1株大分子有機物降解菌的分離、鑒定及酶學(xué)分析

杜東霞+汪彬

摘要：通過平板培養(yǎng)法從高溫堆肥中分離篩選出1株高溫高效大分子有機物降解菌W-10。W-10具有同時分解纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉等大分子有機物的能力。該菌株的生長特性表明，在pH值為5.0、溫度為50 ℃時，羧甲基纖維素酶（CMCase）、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性達到最高值，分別為144.75、97.51、83.85 U/mL。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，綜合形態(tài)特征和16S rDNA基因序列同源性分析，將該菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：高溫堆肥；大分子有機物；芽孢桿菌屬；W-10

中圖分類號： X172文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0268-03

我國是農(nóng)業(yè)大國，年產(chǎn)各類秸稈約8.0億t，占世界秸稈總量的1/5左右。這些秸稈除了一部分用于飼料、造紙、紡織和燃料加工外，其余均作為農(nóng)業(yè)廢棄物丟棄或就地焚燒，不僅浪費了寶貴的資源，同時也污染了生存環(huán)境[1-2]。

通過高溫堆肥降解農(nóng)業(yè)廢棄物是資源化利用的良好途徑之一。高溫堆肥是一種利用各種微生物高溫高效降解有機廢棄物，并產(chǎn)生穩(wěn)定的最終產(chǎn)物的過程。高溫堆肥可有效促進纖維素廢棄物的資源化利用，并降低農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的污染。在堆肥發(fā)酵過程中，為縮短發(fā)酵周期及提高堆肥質(zhì)量，以人為方式添加一些高溫微生物，高溫微生物產(chǎn)生的熱穩(wěn)定酶可將基質(zhì)中的纖維素及木質(zhì)素分解，并產(chǎn)生大量的能量和熱量，不僅可以將農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為有機肥，而且可以有效抑制堆肥中有害病原菌的孶生。在堆肥基質(zhì)中，除了纖維素外，還有其他蛋白質(zhì)及糖類的存在，應(yīng)深入研究并充分利用高溫微生物對纖維素、蛋白質(zhì)及糖類等大分子有機物的降解作用，加速農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為有機肥。因此，開展堆肥高溫微生物的研究具有重要的意義[3-5]。

[JP2]本研究從堆肥中篩選出能夠高效降解纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉的高溫菌株，并對其酶活性進行測定，目的在于為高效降解大分子有機物菌株的選育和相關(guān)酶制劑開發(fā)提供菌種資源。[JP]

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品采集

豬糞、城市生活垃圾及秸稈自然堆肥，堆體溫度上升到55 ℃時，采集中層樣品于無菌器皿中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基

（1）分離初篩培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，水1.0 L，pH值為7.2～7.4。

（2）大分子有機物降解復(fù)篩培養(yǎng)基.

羥甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na培養(yǎng)基）：CMC-Na 15 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 01 g/L、NaCl 6.0 g/L、CaCl2 0.1 g/L，固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂，加蒸餾水補至1 L、pH值為7.0～7.5，壓力為 1.05 kg/cm2、滅菌25 min。

（3）剛果紅纖維素鑒定培養(yǎng)基。（NH4）2SO4 0.2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaCl 0.05%、CMC-Na 2%、剛果紅0.02%、瓊脂2%、pH值自然。

1.1.3主要儀器試劑

DNA Marker[寶生物工程（大連）有限公司]；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；Taq聚合酶[寶生物工程（大連）有限公司]；PCR儀（Mastercyclerpro）（Eppendorf公司）；Gel Doc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試驗方法

1.2.1菌種篩選

（1）菌種的分離與初篩。

[JP2]采取樣品經(jīng)剪碎、研細后，稱取1 g放入裝有99 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，靜置；用移液管吸取1 mL上清液于含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻后，梯度稀釋到10-3～10-7，吸取0.3 mL后3個稀釋度的試樣涂布于羥甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基上，在50 ℃條件下可生長的菌落即具有纖維素分解酶能力，再從中挑選出菌落進行進一步劃線分離。[JP]

（2）菌種的復(fù)篩。將具有纖維素分解酶能力的菌株涂布于剛果紅初篩培養(yǎng)基上，經(jīng)72 h培養(yǎng)，分別測定水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），并計算D/d值（即HC值）。挑取生長速度快且HC值大的菌株，再將HC值大的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液即粗酶液，測CMC酶活性，選出CMC酶活性高產(chǎn)菌株，作為復(fù)篩菌株。

1.2.2酶活的測定方法

羧甲基纖維素酶（CMC酶，簡稱CMCase）活性的測定：

參照文獻[6]略作改進，1 mL 用 0.1 mol/L pH值為4.8的檸檬酸緩沖液配制的質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC-Na溶液，加入0.5 mL適當稀釋的酶液，于50 ℃反應(yīng)30 min后，加入1.5 mL二硝基水楊酸（DNS）試劑終止反應(yīng)，沸水浴中煮沸5 min，稀釋定容至25 mL，在530 nm下測定吸光度，按DNS法測定糖濃度。1個酶活性單位（IU）定義為1 min催化底物水解生成1 μg葡萄糖所需的酶量。以100 ℃水浴中滅活10 min的粗酶液為空白對照。

微晶纖維素酶活性測定：

吸取1.0 mL 10 g/L微晶纖維素懸浮液（稱取1.000 g微晶纖維素，加0.05 mol/L pH值為48檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解，稀釋定容至100 mL）和0.5 mL適當稀釋的酶液，50 ℃保溫1 h，離心后，取1.0 mL上清液用DNS法測還原糖生成量[7]。

β-葡萄糖苷酶活性測定：

取0.1 mL適當稀釋的酶液，加入到1 mL 1%水楊酸溶液中（以0.05 mol/L pH值為5.0檸檬酸緩沖液配制），50 ℃恒溫水浴中酶解30 min，DNS法測定還原糖濃度[8]。

α-淀粉酶活性測定：

吸取1 mL 10 g/L可溶性淀粉（稱取1.000 g淀粉溶于100 mL 0.1 mol/L pH值為5.6檸檬酸緩沖液中），0.5 mL酶液，DNS法測定麥芽糖生成量。酶活性定義為1 g干曲1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成的麥芽糖毫克數(shù)，即 mg/（g·min）[7]。

蛋白質(zhì)酶活性測定：

采用Folin-酚法[9-10]測定蛋白酶的活性。酶活定義：1 mL 酶液在一定pH值和溫度下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生 1 μg 酪氨酸的酶量為1個酶活性單位（U/mL）。[JP]

1.2.3菌種鑒定

形態(tài)鑒定：

將純化的細菌劃線接種于牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基上，50 ℃ 培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、表面及邊緣等特征。采用革蘭氏染色和芽孢染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形狀、芽孢及著生特點。

分子鑒定：

提取DNA后，對16S rDNA目的片斷進行PCR擴增[11]。引物序列：F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：去離子水39 μL，PCR buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫中比對，選擇同源性高的序列使用MEGA 5.2軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1W-10的分離和初步鑒定

試驗分離得到大量具有較好纖維素分解能力的細菌、真菌和放線菌類菌株，其中W-10為1株生長較快且具有較高纖維素分解能力的細菌菌株。將接種有W-10的復(fù)篩平板培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后，用0.1%剛果紅水溶液浸染15 min，再用1 mol/L NaCl水溶液脫色，剛果紅可將未被降解的CMC染成紅色，而接種有W-10菌落處形成了透明的水解圈，初步表明W-10具有較好的纖維素分解能力。

2.2W-10的CMCase活性分析

將W-10菌株接種到以CMC-Na為唯一碳源的限制性液體培養(yǎng)基上，在50 ℃、不同pH值（pH值分別為4、5、6、7、8、9、10）條件下培養(yǎng)72 h，按照DNS法測定菌株的羧甲基纖維素酶活性。圖2結(jié)果表明，W-10菌株的羧甲基纖維素酶活性的pH值適應(yīng)范圍較寬，在pH值為5時達到最高值14475 U/mL，并在pH值為 5～8范圍內(nèi)均保持較高水平。

2.3纖維素分解酶活性分析

將菌株W-10接種于羧甲基纖維素鈉液態(tài)培養(yǎng)基上，50 ℃ 培養(yǎng)72 h，取其粗酶液測定菌株的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶的酶活性。結(jié)果表明，在50 ℃時，菌株 W-10的CMCase、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶3種酶活性均較高，分別為（144.75±0.12）、（94.11±0.15）、（80.55±0.08） U/mL。

2.4蛋白質(zhì)降解酶和α-淀粉降解酶活性分析

在堆肥基質(zhì)中，除了纖維素外，還有其他的糖類及蛋白質(zhì)存在，因此，研究該菌株對多種大分子有機物的降解能力具有重要意義。將所選定的W-10菌株于50 ℃培養(yǎng)72 h后，將其粗酶液進行纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶活性的研究。

由圖3可知，50 ℃培養(yǎng)72 h后，W-10菌株纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶的酶活性分別達到144.75、97.51、83.85 U/mL，其中以纖維素降解酶的活性最高。

2.5菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.5.1菌株的形態(tài)鑒定

2.5.1.1菌株的菌落與形態(tài)特征

將菌株W-10接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，該菌菌落呈圓形、白色、表面粗糙褶皺、邊緣不整齊。油鏡下觀察，菌體呈短桿狀、末端鈍圓、有芽孢、呈橢圓狀，位于菌體中央或稍偏，革蘭氏染色陽性。

2.5.1.3菌株的16S rDNA序列分析

如圖4所示，W-10菌株與枯草芽孢桿菌相似性最高，結(jié)合W-10菌株的菌落形態(tài)特征和生理生化特性，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌。

3結(jié)論與討論

高溫堆肥是利用不同微生物間的協(xié)同作用，將復(fù)雜的大分子有機物降解為細胞可以吸收利用的小分子物質(zhì)，并釋放出CO2、能量和熱量的過程。在高溫堆肥過程中，高溫高效纖維素降解菌株對堆肥物料的分解起著至關(guān)重要的作用。本研究采用纖維素剛果紅平板透明圈篩選法，從高溫堆肥物料中分離、純化、篩選出1株高溫菌W-10，該菌株具有同時分解淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素等大分子有機物的能力。在pH值為5.0和溫度為50 ℃時，羧甲基纖維素酶、蛋白酶和α-淀粉酶的酶活性達到最高值，分別為144.75、97.51、83.85 U/mL，并且具有很好的熱穩(wěn)定性。將測得的16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，綜合形態(tài)特征和16S rDNA基因序列同源性分析，將該菌株初步鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株繁殖能力強、作用溫度范圍廣、熱穩(wěn)定性好、作用底物廣泛，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，又是自然界中廣泛存在的非致病細菌，對人畜無害，不污染環(huán)境，所以高效高溫菌W-10具有良好的研究和應(yīng)用前景。

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