抗煙草黑脛病植物源活性物質(zhì)的篩選

朱三榮，周佳民，巢 進(jìn)，宋 榮，曹 亮，魯耀雄，陳前鋒，徐 瑞

(1.湖南省煙草公司 湘西自治州分公司，湖南 吉首 416000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所，湖南 長沙 410125)

抗煙草黑脛病植物源活性物質(zhì)的篩選

朱三榮1，周佳民2*，巢 進(jìn)1，宋 榮2，曹 亮2，魯耀雄2，陳前鋒1，徐 瑞2

(1.湖南省煙草公司 湘西自治州分公司，湖南 吉首 416000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所，湖南 長沙 410125)

為篩選對(duì)煙草黑脛病有較高抗性的植物源提取物，采用菌絲生長速率法，對(duì)苦參、枳殼等45種中藥材粗提液對(duì)煙草黑脛病病菌的抑制效果及施藥方式進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：有土黃連、黃柏等19種中藥材的提取物對(duì)煙草黑脛病病菌菌絲生長有顯著的抑制效果，中藥材提取物以混合殺菌方式對(duì)煙草黑脛病菌絲生長抑制作用效果最好；其中土黃連、黃柏、黃獨(dú)、厚樸、前胡、雷公藤、蒼術(shù)、油茶餅、瞿麥、巴戟天等16種中藥材的提取物對(duì)煙草黑脛病菌絲生長有極顯著的抑制效果，具有開發(fā)先導(dǎo)化合物的潛力；在大田生產(chǎn)應(yīng)用上，施用中藥材植物源藥劑防治煙草黑脛病以灌根的施藥方式較好。

煙草；黑脛病；植物源藥劑

煙草黑脛病(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)是煙草生產(chǎn)上一種毀滅性土傳真菌性病害之一[1]，可危害烤煙、晾煙、曬煙、香料煙、白肋煙等所有栽培煙草，破壞性極強(qiáng)。Van Breda de Haan于1896年在印尼爪哇煙草上發(fā)現(xiàn)[2]，1950年傳入我國，隨后擴(kuò)散至全國大部分煙草種植區(qū)域[3]，給我國煙草產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重影響[4]。

化學(xué)防治仍然是防治煙草黑脛病最為有效的手段[5]，但化學(xué)農(nóng)藥的長期過量施用導(dǎo)致病原菌的抗藥性增強(qiáng)，也直接影響了煙草產(chǎn)量和質(zhì)量[6]。以中藥材提取物為核心的植物源農(nóng)藥，具有易分解并且分解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)，有學(xué)者就中草藥提取物對(duì)煙草黑脛病菌菌絲室內(nèi)生長的抑制作用做了大量的研究[7-9]，但形成產(chǎn)品應(yīng)用于生產(chǎn)上研究的報(bào)道很少。為此，本試驗(yàn)對(duì)煙草黑脛病具有抑制作用的中草藥提取物進(jìn)行了廣泛的篩選，以期為研發(fā)植物源殺菌劑防治煙草黑脛病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 供試菌株

供試煙草黑脛病病菌株由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理教研室朱宏建博士鑒定提供。將菌種接種到PDK培養(yǎng)基(燕麥片：200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、CaCO35 g、水1000 mL)上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后，備用[10]。

1.2 供試藥材及來源

供試藥材主要是以消炎殺菌類藥材為主，分別采自于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物基地、道縣、新寧、龍山等地，烘干或晾干備用，部分藥材從湖南省廉橋藥材市場(chǎng)購買，然后粉碎備用。所用藥材經(jīng)湖南省農(nóng)業(yè)生物資源利用研究所藥用植物課題組鑒定，具體見表1。

表1 供試中藥材名錄

1.3 提取物的制備

采用超聲波提取法[11]。將陰干的植物材料在45 ℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱中吹干至發(fā)脆，用植物粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后備用。稱取各植物樣品干粉100.00 g，倒入電熱套圓形瓶中，再倒入75%的酒精500 mL。開啟電熱套，提取60 min，溫度設(shè)置為95 ℃。把提取液減壓抽濾得濾液，殘?jiān)俅尾扇∠嗤椒ㄟM(jìn)行處理，重復(fù)提取3次，合并3 次濾液，把濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀圓形瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀(旋轉(zhuǎn)參數(shù)：60～75 r/min；蒸發(fā)溫度60 ℃以下，制冷溫度：-2～10 ℃)，即得到該藥用植物的乙醇粗提物，把膏狀物倒入瓶中，做好記載，貼好標(biāo)簽，寫上編號(hào)名稱，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物測(cè)定方法

采用菌絲生長速率法生物測(cè)定技術(shù)進(jìn)行測(cè)定[12]。先將提取物用5%乙醇溶解，配制成所需濃度備用，用打孔器在長滿煙草黑脛病病原菌的培養(yǎng)基上切取菌餅，將菌餅放入提取物溶液中浸泡5 min，再轉(zhuǎn)移到無菌空培養(yǎng)皿(直徑90 mn)中，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至第3、5天時(shí)，分別計(jì)算黑脛病菌落直徑，數(shù)據(jù)用DPS 7.05和Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，方差分析采用LSD多重比較法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥用植物的抗菌活性比較

45種藥用植物提取物設(shè)置50和500倍2種濃度，以無菌水(T47)和5%乙醇(T46)作為對(duì)照，分別于第3和5天測(cè)量菌落直徑。

由表2可知，與無菌水對(duì)照(T47)相比，在第3天，T44、T19、T12等42個(gè)50倍液處理的煙草黑脛病菌的菌落直徑小，其中，有T44、T19、T12等32個(gè)處理的50倍液處理的煙草黑脛病菌的菌落直徑差異極顯著；在第5天，T44、T19、T33等40個(gè)處理差異極顯著，

與乙醇對(duì)照(T46)的菌落直徑相比，在第3天，T44、T19、T12等18個(gè)50倍液處理的煙草黑脛病菌的菌落直徑差異極顯著，尤其是以處理T44、T19、T12、T33、T34的效果明顯，其菌落直徑僅分別為0.58、0.65、0.75、1.12、1.35 cm；到了第5天，各處理的菌落直徑的變化趨勢(shì)和第3天基本一致。

處理第3天，與空白對(duì)照相比，乙醇對(duì)照的菌落直徑要小，但沒有差異，表明50倍液的乙醇有一定的殺菌效果，但沒有顯著差異，說明用乙醇作提取劑，對(duì)黑脛病菌菌絲的生長影響不大。

由表3可知，第5天， 50和500倍液2個(gè)處理濃度，空白對(duì)照與乙醇對(duì)照的菌落直徑均沒有差異，數(shù)據(jù)基本接近一致，說明在5天后，用乙醇作為提取劑對(duì)本試驗(yàn)的干擾較小。從表2、表3還可以看出，與乙醇對(duì)照相比，44種植物提取物的50倍溶液及32種植物提取物的500倍濃液都存在極顯著的抑菌效果，尤其是以T44、T19、T33、T12、T31的效果最明顯，其50倍稀釋液處理的菌落直徑僅分別為0.68、0.75、1.27、1.62、2.10 cm，說明隨著時(shí)間的推遲，中藥材提取物的殺菌效果顯著。

與無菌水對(duì)照(T47)相比，在第3天，有T12、T34、T21等33個(gè)處理的500倍液的菌落直徑小，其中，有T12、T34、T21等23個(gè)處理差異極顯著；在第5天，有T31、T12、T21等33個(gè)處理差異極顯著。與乙醇對(duì)照(T46)的菌落直徑相比，第3天，有T44、T19、T12等11個(gè)處理差異極顯著，尤其是以處理T44、T19、T12、T33、T34的效果最明顯，其菌落直徑僅分別為0.58、0.65、0.75、1.12、1.35 cm；到了第5天，各處理菌落直徑的變化趨勢(shì)與第3天基本一致。

綜合來看，與乙醇對(duì)照(T46)的菌落直徑相比，各處理的50倍和500倍液對(duì)黑脛病病菌有較好抑制作用的處理有T44、T19、 T12、T33、T34、T31、T25、T42、T37、T30、T23、 T32、T11、T17、T20、T21等16個(gè)。

2.2 5種植物提取物不同濃度對(duì)黑脛病菌的抑制效果

根據(jù)室內(nèi)測(cè)定結(jié)果，本試驗(yàn)選取了T44、T19、 T12、T33、T34等5種藥用植物提取物，設(shè)置了25、50、100等6個(gè)梯度的藥劑濃度試驗(yàn)。結(jié)果表明，各梯度濃度的植物提取液對(duì)黑脛病病菌均有一定的抑制效果，隨著稀釋倍數(shù)的成倍降低，菌落直徑均呈下降趨勢(shì)，但沒有成相應(yīng)的倍數(shù)下降(表4)，T44、T19、 T12、T33、T34等藥用植物提取物2000倍液的菌落直徑均比對(duì)應(yīng)的1000倍液的菌落直徑要大，且均存在極顯著差異(T19顯著差異)，各處理1000倍液的菌落直徑與500倍液的菌落直徑?jīng)]有極顯著差異(T12極顯著差異)，各處理500倍液的菌落直徑明顯比100倍液的菌落直徑要大(T19沒有顯著差異)，各處理100倍液的菌落直徑比50倍液的菌落直徑要大，且均有極顯著差異(T12除外)，各處理25倍液的效果最好，菌落直徑均小于(含等于)1.5 cm，但與50倍液相比，T12、T19、T44間差異不顯著，且各處理均未達(dá)到極顯著差異。

與乙醇對(duì)照相比，在同一梯度濃度上，植物提取物的菌落直徑呈下降趨勢(shì)，這說明植物提取液對(duì)黑脛病病菌均有一定的抑制效果，隨著稀釋倍數(shù)的減低，殺菌效果逐漸增強(qiáng)；在本試驗(yàn)設(shè)置的20～2000倍液6個(gè)濃度梯度中，表現(xiàn)出來的4個(gè)檔次：25倍液與50倍液的抑菌效果相當(dāng)，100倍液、500倍液與1000倍液的抑菌效果相當(dāng)，2000倍液的抑菌效果最差，這為生產(chǎn)實(shí)際中的施藥濃度設(shè)置提供借鑒。

表2 不同藥用植物提取物50倍溶液對(duì)煙草黑脛病菌的菌落直徑cm

處理第3天菌落直徑差異顯著水平0．050．01處理第5天菌落直徑差異顯著水平0．050．01T55．23aAT467．90aAT65．23aAT477．80aAT34．70abABT87．30abABT474．63abcABT17．28abcABT14．57abcABT107．28abcABT84．55abcABT47．23abcABT104．35bcdBCT37．18bcdBCT134．30bcdeBCT67．13bcdeBCT44．28bcdeBCT97．08bcdeBCT434．00bcdefBCDT26．88bcdefBCDT243．95bcdefgBCDET76．70bcdefgBCDET23．92bcdefgBCDET56．18bcdefgBCDET453．90cdefghBCDEFT396．13cdefghBCDEFT463．87cdefghiBCDEFT386．05cdefghiBCDEFT93．85cdefghiBCDEFT405．97cdefghiBCDEFT413．62defghijCDEFGT425．95defghijCDEFGT263．60defghijCDEFGHT145．93defghijCDEFGHT223．55efghijCDEFGHIT365．73efghijCDEFGHIT153．37fghijkDEFGHIJT435．13fghijkDEFGHIJT273．32fghijklDEFGHIJT204．95fghijklDEFGHIJT353．22fghijklmDEFGHIJT284．90fghijklmDEFGHIJT383．22fghijklmDEFGHIJT134．75fghijklmDEFGHIJT283．22fghijklmDEFGHIJT414．55fghijklmDEFGHIJT73．18ghijklmDEFGHIJKT174．48ghijklmDEFGHIJKT393．18ghijklmDEFGHIJKT454．40ghijklmDEFGHIJKT363．18ghijklmDEFGHIJKT264．38ghijklmDEFGHIJKT293．12hijklmEFGHIJKLT244．38hijklmEFGHIJKLT403．10ijklmnEFGHIJKLT164．32ijklmnEFGHIJKLT163．03jklmnoFGHIJKLMT154．28jklmnoFGHIJKLMT182．88jklmnopGHIJKLMT184．13jklmnopGHIJKLMT142．73klmnopqHIJKLMNT224．13klmnopqHIJKLMNT212．72klmnopqIJKLMNT293．83klmnopqIJKLMNT202．67klmnopqJKLMNOT273．82klmnopqJKLMNOT172．60klmnopqrJKLMNOT373．75klmnopqrJKLMNOT112．55lmnopqrJKLMNOT233．75lmnopqrJKLMNOT322．50mnopqrJKLMNOT353．22mnopqrJKLMNOT232．32nopqrKLMNOPT303．13nopqrKLMNOPT302．28opqrLMNOPT112．97opqrLMNOPT372．22pqrsMNOPQT322．82pqrsMNOPQT421．97qrstNOPQRT212．82qrstNOPQRT251．82rstuOPQRT342．58rstuOPQRT311．45stuvPQRST252．33stuvPQRST341．35tuvwQRST312．10tuvwQRST331．12uvwRST121．62uvwRST120．75vwST331．27vwST190．65wST190．75wST440．58wST440．68wS

注：同列數(shù)據(jù)后的大、小寫字母分別表示差異達(dá)0.01、0.05的顯著水平。下同。

3 結(jié)論

以植物為原料進(jìn)行植物源農(nóng)藥的研制與開發(fā)已成為世界各國農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)。我國中草藥研究歷史悠久，中草藥資源十分豐富，在篩選具有殺菌活性物質(zhì)的中藥材品種上有明顯優(yōu)勢(shì)，植物源農(nóng)藥研發(fā)中最基礎(chǔ)也最為重要的工作就是進(jìn)行活性植物資源篩選[13-15]。

表3 不同藥用植物提取物500倍溶液的煙草黑脛病菌菌落直徑cm

處理第5天菌落直徑差異顯著水平0．050．01處理第5天菌落直徑差異顯著水平0．050．01T65．35aAT477．93aAT425．17abABT467．70abABT75．08abcABCT107．53abcABCT45．02abcdABCT437．48abcdABCT24．97abcdABCDT427．43abcdABCDT414．92abcdABCDT87．42abcdABCDT34．88abcdeABCDT67．38abcdeABCDT394．85abcdeABCDT47．35abcdeABCDT14．80abcdeABCDET17．35abcdeABCDET254．77abcdeABCDEFT387．33abcdeABCDEFT84．75abcdeABCDEFGT97．30abcdeABCDEFGT474．65abcdefABCDEFGHT37．25abcdefABCDEFGHT54．45bcdefgABCDEFGHIT407．12bcdefgABCDEFGHIT154．42bcdefghABCDEFGHIJT77．12bcdefghABCDEFGHIJT404．28bcdefghiBCDEFGHIJKT367．08bcdefghiBCDEFGHIJKT94．27cdefghiBCDEFGHIJKT27．00cdefghiBCDEFGHIJKT454．25cdefghijBCDEFGHIJKT396．97cdefghijBCDEFGHIJKT464．15defghijkCDEFGHIJKLT56．60defghijkCDEFGHIJKLT104．02efghijklDEFGHIJKLMT136．10efghijklDEFGHIJKLMT384．00efghijklDEFGHIJKLMT206．00efghijklDEFGHIJKLMT373．85fghijklmEFGHIJKLMT375．83fghijklmEFGHIJKLMT363．78fghijklmFGHIJKLMNT165．57fghijklmFGHIJKLMNT273．77fghijklmGHIJKLMNT225．55fghijklmGHIJKLMNT333．67ghijklmnHIJKLMNOT265．52ghijklmnHIJKLMNOT293．57ghijklmnoIJKLMNOPT245．45ghijklmnoIJKLMNOPT223．55hijklmnoIJKLMNOPT345．37hijklmnoIJKLMNOPT183．52ijklmnoIJKLMNOPQT445．35ijklmnoIJKLMNOPQT173．50ijklmnopIJKLMNOPQT155．33ijklmnopIJKLMNOPQT353．47ijklmnopqIJKLMNOPQT235．23ijklmnopqIJKLMNOPQT163．47ijklmnopqIJKLMNOPQT285．20ijklmnopqIJKLMNOPQT433．43ijklmnopqrJKLMNOPQT455．18ijklmnopqrJKLMNOPQT443．40ijklmnopqrKLMNOPQT415．15ijklmnopqrKLMNOPQT263．37jklmnopqrKLMNOPQT355．13jklmnopqrKLMNOPQT133．37jklmnopqrKLMNOPQT275．08jklmnopqrKLMNOPQT143．32klmnopqrKLMNOPQRT184．95klmnopqrKLMNOPQRT243．22lmnopqrsLMNOPQRT294．85lmnopqrsLMNOPQRT193．03mnopqrsMNOPQRT194．80mnopqrsMNOPQRT202．85nopqrsNOPQRT174．78nopqrsNOPQRT322．77opqrsOPQRT114．77opqrsOPQRT232．70opqrsOPQRT254．70opqrsOPQRT302．62pqrsPQRT144．13pqrsPQRT312．62pqrsPQRT333．47pqrsPQRT112．60qrsPQRT303．27qrsPQRT282．55rsQRT323．22rsQRT212．55rsQRT213．13rsQRT342．55rsQRT123．02rsQRT122．37sRT312．92sR

本試驗(yàn)廣泛篩選的45種中藥材中，土黃連、黃柏、黃獨(dú)、厚樸、前胡、雷公藤、蒼術(shù)、油茶餅、瞿麥、巴戟天等16種中藥材的提取物對(duì)煙草黑脛病菌絲生長有很好的抑制效果，鐘慧等[16]的研究表明，蒼術(shù)甲醇提取物對(duì)煙草黑脛病菌有很高的抑菌活性；王若焱[17]等研究認(rèn)為，青蒿、藿香等 8 種植物提取液聯(lián)合保健處理煙草黑脛病具有較好的防治效果；王強(qiáng)[18]等研究表明，厚樸、黃連等中藥材也具有一定的抑菌作用；本試驗(yàn)中選取的藥材資源豐富且均可人工栽培，因此，具有開發(fā)先導(dǎo)化合物的潛力。

表4 提取物不同梯度濃度菌落直徑變化cm

提取物濃度/倍數(shù)處理T12T19T33T34T44乙醇(CK)20006．63aA4．53aA4．63aA6．97aA6．07aA6．60aA10006．37bA3．53bAB3．53bB3．73bB3．67bB6．43aA5002．43cB2．83bcBC3．27cB3．73bB3．20bB4．60bB1000．57dC2．33cC1．57dC2．53cC2．07cC4．33bcBC500．53dC0．70dD0．80eD1．83dD0．87dD4．13bcBC250．50dC0．50dD0．53fD1．50eD0．72dD3．87cC

本試驗(yàn)表明，土黃連、黃柏、黃獨(dú)、厚樸、前胡、雷公藤、蒼術(shù)、油茶餅、瞿麥、巴戟天等植物提取液對(duì)黑脛病病菌均有一定的抑制效果，藥用植物提取物的抑菌效果隨著稀釋倍數(shù)的減低，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，這與王樹桐[19]等就中草藥丁香提取物對(duì)香蕉鐮刀菌枯萎病病原菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)中藥用植物提取物6個(gè)濃度梯度的抑菌效果表現(xiàn)出來4個(gè)檔次，依次為：稀釋25倍液與50倍液的效果相當(dāng)，100倍液、500倍液與1000倍液的抑菌效果相當(dāng)，2000倍液的抑菌效果最差，因此，考慮到中藥材植物源藥劑提取成本及提取材料的來源，在生產(chǎn)實(shí)踐中建議用500倍液較為合適。中國中藥材資源豐富，本試驗(yàn)僅僅測(cè)定45種中草藥提取物在室內(nèi)的抑菌效果，而且抑菌效果受其功能性成分復(fù)配及大田環(huán)境因素的影響，抑菌機(jī)制等還需進(jìn)一步研究，本課題組正在加強(qiáng)此方面的試驗(yàn)研究，以期為煙草黑脛病的防治提供一些對(duì)策。

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(責(zé)任編輯：曾小軍)

Screening of Botanical Active Substances Resistant to TobaccoBlack Shank (Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)

ZHU San-rong1, ZHOU Jia-min2*, CHAO Jin1, SONG Rong2,CAO Liang2, LU Yao-xiong2, CHEN Qian-feng1, XU Rui2

(1. Xiangxi Autonomous Prefecture Branch, Tobacco Company of Hunan Province, Jishou 416000, China; 2. Institute of Agricultural Biological Resource Utilization, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China)

In order to screen out the botanical active substances which had a stronger resistance to tobacco black shank (Phytophthoraparasiticavar.nicotianae), by using mycelium growth rate method, we determined the inhibitory effects of 45 kinds of Chinese herbal medicine crude extracts on tobacco black shank pathogen, and studied their application method. The results showed that the crude extracts from 19 kinds of Chinese herbal medicines (such asCoptischinensis,Phellodendronchinense) had a significant inhibitory effect on the mycelial growth of tobacco black shank pathogen, and the inhibitory effect of the mixed extracts from several Chinese herbal medicines was the best. The crude extracts from 16 kinds of Chinese herbal medicines (includingCoptischinensis,Phellodendronchinense,Dioscoreabulbifera,Mangnoliaofficinalis, common hogfennel root,Tripterygiumwilfordii,Rhizomaatractylodis, cake of oil-tea camellia,Dianthussuperbus,Morindaofficinalis, etc.) had a very significant inhibitory effect on the mycelial growth of tobacco black shank pathogen, and they had the potential to develop lead compounds. In the field production of tobacco, the better application mode of medicinal botanical pesticides for the control of tobacco black shank was root-irrigation.

Tobacco; Black shank; Botanical pesticide

2016-10-23

湖南省湘西自治州煙草專賣局科技項(xiàng)目(XX14-16Aa03)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303117)。

朱三榮(1978─)，男，湖南雙峰人，農(nóng)藝師，碩士，主要從事煙草營養(yǎng)與栽培研究。*通訊作者：周佳民。

S572

A

1001-8581(2017)04-0063-06