩種方法不同,該法能較為精確的分析出油乳劑的分離程度,也可與以上幾種方法聯(lián)用,達(dá)到更好的分析效果。由于一些乳狀液的油水分層界面不夠清晰,應(yīng)用傳統(tǒng)的分相法來研究乳狀液穩(wěn)定性受到限制,不同油乳劑具有不同的電性質(zhì)。由于水是電的良導(dǎo)體,因而O/W型乳狀液的電導(dǎo)率較之W/O型要大。通過同一高度處油乳劑電性質(zhì)的測定,可有效地確定油乳劑的穩(wěn)定性[12]。直接應(yīng)用電導(dǎo)率曲線可研究油乳劑乳化的體系的穩(wěn)定性。通過對油乳劑電導(dǎo)率的測定,隨著破乳分層,油相中含水量不斷減少,電導(dǎo)率相應(yīng)減小,即可表征油乳劑的破乳率,分析油乳劑的穩(wěn)定性。

    2.4 相對分布法[13]先將配置好的油乳劑在35~40℃的溫度下靜置120h,用長吸管分別將上下層的油乳液吸出,然后往上下兩乳液樣品中各加入少量配好的高價(jià)離子溶液,放入90℃下恒溫水中破乳,直至油水完全分清。讀出上下兩部分樣品的清水層體積。計(jì)算上下兩部分樣品中水相體積相對比值V上/V下(%),以此表示油乳液分散相均勻分布程度在恒溫靜置一定時(shí)間后的變化。若某油乳劑的上下部分水相體積相對比最接近于100%,則視該乳狀液為最穩(wěn)定乳狀液。油乳液穩(wěn)定性可用相對分布法定量地來評價(jià),用簡單的方式和儀器獲得比目測法更準(zhǔn)確的結(jié)果。

    3 結(jié)語

    綜上所述,影響油乳劑乳液疫苗穩(wěn)定性因素主要是油乳劑本身物化性質(zhì)和乳化工藝與技術(shù)兩種因素。而穩(wěn)定性的檢測主要有靜置、離心分離、靜置高溫或冷凍沉降、電導(dǎo)率測定和相對分布法等方法。目前有關(guān)油乳劑穩(wěn)定性的理論還不成熟,絕大多數(shù)廠家的疫苗生產(chǎn)還是停留在經(jīng)驗(yàn)階段,因此在理論上更深入地探討油乳劑的穩(wěn)定性是以后科研的方向。

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    S852.4+3

    A

    1673-1085(2017)03-0052-04

    2017-02-20

    劉華杰(1981-),男,湖南永興人,工程師,碩士,從事乳液疫苗化學(xué)方面研究,郵箱:blackjacket@126.com。

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