國外奶牛場牛支原體體外藥敏試驗報告

編譯/劉 超

〔拜耳（四川）動物保健有限公司〕

國外奶牛場牛支原體體外藥敏試驗報告

編譯/劉 超

〔拜耳（四川）動物保健有限公司〕

從比利時、德國和意大利3 個國家的奶牛場的牛奶樣品中分離了73 份牛支原體樣本，進行體外藥敏試驗。通過肉湯稀釋法對紅霉素、螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素、林可霉素、恩諾沙星、強力霉素、土霉素、氟苯尼考和泰妙菌素等抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）進行檢測。結(jié)果表明，比利時、德國和意大利3 個國家分離的牛支原體對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性嚴(yán)重。而泰妙菌素和強力霉素等不能在奶牛上使用的抗菌藥物，耐藥性極小。

奶牛；牛支原體；最小抑菌濃度（MIC）；抗菌藥物

牛支原體是一種無細(xì)胞壁的微生物，屬于柔膜細(xì)菌屬（圖1）。支原體能夠引起牛只的呼吸道疾病、中耳炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎和角膜結(jié)膜炎等。牛支原體是主要威脅奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖效益的病原之一。

牛支原體乳房炎主要臨床癥狀包括乳汁異常，如水樣、有奶絮、乳房腫脹變硬等；現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)支原體乳房炎有亞臨床病例?，F(xiàn)已證實支原體乳房炎能夠在擠奶時，由感染乳區(qū)傳染給健康乳區(qū)，但極少在擠奶以外的其它途徑中傳播。多個研究文獻(xiàn)中都指出牛支原體能在牛身上的多個部位繁殖，有學(xué)者推斷牛支原體能夠在牛乳房內(nèi)感染或者在體內(nèi)由乳房傳染給其它器官，反之亦然。此外，牛只之間的傳播是通過病原體黏附或定植在外部黏膜表面上進行的。

圖1 牛支原體

目前還沒有能有效預(yù)防牛支原體感染的疫苗?？咕幬锸侵委熤гw導(dǎo)致的呼吸道疾病和關(guān)節(jié)炎的有效手段；但抗菌藥物治療支原體性乳房炎效果有限。在歐洲和美國等很多國家都陸續(xù)報道，已分離出耐藥性牛支原體，尤其是發(fā)現(xiàn)了大量泰樂菌素和替米考星的耐藥性菌株。樣本主要來自奶牛和肉牛的呼吸道疾病樣本，少部分來自乳房炎樣本（因為支原體性乳房炎的治愈率通常較低）。乳汁中分離的牛支原體樣本可以幫助鑒定奶牛場泌乳?？咕幬锬退幮缘那闆r，在奶牛場如果能夠確定是支原體性乳房炎，通常會選擇合適的抗菌藥物進行治療，如果不能確認(rèn)，則通常無法選擇合適的抗菌藥物治療。

本試驗的目的是通過對德國、比利時和意大利3 個國家奶牛場分離得到的73 份牛支原體樣本進行體外藥敏試驗，評估牛支原體耐藥性情況（表1）。藥物選擇大環(huán)內(nèi)酯類、氟苯尼考、土霉素及恩諾沙星進行試驗的原因是，多個國家奶牛場中習(xí)慣使用上述藥物治療牛支原體。選擇強力霉素和泰妙菌素進行試驗是因為這2 種抗菌藥物可能也對牛支原體敏感，但在歐盟國家還不準(zhǔn)用于治療奶牛。

1 試驗樣本和方法

1.1 試驗樣本

73 個分離株分別在比利時、德國、意大利的4 個實驗室培養(yǎng)。樣本分別來自于68 頭奶牛和4 個大罐奶奶樣。

1.2 試驗方法

每個牛支原體分離株都按照支原體MIC檢測準(zhǔn)則中描述的方法，分別使用液體和固體PPLO培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

液體PPLO肉湯培養(yǎng)基用于陽性牛支原體樣本的鑒定，鑒定方法為16S rDNA PCR和變形梯度電泳。

固體培養(yǎng)基用于后續(xù)的最小抑菌濃度（MIC值）測定，具體方法為，將樣本在10 mL PPLO培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的菌種分成10 等份，在-80 ℃凍存至少24 h。凍存后取1 份進行解凍，測定菌體濃度。如果菌體濃度合適，則在含有凍干抗菌藥物的96 孔板中接種1.0×104UCC/mL菌體。將96 孔板在37±1 ℃的有氧溫箱中孵育18 h以上，每天檢查3 次，確認(rèn)陽性對照孔生長良好。每個分離株都需要做一個重復(fù)，設(shè)ATCC25523株為質(zhì)量對照。

表1 牛奶中分離的73 個牛支原體分離株對抗菌藥物敏感性情況

每個抗菌藥物都測定以下參數(shù)：使用的MIC稀釋范圍、MIC值范圍以及可以抑制50%和90%支原體生長的最低抑菌濃度（分別表示為MIC50和MIC90）?？股豈IC值的變異性通過中位數(shù)絕對偏差確定，這是一個比標(biāo)準(zhǔn)偏差統(tǒng)計更精確的色散指數(shù)。中位數(shù)絕對偏差是指每個數(shù)據(jù)的中位數(shù)的中位數(shù)絕對偏差。

1.3 關(guān)鍵概念說明

每個分離株的MIC值是描述的抗菌藥物在支原體孵化過程中完全抑制其生長的最小濃度。當(dāng)MIC值大于最高抑菌濃度仍無法抑制支原體生長時，認(rèn)為該藥物的MIC值大于最高濃度。當(dāng)MIC值小于最低抑菌濃度仍可抑制支原體生長時，認(rèn)為該藥物的MIC值小于最低濃度。

1.4 統(tǒng)計方法

用SPSS 22.0軟件對3 個國家分離株樣本的MIC值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Kruskal Wallis檢驗評價每個分離株MIC值之間的整體差異。Kruskal Wallis檢驗中P＜0.05則認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2 分離株對抗菌藥物敏感性結(jié)果

2.1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物

圖2 73 個牛支原體分離株對強力霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、林可霉素、土霉素、螺旋霉素、泰妙菌素和泰樂菌素的MIC值

所有抗菌藥物的耐藥性情況見表1。在抗菌藥物的耐藥性檢測中，所有大環(huán)內(nèi)酯類藥物的MIC90值都高于最高測試濃度。大環(huán)內(nèi)酯類MIC50值（≤0.05μg/mL）最低的是螺旋霉素，其中27 個分離株（37%）的MIC值≤0.5μg/mL，是該類藥物測試的最低濃度。大環(huán)內(nèi)酯類中比較有趣的現(xiàn)象是泰樂菌素和替米考星的差異：替米考星的MIC值除1 株分離株外，其它分離株的MIC值都是高于最高檢測濃度，而泰樂菌素的MIC值分布十分廣泛，其中43 個分離株（59%）MIC值處于0.125～32μg/ mL，而30 個分離株（61%）＞32μg/mL。泰樂菌素和替米考星使用同樣的核糖體結(jié)合位點，但是泰樂菌素耐藥性產(chǎn)生的主要原因是23S rRNA基因結(jié)合位點突變，盡管只是少數(shù)位點的突變，卻會導(dǎo)致泰樂菌素耐藥性產(chǎn)生極大變化。這種變化是十分奇妙的，因為在歐盟國家，替米考星較少用于泌乳牛（因為棄奶期較長），而泰樂菌素經(jīng)常用于泌乳牛。

2.2 林可酰胺類

林可霉素是屬于林可酰胺類的一種抗菌藥物，其MIC值呈雙峰式分布（圖1）：41 個分離株（56%）的 MIC值≤0.5μg/mL，而30 個分離株（41%）＞32 μg/mL。林可霉素的耐藥性同大環(huán)內(nèi)酯類和土霉素B族的耐藥性相似，原因是分離株攜帶erm基因且會產(chǎn)生一種使23S rRNA甲基化的酶。林可霉素和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥性的差異是因為大環(huán)內(nèi)酯類能夠解離誘導(dǎo)交叉耐藥性的產(chǎn)生，對大環(huán)內(nèi)酯類具有耐藥性但是對林可霉素敏感的細(xì)菌，一旦暴露在大環(huán)內(nèi)酯類環(huán)境中就會很快誘導(dǎo)出對林可霉素的耐藥性。

2.3 喹諾酮類

恩諾沙星的MIC值呈現(xiàn)單峰，MIC50值（0.25 μg/mL）和MIC90值（2 μg/mL）都明顯低于大環(huán)內(nèi)酯類。這個結(jié)果同之前比利時、法國和日本文獻(xiàn)中報導(dǎo)的結(jié)果一致，且無論分離株來自肉牛和奶牛的呼吸道還是牛奶，其結(jié)果都表現(xiàn)一致。

2.4 四環(huán)素類

試驗中有兩種四環(huán)素類——土霉素和強力霉素（歐盟尚未批準(zhǔn)強力霉素用于奶牛治療）。土霉素相比于強力霉素，土霉素高于強力霉素的MIC50（2.0 vs. 0.5μg/mL）2倍，且高于強力霉素的MIC90值（4.0 vs. 2 μg/mL）1 倍。土霉素的MIC值低于其它文獻(xiàn)中的報導(dǎo)，這些報導(dǎo)中的MIC50和MIC90值都高于本試驗值的4 倍。

2.5 氯霉素類

氟苯尼考常用于治療牛呼吸道疾病，其MIC50值（1 μg/mL）和MIC90值（2 μg/mL）明顯低于其它文獻(xiàn)報導(dǎo)中牛奶分離樣本測定的值。

2.6 截短側(cè)耳素類

泰妙菌素是截短側(cè)耳素類抗菌藥物的一種，目前在歐盟僅批準(zhǔn)在豬和禽類中使用，但試驗結(jié)果顯示可以抑制牛支原體，MIC50值（0.25 μg/mL）和 MIC90值（0.5 μg/mL）都極低，這個結(jié)果同之前文獻(xiàn)報導(dǎo)的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

因為缺少牛支原體CLSI-批準(zhǔn)的試驗標(biāo)準(zhǔn)，因此分離株不會按照對不同抗菌藥物的敏感性分為敏感菌、耐藥菌和介于敏感和耐藥之間的菌株。然而，試驗中的MIC值測定指出目前所有國家的分離株均對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性嚴(yán)重。這個結(jié)果是極不尋常的，尤其是在牛支原體性肺炎爆發(fā)時，替米考星和泰樂菌素經(jīng)常被作為首選藥物使用。相反，極少用于治療牛的抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性較小，如泰妙菌素和強力霉素，這與牛支原體病治療時抗菌藥物的選擇和耐藥性發(fā)展相關(guān)。當(dāng)然，對大環(huán)內(nèi)酯類的嚴(yán)重耐藥性可能與非特異性耐藥性機制相關(guān)；在進一步研究中，應(yīng)重點研究耐藥性產(chǎn)生和加強的原因。

原文：Barberio A,Flaminio B,Vliegher S D,etal. Short communication: In vitro antimicrobial susceptibility of Mycoplasma bovis isolates identified in milk from dairy cattle in Belgium,Germany,and Italy.Journal of Dairy Science，2016, 99（8）：6578–6584.

美贊臣2億澳元收購澳大利亞百嘉奶酪公司工廠

【本刊輯】2017年2月，美贊臣與澳大利亞領(lǐng)先乳制品公司百嘉奶酪公司達(dá)成協(xié)議，收購其噴霧干燥和成品加工工廠。這項交易涉及金額為2 億澳元，預(yù)計將于2017年第二季度完成。

此舉是2017繼美贊臣被利潔時集團收購后的又一大的舉措。國內(nèi)乳業(yè)資深分析師宋亮認(rèn)為，此次收購有三點考量：一是有了利潔時的支持，美贊臣在營養(yǎng)品市場上加大了步伐，其中包括將打造屬于自已的供應(yīng)鏈體系，從工廠、奶源基地、終端銷售等；二是此次美贊臣收購的百嘉奶酪公司的工廠具有生產(chǎn)有機產(chǎn)品的資質(zhì)和能力，這將有助其在高端有機食品方面獲得資源；第三，美贊臣在澳大利亞布局，可以搭上《中國-澳大利亞自由貿(mào)易協(xié)定》的便車，享受到優(yōu)惠的關(guān)稅。

劉超（1984-），女，職業(yè)獸醫(yī)師，拜耳反芻動物團隊市場專員。

2017-01-11）