日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化鼠巨噬細(xì)胞的初步研究

李丹丹，馬麗貞，苑純秀，史曉娜，艾 敏，塔 娜，馮新港

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重開放點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

·研究論文·

日本血吸蟲高遷移率族蛋白活化鼠巨噬細(xì)胞的初步研究

李丹丹1,2，馬麗貞1，苑純秀1，史曉娜1,2，艾 敏1，塔 娜1，馮新港1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重開放點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

為研究日本血吸蟲高遷移率族蛋白（Schistosoma japonicum high mobility group box1, Sj HMGB1）體外活化小鼠巨噬細(xì)胞的功能，利用真核重組Sj HMGB1蛋白與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子以及趨化因子受體的表達(dá)。收集Sj HMGB1蛋白與巨噬細(xì)胞共孵育48 h后上清，ELISA檢測(cè)上清中TNF-α與 IL-10的含量，Griess法檢測(cè)上清中NO的含量。流式結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Sj HMGB1蛋白刺激組的巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子，TLR4受體以及趨化因子受體CCR7的表達(dá)顯著上調(diào)且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TLR2受體的表達(dá)顯著下調(diào)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ELISA結(jié)果顯示，Sj HMGB1能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌致炎因子TNF-α，未能促進(jìn)抑炎因子IL-10的釋放。Griess法表明Sj HMGB1能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO。本研究結(jié)果表明Sj HMGB1可能通過TLR4通路活化小鼠巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其向致炎性M1型巨噬細(xì)胞極化。

日本血吸蟲；高遷移率族蛋白；巨噬細(xì)胞；TLR；細(xì)胞因子

血吸蟲病是一種人畜共患的慢性消耗性寄生蟲病[1]。隨著吸血蟲耐藥性等問題的出現(xiàn)，研制出高效、實(shí)用的抗血吸蟲疫苗迫在眉睫。研究表明，輻照血吸蟲疫苗能夠誘導(dǎo)高保護(hù)性免疫效果，其機(jī)制可能是通過輻照血吸蟲來源的分子刺激宿主免疫細(xì)胞在肺部形成了以Th1為主要應(yīng)答的致炎性環(huán)境而實(shí)現(xiàn)[2]，近年來，探索輻照致弱血吸蟲尾蚴或童蟲疫苗（RAV）的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制，已成為學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)課題，其中RAV的免疫原性分子與細(xì)胞基礎(chǔ)及機(jī)制等問題尤其受到重視[3]。通過研究RAV免疫誘導(dǎo)的高保護(hù)性效應(yīng)機(jī)制，推測(cè)在輻照致弱血吸蟲疫苗模型中可能存在一類蟲源性應(yīng)急分子，如日本血吸蟲高遷移率族蛋白（SjHMGB1)、熱休克蛋白70（SjHSP70）以及鈣網(wǎng)織蛋白（SjCRT)等發(fā)揮著重要作用。這些研究結(jié)果為研制安全有效的血吸蟲分子疫苗提供了指導(dǎo)。HMGB1作為內(nèi)源性的DAMPs的典型代表，是介導(dǎo)先天性免疫的一個(gè)關(guān)鍵分子，在組織損傷、炎癥反應(yīng)、干細(xì)胞的募集和活化以及組織修復(fù)過程中均發(fā)揮作用[4]。王利利等[5,6]研究表明電離輻射可以誘導(dǎo)HMGB1分子通過乙?；饔脧暮藘?nèi)至胞漿再到胞外的移位。Gnanasekar等[7]發(fā)現(xiàn)，SmHMGB1可以誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-13等細(xì)胞因子，故SmHMGB1在曼氏血吸蟲中可能是血吸蟲宿主體內(nèi)炎癥免疫反應(yīng)過程中的一個(gè)關(guān)鍵分子。據(jù)此，我們推測(cè)SjHMGB1作為一類蟲源性的應(yīng)急分子，在RAV模型誘導(dǎo)的高保護(hù)性免疫效應(yīng)中，通過與宿主免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的相互作用，形成了驅(qū)動(dòng)固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的環(huán)境，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用。相關(guān)的研究還顯示，巨噬細(xì)胞在介導(dǎo)殺滅肺期童蟲和形成肺部炎性反應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮了重要作用。胞外HMGB1可能與細(xì)胞表面的相關(guān)受體，例如晚期糖基化受體，TLR2、TLR4以及其他未知受體結(jié)合從而激活相應(yīng)的免疫細(xì)胞[9,10]。因此，本研究以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系作為模型，在SjHMGB1刺激后，檢測(cè)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子以及細(xì)胞表面標(biāo)志分子與受體的分泌表達(dá)情況，為進(jìn)一步闡明SjHMGB1在 RAV中所發(fā)揮的功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基與胰酶購自Invitrogen公司；胎牛血清購自Gibco公司；PE標(biāo)記的抗TLR4單抗和FITC標(biāo)記的抗TLR2單抗購自eBioscience公司；FITC標(biāo)記的抗MHC-Ⅱ單抗購自BD公司；PE標(biāo)記的抗CCR7單抗購自BD公司；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-Go Kit以及Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go Kit購自eBioscience公司；NO檢測(cè)試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司；其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.2 蛋白和細(xì)胞株 SjHMGB1蛋白為桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞株為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中定期傳代培養(yǎng)，采用處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2 SjHMGB1蛋白刺激巨噬細(xì)胞 通過胰酶消化巨噬細(xì)胞，收集離心，用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整巨噬細(xì)胞的濃度為1×106個(gè)/mL，加入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（1 mL/孔）。實(shí)驗(yàn)組加入真核蛋白SjHMGB1，濃度為 50μg/mL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（未刺激）和LPS（50μg/mL）陽性對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面分子及受體的表達(dá) 繼續(xù)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞。4℃、239×g離心5 min，細(xì)胞沉淀用200 μL RPMI1640懸起，每管加入2μL Rat Anti-Mouse CD16/CD32 抗體，4℃封閉30 min，以消除抗體非特異性結(jié)合。用含3%熱滅活的胎牛血清及0.1%疊氮鈉的PBS緩沖液洗2次，分別加入PE標(biāo)記的Rat Anti-Mouse TLR4抗體、FITC標(biāo)記的Rat Anti-Mouse TLR2抗體、FITC標(biāo)記的Rat Anti-Mouse MHC-Ⅱ抗體、PE標(biāo)記的Rat Anti-Mouse CCR7抗體，4℃避光孵育30 min，4℃、239×g離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入400 μL PBS重懸轉(zhuǎn)至流式管中，流式儀檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞后TNF-α和IL-10的分泌情況 采用上述方法處理巨噬細(xì)胞并收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清，按細(xì)胞因子待檢試劑盒說明書要求稀釋各溶液。將稀釋后的capture antibody加入96孔酶標(biāo)板中（100 μL/孔），4℃包被過夜；0.05%PBST洗3遍，用200 μL assay diluent室溫封閉1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100μL detection antibody，室溫孵育1 h；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL酶標(biāo)二抗，室溫避光孵育30 min；0.05%PBST洗3遍，每孔加入100 μL substrate solution，室溫避光孵育15 min；每孔加入50 μL stop solution終止顯色，測(cè)OD450。

1.2.5 Griess法檢測(cè)SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞后NO的分泌情況 收集上述培養(yǎng)48 h細(xì)胞的上清。按照說明書要求取標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入96孔板中（50 μL/孔），然后每孔加入50 μL Griess R1，室溫避光放置5 min；每孔加入50 μL的Griess R2，室溫避光放置5 min后，測(cè)定OD450，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)曲線并統(tǒng)計(jì)各組NO的濃度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 所有的數(shù)據(jù)均利用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜ 0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，借助Flow Jo，GraphPad Prism 5等軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制圖。

2 結(jié)果

2.1 SjHMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子以及受體分子的表達(dá)情況

2.1.1 SjHMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子上調(diào)表達(dá) 以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞低表達(dá)MHC-Ⅱ分子，但SjHMGB1和LPS的刺激能使巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)性的高表達(dá)MHC-Ⅱ分子。與對(duì)照組相比，SjHMGB1蛋白能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)MHC-Ⅱ分子且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子的表達(dá)差異不具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞儀分析MHC-Ⅱ分子在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)Fig.1 FACS analysis of MHC-Ⅱexpression on macrophagocyte注∶ **表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**

2.1.2 SjHMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面TLR4上調(diào)表達(dá)、TLR2下調(diào)表達(dá) 檢測(cè)結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞僅少量表達(dá)TLR2、TLR4受體，SjHMGB1和LPS的刺激均能使巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)性的高表達(dá)TLR4，低表達(dá)TLR2受體，與對(duì)照組相比差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞儀分析TLR2、TLR4在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)Fig.2 FACS analysis of TLR2、TLR4 expression on macrophagocyte注∶ **表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; ***表示差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note∶ Statistically signifi cant differences(P＜0.05) between experimental and control group were denoted by**, extremely signifi cant differences(P＜0.01) were denoted by***

2.1.3 SjHMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7上調(diào)表達(dá) 由圖3的流式結(jié)果可知，未經(jīng)刺激的巨噬細(xì)胞能表達(dá)一定水平的CCR7，與對(duì)照組相比，SjHMGB1和LPS的刺激能上調(diào)巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7的表達(dá)水平，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而SjHMGB1刺激組與LPS刺激組相比，巨噬細(xì)胞表面CCR7的表達(dá)差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

2.2 SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌前炎性細(xì)胞因子TNF-α含量，由圖4可以看出， LPS刺激組和SjHMGB1刺激組中TNF-α的含量顯著高于對(duì)照組且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可見，SjHMGB1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌前炎性因子TNF-α。

采用ELISA檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌到上清中的IL-10含量，結(jié)果見圖5。對(duì)照組與 LPS刺激組和SjHMGB1刺激組分泌的IL-10的含量差異不具備顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），由此可知，SjHMGB1并沒有促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子IL-10。

2.3 SjHMGB1促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO Griess檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌到上清中的NO含量，由圖6可以看出，與對(duì)照組相比，LPS刺激組和SjHMGB1刺激組巨噬細(xì)胞分泌NO含量高于對(duì)照組，且差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 流式細(xì)胞儀分析CCR7在巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)Fig.3 FACS analysis of CCR7 expression on macrophagocyte注∶ ***表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

圖4 SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-αFig. 4 Cytokine TNF-α production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group are denoted by***

圖5 SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10Fig. 5 Cytokine IL-10 production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1

圖6 SjHMGB1刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NOFig. 6 NO production of macrophagocyte stimulated by recombinant SjHMGB1注∶ ***表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note∶ Statistically highly signifi cant differences (P＜0.01) between experimental and control group were denoted by***

3 討論

研究表明輻照可引起免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD），其顯著特征是通過釋放或表達(dá)所謂的危險(xiǎn)信號(hào)分子如HSP70、HMGB1和CRT等分子來增強(qiáng)免疫應(yīng)答[11]。劉群等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1在不同發(fā)育階段血吸蟲蟲體中均有分布，且在童蟲期表達(dá)量略高，同時(shí)SjHMGB1能夠促進(jìn)宿主DCs的表型成熟。HMGB1可由壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放，相關(guān)研究結(jié)果表明，在輻照尾蚴體外轉(zhuǎn)化的童蟲細(xì)胞，SjHMGB1能夠從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外。我們初步推斷在輻照致弱尾蚴/童蟲疫苗所誘導(dǎo)的高保護(hù)性免疫效應(yīng)中，SjHMGB1作為一類蟲源性應(yīng)激分子發(fā)揮了重要作用。已有研究表明輻照致弱日本血吸蟲尾蚴免疫小鼠后，可在宿主肺部和引流淋巴結(jié)等部位誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的、以Th1為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的免疫保護(hù)效果?；罨拿庖呒?xì)胞如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等通過分泌TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子在致炎性環(huán)境的形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞是單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中具有較強(qiáng)吞噬功能的細(xì)胞類型，它的一個(gè)重要功能就是通過抗原提呈參與特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，而其表面MHC-Ⅱ分子是介導(dǎo)抗原提呈的一類主要分子[13]。已有研究表明在血吸蟲感染的病理進(jìn)程中，巨噬細(xì)胞作為先天性免疫細(xì)胞參與其中并發(fā)揮了重要的作用。但是，SjHMGB1是否能夠在體內(nèi)活化宿主巨噬細(xì)胞，從而形成有利于機(jī)體的以Th1為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的免疫保護(hù)環(huán)境，尚需我們進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究檢測(cè)SjHMGB1刺激小鼠巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞表面的MHC-Ⅱ分子的表達(dá)量顯著增高，初步提示SjHMGB1蛋白刺激可使巨噬細(xì)胞活化，顯示抗原提呈功能。

Toll受體TLR是參與固有免疫的一類重要受體，也是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁，廣泛分布于各類免疫細(xì)胞，其中TLR2、TLR4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面，其配體多是病原相關(guān)分子模式（PAMPs）。單核巨噬細(xì)胞表面的TLR與PAMPs作用后，啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)，為巨噬細(xì)胞的成熟提供信號(hào)，增強(qiáng)其吞噬殺菌能力，同時(shí)釋放一系列細(xì)胞因子引起炎癥反應(yīng)和參與免疫調(diào)節(jié)[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞表面TLR4上調(diào)表達(dá)，TLR2下調(diào)表達(dá)，提示 SjHMGB1蛋白活化巨噬細(xì)胞可能是通過TLR4受體介導(dǎo)的途徑。

已有研究表明在致炎性的M1型巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體CCR7呈現(xiàn)高表達(dá)，它能夠使免疫細(xì)胞被募集到靶器官如肺部或者引流淋巴結(jié)等部位，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，活化其他細(xì)胞等作用，對(duì)誘導(dǎo)宿主保護(hù)性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，SjHMGB1蛋白刺激后可使巨噬細(xì)胞表面的CCR7上調(diào)表達(dá)，提示蛋白刺激后，巨噬細(xì)胞可能具有致炎性的M1型巨噬細(xì)胞的功能。

活化的巨噬細(xì)胞能夠合成和分泌大量的細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)。有關(guān)研究表明TNF-α是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的細(xì)胞因子，在炎癥發(fā)生的早期，作為重要的早期促炎因子，參與了固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TNF-α能夠?qū)е卵仔约?xì)胞浸潤以及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的殺傷作用。IL-10是重要的抑炎細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化。因此，通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的情況就可以初步推斷巨噬細(xì)胞的功能活性。本研究通過ELISA檢測(cè)蛋白刺激巨噬細(xì)胞分泌到胞外的TNF-α和IL-10的含量，發(fā)現(xiàn)蛋白刺激能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌，而對(duì)IL-10的分泌無顯著差異，初步提示蛋白刺激可以使巨噬細(xì)胞的功能成熟。

活化的巨噬細(xì)胞不僅能夠分泌細(xì)胞因子，還能夠分泌NO。有研究顯示由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO在殺滅肺期血吸蟲童蟲時(shí)起重要作用[16]。因此，通過測(cè)定蛋白刺激巨噬細(xì)胞分泌的NO的含量變化可以反映巨噬細(xì)胞的功能活化狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)SjHMGB1蛋白能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞NO的分泌，提示巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)功能被活化。但是輻照致弱日本血吸蟲來源的SjHMGB1分子在宿主體內(nèi)是否也能夠通過巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO來消除肺期的日本血吸蟲童蟲，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果初步表明SjHMGB1能夠通過TLR4通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型及功能成熟，并誘導(dǎo)其向致炎性的M1型巨噬細(xì)胞分化，為形成以Th1為優(yōu)勢(shì)應(yīng)答的炎性環(huán)境創(chuàng)造了條件。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明SjHMGB1在輻照致弱血吸蟲（RAV）誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的高保護(hù)性免疫效應(yīng)中所發(fā)揮的作用及機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

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PRELIMINARY STUDY ON THE ACTIVATION OF MACROPHAGOCYTES BY HIGH MOBILITY GROUP BOX1 PROTEIN OF SCHISTOSOMA JAPONICUM

LI Dan-dan1,2, MA Li-zhen1, YUAN Chun-Xiu1, SHI Xiao-na1,2, AI Min1, TA Na1, FENG Xin-gang1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China)

This study aimed at determining the activation of high mobility group box1 protein (SjHMGB1)of Schistosoma japonicum on mouse macrophagocyte. When Recombinant SjHMGB1 protein from eukaryotic cell expression system was incubated with macrophage for 48 h, the expression of macrophage surface molecules and chemokine receptors were detected by fl ow cytometry. TNF-α and IL-10 in the culture supernatant were detected by ELISA, and the content of NO in supernatant was assayed by Griess method. Results showed that, compared with the control group, the expression levels of MHC-Ⅱmolecules, TLR4 receptor and chemokine receptor CCR7 on the surface of macrophage stimulated by SjHMGB1 group were signifi cantly increased (P ＜ 0.01), while TLR2 receptor was signi fi cantly decreased (P＜0.05). The results of test by ELISA demonstrated that SjHMGB1 could stimulate the secretion of infl ammatory factor TNF-α, and fail to promote the release of IL-10 on macrophage. The result of test using Griess method showed that SjHMGB1 could promote the secretion of NO on macrophage. The data suggest that SjHMGB1 could activate mouse macrophages via TLR4 andinduce macrophages to undergo M1-type infl ammatory polarization.

Schistosoma japonicum; high mobility group box1 protein; macrophagocyte; TLR；cytokine

S852.735

A

1674-6422（2017）01-0059-07

2016-02-02

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物血吸蟲病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金

李丹丹，女，碩士研究生，動(dòng)物學(xué)專業(yè)

馮新港，E-mail:xingangf62@aliyun.com