淺析SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)操作

□張肖逢 劉 姍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 河北 保定 071000）

淺析SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)操作

□張肖逢 劉 姍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 河北 保定 071000）

SSR是新興起的一種較為理想的遺傳標(biāo)記技術(shù)，在科學(xué)研究中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。本文簡單介紹了SSR分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)過程，以期為SSR分子標(biāo)記技術(shù)的普及而服務(wù)。

SSR；PCR擴(kuò)增；步驟

1SSR實(shí)驗(yàn)步驟

常用的DNA提取主要有：CTAB法和SDS法。提取過程中要減少物理、化學(xué)等因素對核酸結(jié)構(gòu)的破壞，也要防止核酸自身的生物降解。

1.2 引物的篩選

為了提高PCR擴(kuò)增的效率，引物分為正、反兩類?，F(xiàn)在可直接從公司購買。

1.3 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增反應(yīng)體系為15μl，包含3μl模板DNA、7.5μlMIX、正反引物各0.5μl和超純水3.5μl（在冰板上進(jìn)行）。反應(yīng)程序：①95℃預(yù)變性5min②94℃變性30s③55℃退火30s④72℃延伸30s，②③④這三個(gè)步驟循環(huán)35次，⑤72℃延伸10min，可在4℃過夜。

1.4 電泳（以變性聚丙烯胺凝膠電泳為例）

1.4.1 實(shí)驗(yàn)中所用試劑及其配制。變性膠的配制：40%丙烯酰胺150ml、5×TBE200ml、尿素420.24g三種試劑混合，加蒸餾水至1 000ml，用玻璃棒攪拌至溶液變澄清即可。變性膠不需要現(xiàn)配現(xiàn)用。丙烯酰胺有毒，配制過程中要戴手套。

學(xué)校教師不僅是知識的提供者，也承擔(dān)著培養(yǎng)和提高大學(xué)生綜合素質(zhì)的重要任務(wù)。不管是院校的領(lǐng)導(dǎo)還是工作在一線的教師，無論是教學(xué)管理人員還是后勤服務(wù)人員，都必須意識到自己在禮儀教育上的重要作業(yè)，在教學(xué)活動和日常生活中注重自己的言行，不斷加強(qiáng)禮儀修養(yǎng)、以身作則。這種氛圍不可避免地會影響每個(gè)大學(xué)生的言行。

過硫酸銨的配制：超純過硫酸銨2g在超純水18ml中溶解并混合均勻，可放置在4℃中保存。

TEMED：購買后可直接使用。

銀染溶液：取4g硝酸銀充分溶于2 000ml蒸餾水，實(shí)驗(yàn)過程中可重復(fù)使用，染色9～12塊板換一次。

顯色溶液：取30g氫氧化鈉充分溶于2 000ml蒸餾水中，放入膠板前加入8ml甲醛。甲醛具有揮發(fā)性且有毒，實(shí)驗(yàn)時(shí)帶好口罩并打開通風(fēng)扇。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4.2.1 玻璃板準(zhǔn)備及灌膠

1）玻璃板擦拭：將玻璃板放置于水平界面，將待用的兩面玻璃板用2ml95%無水酒精擦拭一遍。取1.5ml95%無水酒精、10μl0.5%冰醋酸和10μl親和硅烷于2mlEP管內(nèi)，混合均勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）倒在親水玻璃板（平板）用紙巾涂抹均勻。同理，將500μl剝離硅烷在疏水玻璃板（凹板）上用同樣的方法均勻涂抹。之后進(jìn)行玻璃板的組裝。

2）玻璃板的組裝：在平板的兩邊邊緣各放置一個(gè)配套的塑料條，再將凹板涂有剝離硅烷的一面蓋在平板上，兩邊各用兩個(gè)大夾子夾住兩塊玻璃板。

3）配制凝膠：100ml變性膠、過硫酸銨200μl和100μlTEMED（兩塊板）迅速輕輕搖晃混合均勻，混勻后立即灌膠。此過程中的過硫酸銨和TEMED分別是加速劑和催化劑，適當(dāng)?shù)脑黾涌梢约铀倩旌弦旱哪Y(jié)，建議初學(xué)者適當(dāng)減少過硫酸銨和TEMED的用量。

4）灌膠：用50ml大注射器吸取配制好的膠的混合液，將注射器里面的空氣排出，直接用注射器注入，注入時(shí)，控制推動力度均勻防止產(chǎn)生氣泡，可拍打凹板上面加速混合液的流動。若有剩余的混合液不可倒入水池內(nèi)，以免膠凝后堵塞下水道。

5）靜置：待灌膠完成后，迅速在兩個(gè)玻璃板之間插入梳子無齒端，在插入過程中要注意不要產(chǎn)生氣泡。靜置至少1h。

1.4.2.2 凝膠電泳

1）待膠凝好后，拔下梳子和去除大夾子，用水清洗玻璃板兩面，以去除殘余的凝膠。插上梳子的另一端。插好后，放在電泳槽內(nèi)，正負(fù)極槽內(nèi)加入適宜的1×TBE。

2）為清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，預(yù)電泳10min，電壓2000V、電流200mA、功率120W、TIME模式（兩塊板）。

3）預(yù)電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，用100μl的槍將膠內(nèi)的氣泡打出。

4）點(diǎn)樣：加入3μlPCR擴(kuò)增之后的DNA樣品和1～3個(gè)Marker。

5）電泳：電壓2 000V、電流200mA、功率120W（兩塊板）電泳1.5h（指示帶跑完整個(gè)膠板）。

1.4.2.3 銀染

電泳完畢之后，先將上槽液回收，取下膠板，小心分開兩塊膠板。將平板放入染色液中染色7min，將平板取出用蒸餾水清洗一下，然后放入顯色液中，待膠顯出條帶后取出，為使染色和顯影均勻，將染色液和顯影液放在搖床上。將銀染好的膠板讀板并進(jìn)行拍照記錄。

結(jié)束語

SSR分子標(biāo)記操作簡單，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠。作為當(dāng)今社會新興起的一種較為理想的遺傳標(biāo)記技術(shù)，我們應(yīng)盡可能的了解它的優(yōu)點(diǎn)，使它在科研中發(fā)揮最大的用處。

1004-7026（2017）10-0101-01

S511

A

10.16675/j.cnki.cn14-1065/f.2017.10.072