長鏈非編碼RNA在膀胱癌中的研究概況

李其金，鐘麗明

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，廣東 佛山 528200；2.南海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 佛山 528200）

長鏈非編碼RNA在膀胱癌中的研究概況

李其金1，鐘麗明2

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，廣東 佛山 528200；2.南海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 佛山 528200）

隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和基因?qū)用嫔夏[瘤學(xué)研究的深入，曾被忽略、被低估的lncRNA被揭示與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，從不同的生物學(xué)途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與膀胱癌的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等密切相關(guān)。本文將對lncRNA在膀胱癌中的研究概況進(jìn)行綜述。

膀胱癌；長鏈非編碼RNA；lncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2；HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中的最常見惡性腫瘤，在我國腫瘤發(fā)病率排行榜上位居第八位。近年來膀胱癌的治療有一定進(jìn)展，但總體生存期并無明顯提高，5年生存期僅維持在50%～60%[1]。隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和基因?qū)用嫔夏[瘤學(xué)研究的深入，曾被忽略、被低估的lncRNA被揭示，盡管這些RNA不編碼蛋白質(zhì)，但是可從不同的生物學(xué)途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA與膀胱癌的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注，本文就新近研究發(fā)現(xiàn)的幾個與膀胱癌密切相關(guān)的lncRNA作一綜述。

1 基因組的“暗物質(zhì)”，長鏈非編碼RNA概述

lncRNA是一類長度大約200～2000 nt的非編碼RNA，最近幾年日益成為生命科學(xué)領(lǐng)域的新型研究熱點。在哺乳動物基因組中，大約4%～9%的序列可轉(zhuǎn)錄lncRNA，起初被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能，最近發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為小分子RNA（如miRNA、siRNA、piRNA等）的前體分子，也可結(jié)合特定蛋白質(zhì)形成核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，調(diào)控蛋白質(zhì)定位或活性。另外，lncRNA還參與組蛋白修飾、染色體結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄激活或抑制等過程[2]。

2 lncRNA與腫瘤

目前，大多數(shù)lncRNA已被分類。隨著深度測序和芯片技術(shù)的發(fā)展，大量的 lncRNA在腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)。這些lncRNA的再激活或失抑制可能與細(xì)胞永生性及生長不受控制相關(guān)，這表明lncRNA在腫瘤發(fā)病機(jī)制中有著關(guān)鍵的作用[3]。現(xiàn)在認(rèn)為非編碼基因的突變、表觀遺傳學(xué)修飾、在機(jī)體內(nèi)拷貝數(shù)量的改變等，與數(shù)種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。長鏈非編碼RNA異常表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，其異常表達(dá)主要表現(xiàn)如下三個方面：一是一些lncRNA可能僅僅在某些腫瘤中呈特異性表達(dá)；二是很多l(xiāng)ncRNA不僅僅在一種腫瘤中呈過表達(dá)（如MALAT1已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在肺癌、腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤中都存在過表達(dá)）；三是一些腫瘤中可能不止一種lncRNA呈過表達(dá)（例如在前列腺癌中PCGEM1，DD3(PCA3)，PCAF1均發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常）[5]。

3 lncRNA與膀胱癌

最近兩年內(nèi)膀胱癌與長鏈非編碼RNA的研究日趨增多，發(fā)現(xiàn)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，增殖浸潤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、診斷治療以及預(yù)后有一定相關(guān)性。

3.1 PANDAR與膀胱腫癌 Hung等首先發(fā)現(xiàn)了lncRNA PANDAR(promoter of CDKN1A antisense DNA damage-activated RNA)，位于人染色體6p21.2，PANDAR對于DNA損傷具有較高的敏感度，P53在DNA損傷后會誘導(dǎo)PANDAR表達(dá)，直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子NF-YA，抑制其對靶基因FAS基因的作用，進(jìn)而對凋亡基因表達(dá)起到很好的抑制作用，PANDAR缺失導(dǎo)致人成纖維細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感[6]。

早有研究顯示，PANDAR在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中表達(dá)下調(diào)，PANDAR低表達(dá)與臨床較差的預(yù)后相關(guān)。然而肝癌中PANDAR表達(dá)上調(diào)，PANDAR低表達(dá)預(yù)示著較好的臨床預(yù)后。乳腺癌組織和細(xì)胞系均有PANDAR表達(dá)上調(diào)，在乳腺癌中發(fā)揮促癌基因的作用并可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[7]。以上說明lncRNA PANDAR在腫瘤中發(fā)揮了重要作用。

Zhan等2016年對55例膀胱癌臨床標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PANDAR在腫瘤組織中，與癌旁組織相比，表達(dá)明顯上調(diào)。PANDAR高表達(dá)與膀胱癌更高的組織學(xué)分期（P＜0.05）、更高的TNM分級相關(guān)（P＜0.05）。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，沉默PANDAR的表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，細(xì)胞凋亡增加；過表達(dá)PANDAAR可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移，抑制細(xì)胞凋亡[8]。

PANDAR在膀胱癌中發(fā)揮致癌作用，可作為指示預(yù)后的生物靶標(biāo)和潛在的治療靶點，有重要的臨床意義。

3.2 PVT1與膀胱癌 長鏈非編碼RNA PTV1位于人染色體8q24.21，長度為1716bp，與人類腫瘤關(guān)系密切。PTV1在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤的發(fā)展相關(guān)；在卵巢癌中可能是潛在治療靶點；在胃癌和肝癌中促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展；在乳腺癌中獨立于MYC促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡[9]。

與癌旁組織相比，lncRNA PTV1在62.5%（20/32例）的膀胱癌組織中表達(dá)增加（P＜0.01），并且與膀胱癌的病理分級（P=0.028）、TNM分期相關(guān)（P=0.002）。體外實驗中，給予膀胱癌T24、5637細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-PTV1，EdU實驗檢測細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)兩類細(xì)胞UdU陽性者分別降低了40%（P＜0.01）和50%（P＜0.01）。提示PVT1促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖。與si-NC對照組相比，Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，si-PVT1處理組caspase3（P＜0.01）和細(xì)胞凋亡比率(P＜0.01)均明顯增加。最后，同時給予多西環(huán)素和多西環(huán)素誘導(dǎo)的PVT1 shRNA處理膀胱癌T24、5637細(xì)胞，給予1μg/mL多西環(huán)素處理時，與陰性對照組相比，T24和5637細(xì)胞PVT1的表達(dá)分別下降了58%和60%，與此同時膀胱癌細(xì)胞增殖明顯下降，凋亡增加[10]。

PTV1促進(jìn)膀胱進(jìn)展，多西環(huán)素誘導(dǎo)的PVT1 shRNA可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

3.3 CCAT2和膀胱癌 lncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物2（colon cancer associated transcript 2，CCAT2）位于人染色體8q24.21，首先在結(jié)腸癌組織中被發(fā)現(xiàn)并命名，且在存在轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中表達(dá)水平更高，并作為Wnt通路的下游靶基因可促進(jìn)結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[11]。CCAT2的表達(dá)異?？梢越档腿橄侔┙M織對化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。在食管癌中CCAT2有吸煙史的患者癌組織CCAT2表達(dá)水平更高，且CCAT2對食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷有較高的診斷價值[13]。

Li等2016年對48例膀胱癌病理組織經(jīng)行研究，發(fā)現(xiàn)28例標(biāo)本中CCAT2的表達(dá)在腫瘤組織較癌旁組織表達(dá)增高（P＜0.05）。CCAT2過表達(dá)與膀胱癌病理分級（P=0.014），TNM分期(P=0.016)正相關(guān)。四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)即tetoff和tet-on是目前應(yīng)用最廣,也是惟一已用于轉(zhuǎn)基因動物的一類可調(diào)控系統(tǒng)[14]。為了定量抑制CCAT2的表達(dá)，Li等構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)的CCAT2 shRNA，同時給予

同時給2 mL四環(huán)素和四環(huán)素誘導(dǎo)的CCAT2 shRNA質(zhì)粒處理T24和5637細(xì)胞，CCAT2在5637和T24中的表達(dá)分別穩(wěn)定下降了58%（P＜0.01）和63%（P＜0.01）。與對照組相比，2μg/mL四環(huán)素誘導(dǎo)的CCAT2 shRNA處理的T24和5637細(xì)胞，分別進(jìn)行Edu實驗，流式細(xì)胞實驗，人胱天蛋白酶3（Casp-3）ELISA實驗，發(fā)現(xiàn)膀胱癌T24、5637細(xì)胞增殖能力明顯降低，細(xì)胞遷移能力下降，凋亡受到抑制[15]。

CCAT2在促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，四環(huán)素表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)的CCAT2 shRNA可能成為膀胱癌基因治療的手段。

3.4 HOTAIR和膀胱癌 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一個被發(fā)現(xiàn)具有反式作用(trans-acting)的lncRNA基因。定位于人染色體12q13.13區(qū)域HOX基因家族HOXC11基因的反義鏈，長6232bp，編碼2.2kb長鏈非編碼RNA分子[16]。

實驗發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中HOTAIR可通過與PRC2的共同作用使組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)，與LSD1共同作用使組蛋白H3第4位賴氨酸去甲基化（H3K4me3）。HOTAIR首次在人成纖維細(xì)胞中表達(dá)，隨后在包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)。

實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR可作為膀胱癌總體生存期獨立的預(yù)后因子，可調(diào)節(jié)膀胱癌對阿霉素的化療耐藥性[17]。另一項實驗發(fā)現(xiàn)HOTAIR在腫瘤組織中的表達(dá)為癌旁組織的20倍。HOTAIR可影響miR-205啟動子區(qū)域H3K4me3和H3K27me3的平衡，由此抑制miR-205的表達(dá)。miR-205據(jù)信在進(jìn)展期膀胱癌中表達(dá)增加，并參與了膀胱癌的浸潤和增殖[18]。較少有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA通過調(diào)節(jié)miRNA啟動子的組蛋白修飾作用影響miRNA的表達(dá)。miRNA-205與HOTAIR之間的聯(lián)系可能為膀胱癌的治療提供新的靶點。

3.5 MALAT1和膀胱癌 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1是lncRNA家族的重要成員，定位于染色體11q13.1，長度為6.7kb，在細(xì)胞核中分布表達(dá)。其在正常肺、胰腺以及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)（NSCLC）。MALAT1沉默可調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞遷移相關(guān)的基因表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的遷移[19]。

在膀胱癌的研究中發(fā)現(xiàn)MALAT-1在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且在發(fā)生轉(zhuǎn)移的膀胱癌原發(fā)灶中，MALAT-1較無轉(zhuǎn)移病變者表達(dá)顯著升高。體外實驗證明MALAT-1通過Wnt通路促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）,siRNA下調(diào)MALAT-1的表達(dá)可降低上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的ZEB1、ZEB2水平，同時上調(diào)E-cadherin水平，抑制膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]。

進(jìn)一步對MALAT-1調(diào)節(jié)膀胱癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究，通過RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP技術(shù)）、RNA pull down實驗發(fā)現(xiàn)MALAT-1與suz12特異性結(jié)合，過表達(dá)suz12降低T24細(xì)胞E-cadherin表達(dá)。免疫沉淀實驗（ChIP）發(fā)現(xiàn)抑制MALAT-1表達(dá)降低了T24細(xì)胞中suz12與E-cadherin啟動子的結(jié)合，證明MALAT-1通過suz12抑制了E-cadherin的表達(dá)。最后，沉默T24細(xì)胞中MALAT1表達(dá)可顯著降低TGF-β誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)抑制，降低了EMT相關(guān)的分子標(biāo)志物，如N-cadherinh和fibronectin等[20]。證實了MALAT-1在TGF-β誘導(dǎo)的膀胱癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用。該研究表明MALAT-1在膀胱癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

4 小結(jié)

LncRNA不僅在生物體中以多種機(jī)制發(fā)揮其生物學(xué)功能，且其功能失調(diào)與多種疾病的發(fā)生，發(fā)展相關(guān)。lncRNA是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的非編碼RNA，通過參與轉(zhuǎn)錄前，轉(zhuǎn)錄后以及表觀遺傳學(xué)修飾等不同層面參與腫瘤的生物學(xué)進(jìn)程。雖然目前l(fā)ncRNA與膀胱癌的關(guān)系還處于起步階段，但隨著對lncRNA的功能以及作用機(jī)制越來越多的認(rèn)知，對于膀胱癌相關(guān)的lncRNA的深入研究，將更好的對膀胱癌的診斷、術(shù)后檢測、個體化治療及新藥研發(fā)提供新的理論支持。

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The present status of lncRNAin bladder caner

Li Qi-jin1，Zhong Li-ming2
(1.Department ofAnesthesiology,The Nanhai hospital of Southern Medical University,Foshan,Guangdong,528200,China;2.Nanhai hygienic vocational technical school,Foshan,Guangdong,528200,China)

Taking advantage of next-generation sequencing technology,transcriptomic changes in tumors have been investigated,Long noncoding RNAs(lncRNAs)are non-protein coding RNAs regulating gene expression,It have been ignored that long noncoding RNA abnormal expression was closely correlated with tumor for a long time.Now it is fully believed that lncRNA was closely related to bladder tumor cell proliferation，invasion，metastasis,recurrence and drug resistence.This article reviews the present status of lncRNAin bladder caner.

Bladder carcinoma;Long noncoding RNA;CCAT2;HOTAIR

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.31.089