廣西不同產(chǎn)地三葉青中總黃酮含量分析

黎穎菁+付金娥+韋樹根+潘麗梅

摘 要：【目的】 研究三葉青不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)年限和部位總黃酮含量，為廣西三葉青的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎米贤夥止夤舛扔?jì)法測(cè)定總黃酮含量?！窘Y(jié)果】不同產(chǎn)地三葉青薯塊中總黃酮含量存在著較大差異；三葉青薯塊總黃酮含量隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而不斷上升；不同部位之間總黃酮含量差異顯著，以薯塊的總黃酮含量最高?！窘Y(jié)論】評(píng)價(jià)出廣西三葉青生產(chǎn)的最佳產(chǎn)地及采收方法與部位。

關(guān)鍵詞：三葉青 總黃酮

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum），為葡萄科崖爬藤屬植物，其塊根稱為蛇附子。異名：有角烏蘞莓、石老鼠、石猴子、石抱子、搜夾風(fēng)、三葉扁藤、絲線吊金鐘、金絲吊葫蘆、金線吊馬鈴薯等[1]。三葉青主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，生于陰濕山坡、山溝或溪谷旁林下，以塊根或全草入藥，為民間常用的中草藥，具有抗癌抗腫瘤[2-3]、抗炎、鎮(zhèn)痛與解熱[4]、保肝[5-6]等作用，且毒副作用小，是西藥無(wú)法代替的“植物抗生素”。臨床上已廣泛用于抗癌及抗艾滋病毒、抗腫瘤等疾病。近年來(lái)，我國(guó)有多個(gè)中藥廠都在使用三葉青作原料生產(chǎn)中成藥，如三葉青膠囊、三葉青沖劑、三葉青茶等并且其需求量呈大幅度增長(zhǎng)趨勢(shì)，市場(chǎng)的需求引起人們對(duì)三葉青研究的日益重視。本研究以來(lái)源于廣西樂業(yè)縣、田林縣、西林縣等的9份種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，研究了三葉青不同產(chǎn)地及不同生長(zhǎng)年限和部位總黃酮含量，研究結(jié)果將為三葉青的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)三葉青的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理、臨床等方面，而在資源、栽培等方面的研究則相對(duì)較少。韋樹根等對(duì)廣西三葉青的資源狀況進(jìn)行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)廣西三葉青的野生資源已瀕臨滅絕[7]；程良綏介紹了三葉青的生物學(xué)特性，并從選地與整地、育苗、種植、林地管理、病蟲害防治、采收等方面總結(jié)三葉青林下栽培技術(shù)[8]；吉慶勇等觀察了三葉青形態(tài)特征和生長(zhǎng)發(fā)育特性[9]；錢麗華等以三葉青葉片誘導(dǎo)的愈傷組織為試材，接種繼代增殖，進(jìn)行不同溫度和光周期培養(yǎng)試驗(yàn)[10]；總黃酮含量測(cè)定研究方面，吉慶勇等采用紫外可見分光光度法測(cè)定了人工種植和野生三葉青中黃酮的含量，分析結(jié)果表明，兩者含量沒有顯著差異[11]；范世明等也是采用紫外分光光度法對(duì)福建不同產(chǎn)地三葉青的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西是三葉青的主要產(chǎn)區(qū)之一， 但目前為止未見有對(duì)廣西不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)年限及不同部位總黃酮含量比較的研究。因此本研究主要對(duì)廣西主產(chǎn)區(qū)的三葉青種質(zhì)資源進(jìn)行總黃酮含量比較研究，同時(shí)測(cè)定三葉青不同生長(zhǎng)年限和不同部位的總黃酮含量，旨在為廣西三葉青資源的開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以采集于廣西西林、田林、隆林、樂業(yè)、凌云、宜州、環(huán)江、羅城、馬山等縣的9份三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）的種質(zhì)資源試驗(yàn)材料。

1.2 儀器與試劑

Cary 50型可見-紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Varian公司；MARS-5型高壓微波消解儀，美國(guó) CEM公司；CP224S型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；CP225D型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；蘆丁，中國(guó)藥品生物制品檢定所，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試品的制備

精密稱取不同產(chǎn)地、不同年份、不同部位的供試品0.5 g（精確至0.001 g）于100 mL三角瓶中，分別加入60 %乙醇溶液25 mL，在85 ℃恒溫水浴鍋上加熱回流提取2 h，取出冷卻，過濾，用60 %酒精反復(fù)清洗殘?jiān)瑸V液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，加60 %乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg（精確至0.0001 g），放入燒杯中，加入乙醇適量，置于水浴鍋上微熱使其溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，用60 %乙醇定容至刻度，搖勻，其得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.2 mg/mL。

1.3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取一定量1.2.2和1.2.3項(xiàng)下制備的供試液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于25 mL容量瓶中，各加50 %乙醇溶液至6 mL，加5 %亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加入10 %硝酸鋁1 mL，搖勻，靜放6 min，再加10 %氫氧化鈉10 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置15 min于200～800 nm波長(zhǎng)區(qū)間掃描吸收曲線，供試品溶液在500 nm處有最大吸收，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸收曲線相似，故選用500 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制備，于500 nm處測(cè)定其吸光度（X）， 以試劑空白調(diào)零。以吸光度（X）為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法精密度

取0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按‘1.3.3中方法操作制備，于500 nm處連續(xù)測(cè)定其吸光度7次，計(jì)算7次吸光度的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

將田林產(chǎn)三葉青（塊根）供試品分成等量的7份，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。按照“1.3.3”中方法制備樣品，測(cè)定其吸光度，利用回歸方程計(jì)算7份三葉青樣品中游離氨基酸含量，并計(jì)算7次游離氨基酸的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取田林產(chǎn)三葉青供試液2.0 mL置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制備樣品，每隔20、40、60、80、100、120 min測(cè)定其吸光值。

1.3.8 樣品的測(cè)定

精密量取適量的供試液（三葉青莖、葉提取液各5 mL，塊根提取液各2 mL），分別置于25 mL容量瓶中，按照“1.3.3”中方法制備樣品，于500 nm處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系

由圖1，蘆丁在8～48 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為Y=0.0668X-0.0003，R2=0.9999。

2.2 方法精密度

從表1可知，7次蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度的變化幅度不大，其RSD為0.36 %，說明該方法的精密度良好。

2.3 方法的重復(fù)性

從表2可知，7次測(cè)定田林產(chǎn)三葉青中總黃酮的含量變化不大，其RSD為0.76 %，說明實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.4 供試液的穩(wěn)定性

從表3可知，樣品溶液在1.5 h內(nèi)的吸光度變化不大，其RSD為0.68 %，說明供試樣品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 不同產(chǎn)地總黃酮含量比較

2010年10月，把收集到的種質(zhì)資源種植于種質(zhì)圃內(nèi)，進(jìn)行統(tǒng)一管理。2013年2月每一種質(zhì)采挖10株，每株采挖3個(gè)薯塊，混合曬干后測(cè)定各種質(zhì)總黃酮含量。各種質(zhì)的總黃酮含量見表4。從表4可以看出，不同產(chǎn)地三葉青的總黃酮含量存在著較大差異。百色地區(qū)其中總黃酮含量較高，最高是來(lái)源于田林縣，其含量為4.79 %；含量最低的來(lái)源于環(huán)江縣為2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。

2.6 不同生長(zhǎng)年限

以來(lái)源于廣西樂業(yè)縣的種質(zhì)為材料，在植株生長(zhǎng)的不同時(shí)期采其薯塊測(cè)定總黃酮的含量，總黃酮的含量的動(dòng)態(tài)變化如圖2。根據(jù)圖2可以看出，三葉青塊莖總黃酮含量隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而不斷上升，總黃酮累積速度最快的是第1年、第2年，第3年以后總黃酮累積速度開始變慢，四年生薯塊總黃酮含量分別是一年生、二年生、三年生的2.32、1.35、1.08倍。

2.7 不同部位總黃酮含量

以廣西樂業(yè)縣3年生三葉青為研究材料，采收同一單株上的葉片、藤莖、塊莖曬干至恒重，分別測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果見表5。從表5可以看出，同一植株上不同的部位其總黃酮含量差異顯著。以塊莖的總黃酮含量最高，藤莖次之，葉片的最低。塊莖總黃酮的含量分別是藤莖和葉片的8.38和5.65倍。

3 討論

研究結(jié)果表明，在9份三葉青種質(zhì)資源中，不同種質(zhì)之間薯塊的總黃酮含量有較大的差異，來(lái)源于百色地區(qū)的田林縣、樂業(yè)縣、凌云縣的種質(zhì)資源總黃酮含量總體上比來(lái)源于河池地區(qū)的宜州市、環(huán)江縣、羅城縣的總黃酮含量高。其中總黃酮含量最高是來(lái)源于田林縣，其總黃酮含量為4.79 %；含量最低的來(lái)源于環(huán)江縣，其總黃酮含量為2.89 %，最高含量是最低含量的1.66倍。范世明等對(duì)福建不同產(chǎn)地三葉青的總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，但其測(cè)定主要是福建和浙江地區(qū)的樣品，其研究結(jié)果表明各個(gè)產(chǎn)地的三葉青根總黃酮含量存在明顯差異，與本研究結(jié)果一致[7]。說明三葉青總黃酮的變異幅度較大，在遺傳育種上有較大的潛力，通過種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及優(yōu)良品種的選育可選育出適合于生產(chǎn)的優(yōu)良品種。三葉青塊莖總黃酮含量隨著生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而不斷上升，但第3年至第4年的增長(zhǎng)幅度較小，因此在生產(chǎn)上如產(chǎn)量達(dá)到要求，三年生的三葉青即可采收。此外，本文還對(duì)三葉青的不同部位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)藤莖和葉片總黃酮含量也較高，但塊莖的總黃酮含量顯著高于藤莖和葉片。不同生長(zhǎng)年限和不同部位的總黃酮含量的研究，可為三葉青的采收提供科學(xué)的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家中藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草，第l3卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：296-298.

[2] 鐘良瑞，魏克民. 三葉青黃酮對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制與MAPKs通路關(guān)系的研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30（1）：101-104.

[3] 李華美，浦錦寶，鄭軍獻(xiàn)，等. 三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠Lewis肺癌移植性腫瘤的抑制作用及免疫功能的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2012，19（3）：229-230.

[4] 黃真，毛慶秋，魏佳平.三葉青提取物抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)新藥雜志，2005，14（7）：861-864.

[5] 楊雄志，巫軍. 三葉青提取物抗乙肝病毒活性的研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（4）：294-296.

[6] 楊雄志. 三葉青對(duì)小鼠免疫性肝損傷保護(hù)作用的研究[J]. 實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2008，8（2）：88-89.

[7] 韋樹根，董青松，韋瑩，等. 廣西瀕危珍稀中藥材三葉青資源調(diào)查研究[J]. 北方園藝，2011， 21：162-164.

[8] 程良綏.藥用植物三葉青的生物學(xué)特性及林下栽培技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（14）：187- 188.

[9] 吉慶勇，程文亮，吳華芬，等. 三葉青生物學(xué)特性研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（1）：219- 221.

[10] 錢麗華，毛碧增.光溫條件對(duì)三葉青愈傷生長(zhǎng)及黃酮積累的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（9）：1098-1100.

[11] 吉慶勇，華金渭 ，程文亮，等. 人工種植和野生三葉青中總黃酮含量的比較[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（1）：37-38.

[12] 范世明，林 婧，許文，等. 不同產(chǎn)地三葉青中總黃酮含量的比較[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，23（3）：44-45.