一種長期培養(yǎng)人神經(jīng)干細胞的新方法

陳世明，章瑾，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

一種長期培養(yǎng)人神經(jīng)干細胞的新方法

陳世明，章瑾，宣丹英，毛鐘鳴，陳鵬翾

神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能。神經(jīng)干細胞的移植對治療神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病都有直接或間接的作用[1-3]，臨床研究和應(yīng)用對神經(jīng)干細胞的需求日益迫切。但由于技術(shù)原因，神經(jīng)干細胞在體外的培養(yǎng)存在易分化和易死亡的技術(shù)難題。目前，神經(jīng)干細胞的獲取途徑主要是從多個胚胎或流產(chǎn)胎兒中分離并進行有限的培養(yǎng)擴增，但胚胎或胎兒源的貧乏及各胚胎或流產(chǎn)胎兒之間的差異性使得神經(jīng)干細胞來源混雜，無法達到標準化，成為神經(jīng)干細胞臨床化的重要限制因素。本實驗從流產(chǎn)胎兒中分離出神經(jīng)干細胞，并在體外長期規(guī)?；囵B(yǎng)、擴增，為神經(jīng)干細胞的研究提供穩(wěn)定的、用之不竭的細胞來源，為臨床神經(jīng)干細胞移植奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基購自美國 Hyclone 公司；重組人表皮細胞生長因子（rhEGF）、重組人堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF）、B27 添加劑、N2 Supplement、TP-EDTA均購自美國 Gibco 公司；肝素鈉和胰酶抑制劑購自美國Sigma 公司；慶大霉素購自上?，F(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司；其他實驗材料有巢蛋白、多聚賴氨酸、維生素 E、腐胺、亞硒酸鈉、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、L-谷氨酰胺、維生素 C 葡萄糖苷。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 取 1000 ml DMEM/F-2（1∶1）培養(yǎng)基，加入 5.9 g 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）攪拌均勻，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，使溶液 pH 值控制在 7.0～7.1，分別加入 200 μg 肝素鈉、30 μg 維生素 E、25 mg 重組人胰島素、1.6 mg 腐胺、6 μg 亞硒酸鈉、5.5 mg 人轉(zhuǎn)鐵蛋白、7 μg 黃體酮、300 mg L-谷氨酰胺、20 μg rhEGF、20 μg rhbFGF、50 mg 維生素 C 葡萄糖苷、40 000 IU 慶大霉素，混勻。

1.2.2 神經(jīng)干細胞的分離 取孕 16周的人流胎兒腦組織，在無菌條件下分離出海馬組織，D-Hank’s液清洗，眼科剪剪成小組織塊，加入 0.25% 的 TP-EDTA 消化 10 min，胰酶抑制劑終止其消化。用 100 目不銹鋼細胞過濾篩過濾，去除大組織塊，離心收集沉淀細胞。將沉淀細胞重懸于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，制成單細胞懸液。

1.2.3 神經(jīng)干細胞原代培養(yǎng) 經(jīng)過細胞計數(shù)后以（1～2）×106/ml 接種到 T75 細胞培養(yǎng)瓶中。將細胞培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天觀察細胞生長狀態(tài)，3～4 d 半量更換神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基一次。

1.2.4 神經(jīng)干細胞傳代培養(yǎng) 神經(jīng)干細胞在培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng) 20～30 d，神經(jīng)干細胞球直徑為 500～1000 μm 時，把含有干細胞球的培養(yǎng)基用 200 ml 注射器吸出，經(jīng)干細胞球切割器（不銹鋼篩網(wǎng)）切割，將每個大的神經(jīng)干細胞球切割成 3～8 小塊（直徑 30～200 μm），將小塊干細胞球放入新的培養(yǎng)瓶中，并加入一半新配置的培養(yǎng)液，按 1∶2 或者 1∶4 比例分瓶傳代培養(yǎng)。按這種方法可以連續(xù)擴增培養(yǎng)人神經(jīng)干細胞 2 年以上。

1.2.5 神經(jīng)干細胞球的鑒定 取連續(xù)培養(yǎng) 30 個月的神經(jīng)干細胞球懸液滴于經(jīng)多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，置 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，使細胞黏附于載玻片上。室溫下 4% 多聚甲醛和 0.3% 戊二醛固定 15 min。DPBS 緩沖液漂洗3 次后，用含 5% 正常山羊血清的 DPBS（含 0.1% TritonX-100）在 37 ℃ 溫育 30 min 進行封閉。吸去封閉液，加抗人巢蛋白單克隆抗體，37 ℃ 溫育 3 h 后，用含 0.1% TritonX-100 的 DPBS 漂洗 3 次，各 10 min。加偶聯(lián)Rodamine 的第二抗體，37 ℃ 溫育 45 min。吸去第二抗體反應(yīng)液，用 DPBS 漂洗 3 次，用封片液封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并記錄照相。

1.2.6 神經(jīng)球細胞爬片的制備和分化鑒定 取培養(yǎng) 30 個月的神經(jīng)干細胞球，直接吹打或用 0.25% TP-EDTA 溶液消化制成單細胞懸液。細胞計數(shù)后以 5×104/片密度種于經(jīng)100 mg/ml 多聚賴氨酸包被的玻璃蓋玻片上，在 DMEM/F12培養(yǎng)基中添加 2% 胎牛血清，B27 添加劑（1∶50 稀釋），撤除生長因子（EGF、bFGF）進行分化培養(yǎng)。8 d 后進行免疫熒光細胞化學(xué)染色。熒光顯微鏡下觀察并記錄照相。

2 結(jié)果

2.1 原代活細胞形態(tài)學(xué)觀察

初分離的單細胞在倒置顯微鏡下觀察，大多為單個圓形亮球狀，沒有細胞突起，折光性好。培養(yǎng) 2～3 d 后，形成多個細胞組成的細胞團，形狀不規(guī)則，大小不一。10 d 以后，可見數(shù)十甚至上百個細胞組成的細胞球，形態(tài)成圓形或者橢圓形（圖 1A），且數(shù)量越來越多，體積越來越大。100 倍鏡下放大觀察，可見細胞團周邊細胞較亮，中間區(qū)域細胞密度高，透光性差（圖 1B）。

2.2 細胞切割傳代前后形態(tài)學(xué)觀察

連續(xù)培養(yǎng) 15～20 d 后，神經(jīng)干細胞球為 500～1000 μm（圖 2），傳代時，本實驗采用自制的干細胞球切割器，將大的神經(jīng)干細胞球切割成大小不一的 3～8 小塊（圖 2A1 ～A4）。將小塊干細胞球放入新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng) 5～7 d 后，小細胞團塊呈不規(guī)則形狀（圖 2B1～B4）。繼續(xù)培養(yǎng)至 15 d左右，細胞團塊逐漸增大，成為圓形或者橢圓形的神經(jīng)球（圖 2C1～C4）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察人神經(jīng)干細胞球（A：×40；B：×100；C：×200；D：×400）

圖2 切割傳代后神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)不同時期的形態(tài)變化[A1：切割后 1 d 細胞團塊（×40）；A2：切割后 1 d 細胞團塊（×100）；A3：切割后 1 d 細胞團塊（×200）；A4：切割后 1 d 細胞團塊（×400）；B1：切割后 7 d 細胞團塊（×40）；B2：切割后 7 d 細胞團塊（×100）；B3：切割后 7 d 細胞團塊（×200）；B4：切割后 7 d 細胞團塊（×400）；C1：切割后15 d 細胞團塊（×40）；C2：切割后 15 d 細胞團塊（×100）；C3：切割后 15 d 細胞團塊（×200）；C4：切割后 15 d 細胞團塊（×400）]

2.3 神經(jīng)干細胞的免疫熒光染色鑒定

經(jīng) 24 個月培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞黏附于蓋玻片上。經(jīng)巢蛋白免疫熒光染色后，均呈陽性表達（圖 3）。

2.4 神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元細胞的免疫熒光鑒定

誘導(dǎo)分化第 8 天進行 β 微管蛋白染色，結(jié)果呈陽性（圖 4）。

2.5 神經(jīng)干細胞分化為星型膠質(zhì)細胞的免疫熒光鑒定

培養(yǎng) 30 個月的人神經(jīng)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后第 8 天進行 GFAP 染色，結(jié)果呈陽性（圖 5）。

2.6 神經(jīng)干細胞分化為少突膠質(zhì)細胞的免疫熒光鑒定

培養(yǎng) 30 個月的人神經(jīng)干細胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后第 8 天進行 O4 染色，結(jié)果均呈陽性（圖 6）。

圖3 神經(jīng)干細胞巢蛋白免疫熒光染色[A：12 個月（×100）；B：24 個月（×100）；C：30 個月（×100）；D：30 個月（×400）]

圖4 誘導(dǎo)分化 8 d 后形成的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的免疫熒光染色鑒定（×400）

圖5 誘導(dǎo)分化 8 d 后形成的星型膠質(zhì)細胞（箭頭所示）的免疫熒光染色鑒定（A：×100；B：×400）

圖6 誘導(dǎo)分化 8 d 后形成的少突膠質(zhì)細胞（箭頭所示）的免疫熒光染色鑒定（A：×100；B：×400）

3 討論

神經(jīng)干細胞的研究和應(yīng)用是以成功的神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)為基礎(chǔ)的，獲得高純度、高產(chǎn)量的神經(jīng)干細胞是其臨床工程化的關(guān)鍵[4]。傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)法[5]利用多聚賴氨酸等分子進行瓶底包被，使神經(jīng)干細胞在瓶底進行擴增培養(yǎng)。但在培養(yǎng)過程中，因外界微環(huán)境的不穩(wěn)定，貼壁的神經(jīng)干細胞會趨向分化，無法長期穩(wěn)定培養(yǎng)。傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)法[6]中，神經(jīng)球在其增大過程中會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)、抑制分化因子和代謝廢物無法順利傳輸，導(dǎo)致中心神經(jīng)細胞壞死或分化，故通過將大的神經(jīng)球分離成小神經(jīng)球以促使其繼續(xù)生長，達到擴增的目的。在分離大神經(jīng)球時，傳統(tǒng)方法采用胰酶消化或機械吹打，易造成細胞損傷或分離不徹底[7]。本實驗中，采用自制干細胞球切割器分離細胞球，既能夠避免胰酶消化帶來的損傷，也能使分離的小細胞球大小更為一致，尤其對神經(jīng)干細胞的臨床工程化具有重大作用。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，本實驗培養(yǎng)基中添加了肝素、慶大霉素、維生素 E、維生素 C 葡萄糖苷、亞硒酸鈉和黃體酮等成分，在調(diào)節(jié)干細胞生長增殖和抑制其分化方面，發(fā)揮重要作用[8-9]。肝素能與許多生長因子結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，既可保持生長因子的活性，防止其因外界微環(huán)境的變化而失活或降解[10-11]，同時也可減緩生長因子的釋放，促進細胞增殖[12]。維生素 E 對神經(jīng)元損傷有保護作用，除了通過抗氧化機制發(fā)揮作用外，還可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)酶活性機制及調(diào)控相關(guān)基因表達發(fā)揮作用。維生素 C 葡萄糖苷是維生素 C的衍生物，不但能有效保護維生素 C 的活性，還擁有更好的溶解性、耐熱性和穩(wěn)定性。維生素 C 和維生素 E 配合使用，能產(chǎn)生更好的抗氧化效果，更有效地保護細胞中的DNA、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)不被自由基損傷[13]。胰島素能促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，從而促進細胞分裂、生長。腐胺能夠刺激和誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞生長和增殖。亞硒酸鈉能促進和參與神經(jīng)干細胞代謝。人轉(zhuǎn)鐵蛋白可結(jié)合鐵離子，使神經(jīng)干細胞合理利用鐵離子，并減少其對細胞的毒性，從而維持細胞正常狀態(tài)。黃體酮具有促進神經(jīng)干細胞生長和調(diào)節(jié)作用。HEPES 可維持細胞液中酸堿平衡。本實驗中，通過對培養(yǎng)、傳代方法的改進和對培養(yǎng)基配方的調(diào)整，使人神經(jīng)干細胞能夠在體外長期培養(yǎng)擴增，并保持增殖和分化能力。

巢蛋白是一種中間絲類型的蛋白，在神經(jīng)干細胞早期階段，由神經(jīng)上皮干細胞表達[14-15]，隨著神經(jīng)前體細胞向神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化而終止表達。本實驗中，對分離、培養(yǎng)后的細胞在體外進行巢蛋白免疫組織化學(xué)染色，其結(jié)果均為神經(jīng)干細胞，且在體外分離、傳代培養(yǎng)后，仍具有增殖能力。神經(jīng)干細胞具有分化為神經(jīng)元細胞、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞的能力[16]。β 微管蛋白是神經(jīng)元細胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是神經(jīng)干細胞分化過程中神經(jīng)元的特有標志物。GFAP 是一種單獨存在的 III 型中間絲蛋白，在活化的星型膠質(zhì)細胞中大量特異性表達。O4 是神經(jīng)干細胞分化為少突膠質(zhì)細胞過程中的一種特定標記物。本實驗中，人神經(jīng)干細胞經(jīng)分化后，特異性檢測均表達陽性，且分化后細胞形態(tài)與正常神經(jīng)元細胞和星型膠質(zhì)細胞無明顯差異。β 微管蛋白 III 陽性說明所鑒定的細胞已分化為神經(jīng)元，GFAP 陽性說明所鑒定的細胞已分化為星型膠質(zhì)細胞，O4 陽性說明所鑒定的細胞已分化為少突膠質(zhì)細胞。該結(jié)果表明，神經(jīng)干細胞具有分化為神經(jīng)元細胞和星型膠質(zhì)細胞的能力。在該研究中，神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)時間較其他研究更長，但分化能力并未減弱，從側(cè)面反應(yīng)出該培養(yǎng)方法能夠良好地維持神經(jīng)干細胞的穩(wěn)定性。

神經(jīng)干細胞的體外長期連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)是神經(jīng)干細胞研究及應(yīng)用的重要基礎(chǔ)。神經(jīng)干細胞培養(yǎng)法的優(yōu)化，有利于獲得大量的標準一致的高質(zhì)量神經(jīng)干細胞，為進一步應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)和神經(jīng)退行性疾病的治療打下基礎(chǔ)。

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310018 杭州，浙江奧瑞健生物技術(shù)有限公司

陳世明，Email：1279050771@qq.com

2016-12-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.017