紫蘇粕中迷迭香酸的提取與富集工藝研究

梅喜剛,張 琦,李曼娜,馬 超

(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,北京100083)

紫蘇粕中迷迭香酸的提取與富集工藝研究

梅喜剛,張 琦,李曼娜,馬 超*

(北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院,北京100083)

本研究的目的為從紫蘇粕中提取并富集富含迷迭香酸的多酚提取物,為紫蘇粕的綜合利用提供技術(shù)支持。以多酚和迷迭香酸的提取率為指標,在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應面法,對提取用硫酸溶液濃度、溫度和時間三個參數(shù)進行優(yōu)化;在此基礎(chǔ)上分別以多酚和迷迭香酸的吸附和解吸率為指標,從8種不同型號的大孔樹脂中篩選出吸附和解吸效果最佳的樹脂類型進行富集工藝研究。實驗表明,最佳提取工藝條件為硫酸濃度8%,溫度90 ℃,時間1.5 h,提取得到的迷迭香酸提取率為(0.541±0.02) mg/g DW;8種樹脂中,HPD-200A樹脂分離效果最優(yōu),最佳洗脫溶劑為60%乙醇,最終得到的提取物中,迷迭香酸含量為26.8%。該提取、富集工藝簡便、快捷、高效,為紫蘇粕資源的進一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

紫蘇,響應面,大孔樹脂,迷迭香酸

紫蘇(Perillafrutescens)是唇形科紫蘇屬一年生草本植物,在我國以油用和藥用為主,兼做香料和食用[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為紫蘇具有發(fā)汗、順氣、鎮(zhèn)痛、利尿、解毒、安胎、鎮(zhèn)咳和化痰之功效[2-4]。紫蘇葉和種子中多種多酚類成分具有護肝、抗過敏、抗抑郁、抗腫瘤和抗血小板凝集[5-11]作用,其中以迷迭香酸作用最為突出,被認為是紫蘇中的主要功效成分[6]。紫蘇種子榨油后的殘渣(紫蘇粕)往往被用作飼料,甚至作為廢棄物被丟棄,造成資源的巨大浪費。研究表明,紫蘇粕中含有迷迭香酸、迷迭香酸-3-o-葡萄糖苷、咖啡酸、咖啡酸-3-o-葡萄糖苷、芹菜素等多種多酚類成分,具有顯著的抗氧化活性[12]。植物中迷迭香酸的提取與富集常常采用有機溶劑提取、色譜分離純化的方法,如Hao Huang等人用95%乙醇、硅膠柱色譜、重結(jié)晶、沉淀硅膠柱色譜等方法從山地香菜中得到了少量迷迭香酸及其衍生物[13-14]。但是,該方法只能提取出可溶性、游離的迷迭香酸及其衍生物,而結(jié)合態(tài)的迷迭香酸及其衍生物卻無法被提取出來[12]。為了提高紫蘇粕資源的綜合利用效率,本實驗以紫蘇粕為原料,采用單因素和響應面實驗設計方法對酸解法提取紫蘇粕多酚的提取工藝進行優(yōu)化,并對大孔樹脂富集工藝進行研究,以期得到富含迷迭香酸的多酚提取物,從而為紫蘇粕的精深加工提供經(jīng)濟、合理的提取富集工藝。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

紫蘇種子 購自甘肅蘭州,充分干燥壓榨法去除油脂后低溫(4 ℃)保存待用;HPD-100、HPD-200A、HPD-450A、HPD-826、HPD-400、HPD-600、D-101、ADS-17等8種大孔樹脂 均購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司;沒食子酸和迷迭香酸對照品 購自中國食品藥品檢定研究所;其它試劑 購自北京化學試劑公司。

恒溫水浴鍋 江蘇金壇市億通電子有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;高效液相色譜儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;高速離心機 上海安亭科學儀器廠;超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 選取硫酸濃度、提取溫度、提取時間3個因素進行研究,利用單因素實驗確定出各個因素的較優(yōu)水平。

1.2.1.1 硫酸濃度對總酚和迷迭香酸提取率的影響 取1.0 g紫蘇粕粉末,固定提取溫度50 ℃、提取時間2 h,分別加入10 mL不同濃度(2%、5%、10%、20%、30%)的硫酸溶液,提取液用濃NaOH水溶液中和至pH7.0,然后用去離子水補足至10 mL,考察不同硫酸濃度對總酚和迷迭香酸提取率的影響。

1.2.1.2 溫度對總酚和迷迭香酸提取率的影響 取1.0 g紫蘇粕粉末,加入10 mL固定濃度為10%的硫酸溶液、提取時間2 h,分別在不同溫度(30、50、70、80、90、100 ℃)提取,提取液用濃NaOH水溶液中和至pH7.0,然后用去離子水補足至10 mL,考察不同溫度對總酚和迷迭香酸提取率的影響。

1.2.1.3 提取時間對總酚和迷迭香酸提取率的影響 取1.0 g紫蘇粕粉末,加入10 mL固定濃度為10%的硫酸溶液、提取溫度90 ℃,分別提取(1、2、4、6、7、8 h),提取液用濃NaOH水溶液中和至pH7.0,然后用去離子水補足至10 mL,考察不同提取時間對總酚和迷迭香酸提取率的影響。

1.2.2 Box-Benhnken實驗設計 在單因素實驗基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken實驗原理優(yōu)化提取工藝條件。選取酸濃度、提取溫度和提取時間3個因素,以迷迭香酸提取率為響應值進行提取條件的優(yōu)化,實驗因素水平編碼設計[15]見表1。

表1 響應面設計實驗因素及水平

1.2.3 總酚含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取沒食子酸標準樣品5.00 mg,去離子水溶解并定容于50 mL容量瓶中,得到濃度為0.10 mg/mL的標準溶液。將標準溶液進一步進行系列稀釋,得到濃度為0.0125～0.10 mg/mL的系列稀釋標準溶液。分別準確量取上述標準液0.40 mL于5 mL試管中,各加3.00 mL蒸餾水并振蕩搖勻,再各加入0.25 mL Folin酚試劑,搖勻。1 min后,各加入20%碳酸鈉溶液0.75 mL,混勻后定容至5 mL,避光靜止30 min后,于760 nm波長下測定吸光值[16]。以吸光值為縱坐標,對照品濃度為橫坐標,線性擬合得標準曲線回歸方程:Y=0.095421X+0.020474(Y是吸光值,X是沒食子酸濃度),R2=0.99746,表明沒食子酸在0～0.10 mg/mL濃度之內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 紫蘇粕總酚提取率測定 精確稱取待測樣品,去離子水溶解,然后稀釋至合適濃度。精確量取0.20 mL待測溶液至5 mL試管中,按照1.2.3.1方法進行顯色并測定吸光值,然后通過標準曲線以沒食子酸當量(gallic acidequivalent,GAE)計算總酚提取率。

1.2.4 HPLC法測定迷迭香酸提取率

1.2.4.1 色譜條件 色譜柱:迪馬公司Diamonsil RP-C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A),0.2%甲酸水(B);線性洗脫:A,0～25 min 30%～50%,25～28 min 50%～30%;28～35 min 30%;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:330 nm;運行時間:35 min。

1.2.4.2 標準曲線的繪制 精確稱取迷迭香酸標準品10.0 mg,用甲醇溶解并定容于100 mL的容量瓶中,并稀釋得到20.0～100.0 mg/L系列濃度的標準品溶液。將標準品溶液按照1.2.4.1 HPLC條件進行檢測,然后以迷迭香酸峰面積(Y)為縱坐標,標準溶液濃度(X)為橫坐標[17],擬合得到回歸方程為Y=8426.9X+16853,R2=0.9992,表明在20.0～100.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5 大孔樹脂分離富集實驗

1.2.5.1 紫蘇粕多酚粗提液的制備 按照上述單因素和響應面研究結(jié)果優(yōu)化得到的最優(yōu)提取條件,取約100 g紫蘇粕粉末,加入1 L濃度為8%的硫酸溶液,在90 ℃下水浴加熱提取1.5 h,冷卻后過濾,所得濾渣再用同樣方法提取一次,冷卻后過濾;合并兩次所得濾液,用NaOH溶液中和,離心后即得紫蘇粕粗提液。

1.2.5.2 大孔樹脂預處理 分別取HPD-100、HPD-200A、HPD-450A、HPD-826、HPD-400、HPD-600、D-101、ADS-17等8種大孔樹脂適量置于三角瓶中,先用95%乙醇浸泡24 h,再用95%乙醇淋洗至流出液與水混合后無白色渾濁,再用大量水沖洗至無明顯醇味。

1.2.5.3 靜態(tài)吸附和解吸附實驗 分別稱取預處理過的8種型號的大孔吸附樹脂各1.0 g置于100 mL三角瓶中,然后各加入30 mL紫蘇粕粗提液,置于搖床上,25 ℃下100 r/min振蕩15 h使其達到飽和吸附。分別測定吸附前和吸附后紫蘇粕提取液中總酚和迷迭香酸濃度,計算各大孔樹脂的吸附率。過濾除去紫蘇粕粗提液后,所得吸附后的大孔樹脂用蒸餾水洗兩次(20 mL/次),然后加入30 mL 60%乙醇于各樹脂中,同樣置于搖床上,25 ℃下100 r/min振蕩解吸附6 h,再次測定解吸液中總酚和迷迭香酸濃度。吸附率和解吸率的計算公式分別如下:

式中:C0為粗提液初始總酚濃度(mg/mL);C1為吸附平衡時粗提液總酚濃度(mg/mL);V1為加入的原液體積(mL);M1為吸附率(%);C2為洗脫液濃度(mg/mL);V2為洗脫液體積(mL);M2為解吸率(%)。

1.2.5.4HPD200A大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學過程 準確稱取預處理的HPD200A樹脂1.0g于錐形瓶中,加入30mL己知濃度的樣品液,25 ℃下振蕩至吸附平衡,定時取樣進行分析,計算靜態(tài)吸附量,繪制出靜態(tài)吸附動力學曲線。

1.2.5.5 動態(tài)吸附和解吸附實驗 采用濕法裝柱,將預處理后的HPD200A型樹脂裝入層析玻璃柱中。紫蘇粕粗提液100mL上樣,流速為2mL/min。達到吸附平衡時,再依次以水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇為洗脫劑進行洗脫分餾,每個洗脫劑濃度下洗脫2BV,將5個餾分分別進行HPLC檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 硫酸濃度對總酚和迷迭香酸提取率的影響 圖1表明在硫酸濃度低于10%時,總酚和迷迭香酸提取率隨酸濃度增加而升高,大于10%時總酚提取率趨于穩(wěn)定,但迷迭香酸提取率急劇下降,可能是因為迷迭香酸在硫酸濃度較高條件下發(fā)生了轉(zhuǎn)化或者是結(jié)構(gòu)的破壞,導致迷迭香酸提取率的減少,而多酚物質(zhì)則可能是在此硫酸濃度條件下達到了平衡。因此,將酸濃度10%確定為最佳濃度。

圖1 硫酸濃度對總酚和迷迭香酸提取率的影響Fig.1 Effect of acid concentration on extraction yield of total phenols and rosmarinic acid

2.1.2 提取溫度對總酚和迷迭香酸提取率的影響 圖2表明,在溫度低于90 ℃時,總酚和迷迭香酸的提取率隨溫度升高而上升,可能是低溫條件利于紫蘇粕中多酚物質(zhì)溶出。高于90 ℃時,總酚含量緩慢下降,迷迭香酸含量則快速下降,可能是因為在高于90 ℃時會破壞多酚和迷迭香酸的結(jié)構(gòu),導致其含量減少,因此將90 ℃確定為最佳提取溫度。

圖2 溫度對總酚和迷迭香酸提取率的影響 Fig.2 Effect of temperature on extraction yield of total phenols and rosmarinic acid

2.1.3 提取時間對總酚和迷迭香酸提取率的影響 圖3表明,提取時間低于2 h時,總酚和迷迭香酸提取率都呈上升趨勢,總酚含量上升明顯,迷迭香酸提取率緩慢升高;2～6 h之間,總酚提取率持續(xù)升高而迷迭香酸提取率降低,可能隨著提取時間延長,迷迭香酸發(fā)生降解,而降解產(chǎn)物咖啡酸等的含量升高。綜合考慮兩種物質(zhì)的提取率,確定2 h為最佳提取時間。

圖3 提取時間對總酚和迷迭香酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total phenols and rosmarinic acid

2.2 響應面實驗結(jié)果

2.2.1 Box-Benhnken中心組合結(jié)果分析 以迷迭香酸含量為主要指標的,是為了富集迷迭香酸,總酚含量只是作為參考,所以在響應面中只對迷迭香酸提取工藝進行優(yōu)化。根據(jù)單因素實驗,由Design-Expert 21.0軟件設計的實驗方案及實驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應面實驗設計及響應值

采用Disign-Expert 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析,結(jié)果如表3所示。擬合后得到A、B、C的二次多項回歸模型:Y1=0.52-0.097A-0.049B-0.056C-0.016AB+3.000E-003AC-0.042BC-0.13A2-0.13B2-0.080C2。

表3 回歸模型方差分析

注:**表示p<0.01,極顯著,*表示p<0.05,顯著。

2.2.2 影響紫蘇粕迷迭香酸提取率的因素分析 各因素及其交互作用對紫蘇粕迷迭香酸提取率的影響可直觀的通過等高線圖和響應面圖反映出來。圖4(a)和圖4(b)曲面陡峭,說明硫酸濃度和提取溫度、提取溫度和提取時間之間交互作用比較顯著,與方差分析結(jié)果一致。圖4(a)為固定提取時間為零水平,提取溫度和硫酸濃度對迷迭香酸含量的影響和二者間的交互作用,硫酸濃度較低時,隨著溫度的升高,迷迭香酸提取率先上升再趨向平緩,當超過一定溫度時,迷迭香酸提取率開始下降。當固定溫度不變時,隨著硫酸濃度升高,迷迭香酸提取率先上升后下降;圖4(b)為固定硫酸濃度,提取溫度和提取時間對迷迭香酸含量的影響和二者間的交互作用,隨著溫度升高,迷迭香酸含量先上升后下降,隨提取時間的延長,迷迭香酸提取率呈下降趨勢。

2.2.3 驗證實驗 通過分析得到酸法提取迷迭香酸的理論最佳工藝參數(shù)為:酸濃度8.20%,溫度88.86 ℃,時間1.67 h,此條件下預測紫蘇粕中迷迭香酸的最大提取率為0.550 mg/g。為提高實驗的可操作性,調(diào)整最佳工藝參數(shù)為酸濃度8%,溫度90 ℃,時間1.5 h,結(jié)果迷迭香酸提取率(0.541±0.02) mg/g,接近于模型預測值。

2.3 大孔樹脂分離富集工藝

2.3.1 樹脂型號的選擇 八種樹脂對總酚和迷迭香酸的吸附率與解吸率如圖5所示,綜合考慮八種大孔樹脂的吸附和解吸特性,最終優(yōu)選出HPD-200A大孔樹脂進行后續(xù)實驗。該樹脂對多酚的吸附率、解吸率分別為46.46%、79.15%,迷迭香酸的吸附率、解吸率分別為87.99%、69.33%。

圖4 各因素交互作用對迷迭香酸提取率的影響Fig.4 Response surface plots of variable parameters on the yield of rosmarinic acid

圖5 八種大孔樹脂對迷迭香酸和多酚的吸附率、解吸附率的比較Fig.5 Comparison of the adsorption and desorption rate of eight kinds of macroporous resins to rosmarinic acid and polyphenol

2.3.2 HPD-200A大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸特性 HPD-200A樹脂對紫蘇粕總酚和迷迭香酸的靜態(tài)吸附動力學曲線如圖6(A)所示,結(jié)果表明,在0～3 h內(nèi)HPD-200A大孔樹脂的吸附能力隨時間延長而迅速增大,3 h時大孔樹脂的吸附能力達到飽和狀態(tài)。

HPLC方法分別對水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇洗脫液進行檢測,結(jié)果如圖6(B)所示,結(jié)果表明,60%乙醇洗脫液中多酚含量占上樣液中總酚的24.08%,迷迭香酸的量占上樣液中迷迭香酸的82.7%,分離得到的提取物中迷迭香酸的含量由上樣前粗提物的7.8%提高到26.8%,是粗提液中迷迭香酸所占總酚比例的3.43倍,說明60%乙醇作為洗脫液有效實現(xiàn)了迷迭香酸的富集。

圖6 HPD-200A大孔樹脂對紫蘇粕提取物中迷迭香酸和總酚的靜態(tài)吸附動力學曲線(A)及動態(tài)洗脫分布(B)Fig.6 Kinetics of static absorption of rosmarinic acid and total phenolic(A), and their distribution in gradient elution(B)

3 結(jié)論

為得到紫蘇粕中富含迷迭香酸的多酚物質(zhì),本論文以含有迷迭香酸和迷迭香酸糖苷等多酚成分的紫蘇粕為材料,采用單因素和響應面法對紫蘇粕中多酚和迷迭香酸的提取工藝進行優(yōu)化,建立了迷迭香酸提取率的回歸模型,最終確定最佳提取工藝條件為硫酸濃度8%,溫度90 ℃,時間1.5 h,提取得到的迷迭香酸得率為(0.541±0.02) mg/g,與模型預測值接近;通過研究八種大孔樹脂對迷迭香酸和多酚的吸附和解吸特性,最終優(yōu)選出HPD-200A為最佳分離純化類型,該大孔樹脂最佳富集條件為洗脫溶劑60%乙醇,流速2 mL/min,收集液2 BV。最終得到的多酚提取物中,迷迭香酸的含量可達到26.8%。本研究為得到富含迷迭香酸的多酚物質(zhì)提供了一種簡便快速的方法,同時對提高紫蘇粕的綜合利用率和精深加工提供了很好的借鑒。

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Extraction and enrichment of rosmarinic acid from residues of perilla seeds

MEI Xi-gang,ZHANG Qi,LI Man-na,MA Chao*

(College of Biological Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

The aim of the present study is to extract and enrich polyphenol extracts rich in rosmarinic acid from perilla seed residues,and provide technical support for the comprehensive utilization of perilla seed residues. Extraction of rosmarinic acid was optimized through single factor experiment and response surface method. Enrichment of rosmarinic acid was carried out using macroporous resins chromatography. The absorption capacity and desorption ratio of polyphenol and rosmarinic acid were used as criteria to select the most suitable resins. Results showed that the optimum extraction conditions were with the H2SO4concentration of 8%,extraction temperature of 90 ℃,extraction time of 1.5 h,under which the extraction yield of rosmarinic acid reached(0.541±0.02) mg/g DW. HPD-200A resin was the most suitable for enrichment of rosmarinic acid,and the best elution solvent was 60% ethanol(v/v). The content of rosmarinic acid in the final extract was 26.8%. The optimized extraction and enrichment procedure is simple,quick and efficient,and provide fundamental information for the further utilities of the seed residues of perilla.

Perillafrutescens;response surface;macroporous resin;rosmarinic acid

2016-09-22

梅喜剛(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物與功能性食品，E-mail:15600804800@163.com。

*通訊作者:馬超(1979-)，男，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物與功能性食品方面的研究，E-mail:machao@bjfu.edu.cn。

北京市與中央在京高校共建項目(2014GJ01)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)06-0250-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.039