蘗穗氮肥追施比例對(duì)水稻灌漿成熟期 Rubisco 和 GS同工型基因表達(dá)量的影響

朱方旭，郭雪冬，同拉嘎，張玉磊，潘冬，李明月，李丹，張忠臣，金正勛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

蘗穗氮肥追施比例對(duì)水稻灌漿成熟期 Rubisco 和 GS同工型基因表達(dá)量的影響

朱方旭，郭雪冬，同拉嘎，張玉磊，潘冬，李明月，李丹，張忠臣，金正勛*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

【目的】氮素營(yíng)養(yǎng)影響著水稻灌漿過程中核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶 (Rubisco) 和谷氨酰胺合成酶(GS) 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，研究其變化動(dòng)態(tài)及其與不同形態(tài)氮含量的關(guān)系，旨在為闡明氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)光合效率和籽粒蛋白質(zhì)積累的影響分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x用寒地粳稻穗數(shù)型高產(chǎn)品種和穗重型超級(jí)稻品種進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。施肥比例為 N∶P2O5∶K2O = 1∶0.5∶1，氮肥 50% 作為基肥，其余作分蘗肥和穗肥追施，分蘗肥和穗肥比例為 10%∶40%、20%∶30%、30%∶20%、40%∶10%。分析了水稻灌漿過程中 Rubisco 和 GS 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量及不同形態(tài)氮的積累動(dòng)態(tài)?！窘Y(jié)果】增加穗肥氮素施用量可顯著提高水稻灌漿過程中葉片和籽粒的全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量；增加穗肥比例不同程度的上調(diào)了 Rubisco 大亞基和小亞基基因的 mRNA 表達(dá)量，其中 OsRBCSL、OsRBCS2 和 OsRBCS4 表達(dá)上調(diào)顯著，OsRBCS3 和 OsRBCS5 表達(dá)上調(diào)較??；穗肥比例增加延長(zhǎng)了 Rubisco 各亞基基因高表達(dá)持續(xù)時(shí)間，增加了水稻灌漿中期和后期葉片中 OsGS1;1 和 OsGS2 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量以及籽粒 OsGS1;1 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和整個(gè)灌漿過程中 OsGS1;3 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。Rubisco 五個(gè)亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與葉片 NO3--N 和全氮含量間以及葉片和籽粒中 GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與 NH4

粳稻；氮素；灌漿成熟期；Rubisco；GS；基因表達(dá)

氮肥施用方法不僅對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大，而且也影響肥料的利用率和農(nóng)田水土污染。圍繞著氮肥施用方法與水稻生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的關(guān)系國(guó)內(nèi)外學(xué)者已做了大量的研究。但由于水稻不同類型新品種的選育和推廣、栽培條件和方法及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的變化、經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展、研究手段和水平的提高等原因，不斷地出現(xiàn)新的問題，并要求解決新問題和闡明相關(guān)機(jī)理，以致該領(lǐng)域仍然是至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者要研究解決的熱點(diǎn)問題。水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成主要是淀粉和蛋白質(zhì)合成與積累的過程[1]，十分復(fù)雜的碳氮代謝參與這些過程。核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶 (Rubisco) 和谷氨酰胺合成酶 (GS) 都是碳氮代謝過程中的關(guān)鍵酶，該酶含量和活性大小對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的形成影響很大。已有研究結(jié)果表明，硝酸鹽[2]、銨[3]、谷氨 酰 胺 和 谷 氨 酸[4]等 能 夠 作 為 調(diào) 節(jié) 基 因 表 達(dá) 的 氮 信號(hào)。在高等植物中氮素含量與 Rubisco 之間存在著很強(qiáng)的線性關(guān)系[5]。水稻的 Rubisco 是由一個(gè)大亞基和5 個(gè)小亞基組成的 8 聚體，其中 OsRBCS1 在水稻葉片中不表達(dá)[6-7]。GS 則是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的第一步，對(duì)無機(jī)氮素的同化起到關(guān)鍵性的作用。基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與酶活性和基因性狀表現(xiàn)都有密切的線性關(guān)系。國(guó)內(nèi)外至今不同施氮方法對(duì)水稻灌漿過程中 Rubisco和 GS 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響方面研究報(bào)道很少。因此，針對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)和生產(chǎn)上采用的氮肥施用方法，本試驗(yàn)選用寒地粳稻高產(chǎn)品種研究不同蘗穗肥比例對(duì)籽粒灌漿過程中 Rubisco 和 GS 同工型基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化及不同形態(tài)氮含量的影響，旨在為闡明氮素營(yíng)養(yǎng)對(duì)葉片光合效率和籽粒蛋白質(zhì)積累影響的分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)選用寒地粳稻穗數(shù)型高產(chǎn)品種松粳 6 號(hào)和穗重型超級(jí)稻品種松粳 9 號(hào)，于 2014 年和 2015年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆的規(guī)格為長(zhǎng) × 寬 × 高為 60 cm × 40 cm × 40 cm。盆栽用土過篩混拌均勻后等量裝盆，插秧前 3 天灌水浸泡，施入的基肥與上層 20 cm 土壤混拌均勻。4 月 5 日在育秧盤上等距離單粒點(diǎn)播催芽籽，大棚旱育秧管理，5月 10 日選擇葉齡相同、長(zhǎng)勢(shì)相近的秧苗插秧，每盆插 8 穴，每穴 2 株。施肥量為 N 135 kg/hm2，N∶P2O5∶K2O 比例為 1∶0.5∶1，施用肥料為分析純尿素、磷酸二銨、硫酸鉀，按盆的表面積折算成每盆的 N，P2O5，K2O 的施用量。磷肥 100% 基施；鉀肥的 50% 基施，50% 在孕穗期追施；氮肥的 50% 基施，其余 50% 用于分蘗肥和穗肥按照以下比例分配進(jìn)行追施:10%∶40%、20%∶30%、30%∶20%、40%∶10%，共 4 個(gè)處理，每個(gè)處理 8 盆，共 32 盆。分蘗肥在秧苗第 5 片葉完全展開后施入，穗肥在倒 2葉展開約三分之一時(shí)施入。其它管理同大田。

1.2 取樣方法

以穗部抽出葉鞘 3 cm 為準(zhǔn)掛牌標(biāo)記抽穗日期，分別在抽穗后 5、10、15、20、25、30 d 取穗和劍葉。劍葉取中間部分 5 cm 長(zhǎng)；籽粒在灌漿程度基本一致的穗中部取樣，籽粒去穎殼。樣品一部分用105℃ 殺青 10 min，65℃ 烘干；另一部分液氮冷凍處理，-80℃ 保存，備用。

1.3 基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)

根據(jù) Jain 等分析結(jié)果[8]，本試驗(yàn)選擇水稻不同生育時(shí)期和組織器官中穩(wěn)定性最好的 UBQ5 和在不同環(huán)境條件或者脅迫條件下穩(wěn)定性較好的 Actin1 兩個(gè)內(nèi)參基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取兩組數(shù)據(jù)的平均值。重復(fù)樣品等比例混合后提取總 RNA，重復(fù)兩次。分別使用trizol 法和冷酚法提取水稻葉片和籽?？?RNA，之后用 DNase I (K2101AA，TaKaRa) 和 RNase Inhibitor (K8101BA，TaKaRa) 對(duì)總 RNA 消化處理去除基因組 DNA。第 1 鏈 cDNA 合成使用 PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (RR019A，TaKaRa)，以上產(chǎn)品均按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)使用TaKaRa TaqTM(KA1601BA，TaKaRa) Taq 酶，控制擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)在 24～30 之間。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。PCR 引物信息列于表 1。對(duì)合成的每對(duì)引物進(jìn)行 PCR 檢測(cè)。由圖 1 引物檢測(cè)結(jié)果可知，所有引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度都符合設(shè)計(jì)引物時(shí)的理論長(zhǎng)度，并且特異性很強(qiáng)，沒有非特異性條帶。

1.4 不同形態(tài)氮含量測(cè)定

樣品全氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮分別用 Berthelot 焰色反應(yīng)法[9]和 Griess 法[10]測(cè)定。將葉片或籽粒稱重計(jì)數(shù)，在預(yù)冷的提取液 [50 mmol/L Tris-HCL (pH = 7.0)，10 mmol/L 咪唑，0.5% (w/v) β-巰基乙醇，] 中研磨成勻漿。勻漿 12000 g 4℃ 離心 20 min，取上清用于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2014 年只測(cè)定抽穗后 10、20、30 d 的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和氮含量，結(jié)果與 2015 年基本一致，因此本論文只對(duì) 2015 年的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 和 Excel，膠片亮度分析使用 Quantity one 7.0.5軟件。

表1 RT-PCR 目的基因引物Table 1 Accessions of gene and sequence of RT-PCR Primers

圖1 RT-PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度檢測(cè)Fig. 1 RT-PCR production size test[注（Note）:圖中所用 marker 從上向下依次為 1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp The used marker from top to bottom are 1000 bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp and 100 bp.]

2 結(jié)果與分析

2.1 供試品種間產(chǎn)量性狀比較

比較兩個(gè)供試品種的產(chǎn)量性狀可知 (表 2)，松粳6 號(hào)每穴穗數(shù)顯著多于松粳 9 號(hào)，但穗粒數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率顯著低于松粳 9 號(hào)，顯示兩個(gè)供試品種間的產(chǎn)量性狀不同，松粳 6 號(hào)是穗數(shù)型品種，而松粳 9號(hào)是穗重型品種。

表2 供試品種間產(chǎn)量性狀比較Table 2 Comparison of yield traits among the tested cultivars

2.2 不同處理對(duì)水稻葉片和籽粒中不同形態(tài)氮含量的影響

由圖 2 可見，在灌漿過程中水稻葉片全氮含量的變化動(dòng)態(tài) 2 個(gè)品種和不同施氮處理都基本相似，隨著灌漿進(jìn)程先逐漸升高，達(dá)到峰值后又逐漸降低，呈單峰曲線變化，其中穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)峰值出現(xiàn)在抽穗后 20 d，穗重型品種松粳 9 號(hào)則出現(xiàn)在抽穗后 25 d；不同施氮處理的葉片中銨態(tài)氮含量變化動(dòng)態(tài)是穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)是呈先升高后降低的單峰曲線變化，抽穗后 25 d 達(dá)到峰值，而穗重型品種松粳 9 號(hào)是一直呈上升的直線變化趨勢(shì)；2 個(gè)品種和不同施氮處理的葉片中硝態(tài)氮含量變化動(dòng)態(tài)都很相似，從抽穗后 5 d 開始一直呈下降趨勢(shì)。2 個(gè)品種和不同施氮處理的籽粒中全氮含量是隨著灌漿進(jìn)程緩慢升高，硝態(tài)氮含量是隨著灌漿進(jìn)程 2 個(gè)品種的 T1 和 T2 處理是緩慢升高，而 T3 和 T4 處理是緩慢下降；銨態(tài)氮含量是 2 個(gè)品種和不同施氮處理都呈先升高后降低的單峰曲線變化，其中穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)是抽穗后 25 d 達(dá)到峰值，而穗重型品種松粳 9 號(hào)是抽穗后 30 d 達(dá)到峰值。隨著分蘗肥施氮量的減少和穗肥施氮量的增加，灌漿過程中葉片和籽粒的全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量也都逐漸增加，其中 T1 和 T4 處理間始終表現(xiàn)顯著的差異。說明灌漿過程中葉片和籽粒中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量的變化動(dòng)態(tài)并不相同，銨態(tài)氮和全氮含量的變化趨勢(shì)基本一致，籽粒中硝態(tài)氮含量的變化趨勢(shì)因施氮方法不同可增加或可減少，增加穗肥施氮量可增加籽粒中硝態(tài)氮含量，反之與此相反。

2.3 不同施氮處理對(duì)水稻葉片 Rubisco 基因 mRNA表達(dá)量的影響

由圖 3 可見，供試的兩個(gè)品種和不同施氮處理在灌漿過程中 OsRBCL 基因 mRNA 表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)基本相似，均呈先升高后降低的單峰曲線變化，其中穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)各處理都在抽穗后 15 d 表達(dá)量達(dá)到峰值，但灌漿過程中高表達(dá)量持續(xù)時(shí)間不同處理間有差異，其中 T1 和 T2 處理是抽穗后 10～25 d、T3 和 T4 處理是抽穗后 10～15 d 維持較高的表達(dá)水平；穗重型品種松粳 9 號(hào)表達(dá)量達(dá)到峰值時(shí)間分別為 T1、T2、T3 處理抽穗后 20 d，T4 處理是抽穗后 10 d；T1、T2、T3 處理是抽穗后 10～25 d，T4 處理是抽穗后 10～15 d 維持較高的表達(dá)水平。說明在灌漿過程中 OsRBCL 基因 mRNA 表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)不因品種或氮素營(yíng)養(yǎng)不同而發(fā)生質(zhì)的變化，增加灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)延長(zhǎng)該基因的高表達(dá)持續(xù)時(shí)間。

灌漿過程中兩個(gè)品種和不同施氮處理的 OsRBCS2和 OsRBCS4 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)都呈隨灌漿進(jìn)程表達(dá)量逐漸上升，達(dá)到峰值后又緩慢下降的單峰曲線變化，其中穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)的 OsRBCS2和 OsRBCS4 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值分別出現(xiàn)在抽穗后10 d 和 15 d。在穗重型品種松粳 9 號(hào)中 OsRBCS2 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間 T1 和 T2 處理是抽穗后 15 d、T3 和 T4 處理是抽穗后 10 d，而 OsRBCS4基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰出現(xiàn)的時(shí)間 T1 和 T2 處理是抽穗后 15 d、T3 和 T4 處理是抽穗后 20 d。OsRBCS3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在抽穗后 5～30 d 一直呈快速下降趨勢(shì)，但 OsRBCS5 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在這段時(shí)間呈平緩下降趨勢(shì)。說明在灌漿過程中 Rubisco 小亞基基因的各同工型基因的表達(dá)是彼此間相互獨(dú)立，而且表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)不因品種或氮素營(yíng)養(yǎng)不同而發(fā)生質(zhì)的變化。

圖2 不同蘗、穗肥施用比例水稻葉片及籽粒中各形態(tài)的氮素含量Fig. 2 Contents of different N in rice leaves and grains affected by the tillering and heading fertilizer input ratios[注（Note）:柱上不同小寫字母表示不同處理間差異達(dá)到 5% 顯著水平Different small letters above the bars mean significant difference between the treatments at the 0.05 level.]

隨著分蘗肥施氮量的減少和穗肥施氮量的增加，兩個(gè)品種葉片 OsRBCL 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均隨之上調(diào)，其中 T1 和 T4 處理間的表達(dá)量差異達(dá)到顯著水平。受到氮素處理的影響，Rubisco 小亞基基因家族各成員的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也不同程度地發(fā)生變化，兩個(gè)品種 OsRBCS2 和 OsRBCS4 基因表達(dá)量都隨著分蘗肥施氮量的減少和穗肥施氮量的增加大幅度上調(diào)，在穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)中 OsRBCS2 基因表達(dá)量 T1較 T4 上調(diào)約 1 倍，OsRBCS4 基因上調(diào)約 1.2 倍，在穗重型品種松粳 9 號(hào)中 OsRBCS2 基因的表達(dá)量 T1較 T4 上調(diào)約 0.6 倍，OsRBCS4 基因上調(diào)約 1 倍。兩個(gè)品種 OsRBCS3 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量上調(diào)幅度較小，但 T1和 T4 處理間差異仍然達(dá)到顯著水平。OsRBCS5基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也上調(diào)，其中 T1 和 T4 處理間穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)是抽穗后 10～25 d、穗重型品種松粳 9 號(hào)是抽穗后 5～25 d 的表達(dá)量差異都達(dá)到顯著水平。說明增加灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)不同程度的上調(diào) Rubisco 大亞基和小亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，但不同基因?qū)Φ貭I(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)程度并不相同，其中OsRBCSL、OsRBCS2 和 OsRBCS4 基因受到氮素營(yíng)養(yǎng)的 影 響 上 調(diào) 表 達(dá) 的 作 用 明 顯 ， 而 OsRBCS3 和OsRBCS5 受氮素營(yíng)養(yǎng)的影響上調(diào)表達(dá)的作用較小。

圖3 不同蘗穗肥比例水稻葉片 rbcL 與 rbcS 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量Fig. 3 Transcription levels of rbcL and rbcS in rice leaves affected by the tillering and heading fertilizer input ratios

2.4 不同施氮處理對(duì)水稻葉片和籽粒中谷氨酰胺合成酶同工型基因表達(dá)量的影響

由圖 4 可見，在灌漿過程中兩個(gè)品種和不同施氮處理的葉片中 OsGS1;1 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)均呈單峰曲線變化，其中穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)的 T1和 T2 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 20 d，T3和 T4 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 15 d，穗重型品種松粳 9 號(hào) T1 和 T2 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 25 d，T3 和 T4 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 20 d，而且兩品種分別在抽穗后20～30 d 和 25～30 d 內(nèi)差異增大，T1 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于 T4 處理。OsGS2 基因在兩個(gè)品種和不同施氮處理的葉片中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)也呈單峰曲線，在穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 20 d，在抽穗后 15～20 d 內(nèi)維持較高的表達(dá)水平；在穗重型品種松粳 9 號(hào)中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量峰值出現(xiàn)在抽穗后 15 d，而且兩品種分別在抽穗后10～20 d 和 10～30 d 內(nèi)差異增大，T1 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于 T4 處理。說明在灌漿過程中葉片谷氨酰胺合成酶各同工型基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)不因品種或氮素營(yíng)養(yǎng)不同而發(fā)生質(zhì)的變化，增加灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)不僅會(huì)延長(zhǎng)基因高表達(dá)持續(xù)時(shí)間，而且可提高基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。

圖4 不同蘗穗肥比例對(duì)葉片谷氨酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的影響Fig. 4 Transcription levels of glutamine synthetase gene in rice leaves affected by the tillering and heading fertilizer input ratios

由圖 5 可見，在灌漿過程中不同類型品種籽粒OsGS1;1 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)因施氮處理不同而異，在 T3 和 T4 處理中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量呈單峰曲線變化，抽穗后 25 d 轉(zhuǎn)錄表達(dá)量達(dá)到峰值后又下降，而在 T1 和 T2 處理中轉(zhuǎn)錄表達(dá)量呈直線上升的變化趨勢(shì)，抽穗后 30 d 時(shí)表達(dá)量都最高。說明灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)改變籽粒 OsGS1;1 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)。OsGS1;3 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)在不同類型品種和不同施氮處理間基本一致，抽穗后10～30 d 均呈直線上升趨勢(shì)，抽穗后 30 d 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量最高。說明在灌漿過程中籽粒 OsGS1;3 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)不因品種類型和氮素營(yíng)養(yǎng)不同而發(fā)生質(zhì)的變化。

不同處理間基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量比較可知，OsGS1;1基因在穗數(shù)型品種松粳 6 號(hào)中抽穗后 10 d 時(shí)各處理間表達(dá)量差異不顯著，但在抽穗后 15～30 d 內(nèi) T1 和T4 處理間差異較大，除抽穗后 25 d 外 T1 處理顯著高于 T4 處理；在穗重型品種松粳 9 號(hào)中抽穗后10～20 d 時(shí)各處理間表達(dá)量差異并不顯著，但在抽穗后 25～30 d 內(nèi) T1 和 T4 處理間差異較大，抽穗后30 d 時(shí) T1 處理顯著高于 T4 處理。不同類型品種籽粒中 OsGS1;3 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量均隨著穗肥氮素施用量的增加而增加，T1 處理的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于 T4處理。說明增加灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)可提高灌漿中后期的籽粒 OsGS1;1 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和整個(gè)灌漿過程中 OsGS1;3 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。

2.5 不 同 形 態(tài) 氮 含 量 與Rubisco 和GS 基 因mRNA 表達(dá)量間相關(guān)性

圖5 不同蘗穗肥比例水稻籽粒中谷氨酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量Fig. 5 Transcription levels of glutamine synthetase gene in rice grains affected by the tillering and heading fertilizer input ratios

根據(jù) 2 個(gè)供試品種在不同施氮處理和灌漿時(shí)期的不同形態(tài)氮含量和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量數(shù)據(jù)計(jì)算兩者間的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)，其結(jié)果分別列于表 3 和表 4。

由表 3 可知，水稻葉片中 Rubisco 五個(gè)亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與葉片 NH4+-N 含量間均呈不顯著的正相關(guān)，與葉片 NO3--N 和全氮含量間均呈顯著或極顯著的正相關(guān)。說明葉片 Rubisco 各亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高低與葉片 NO3--N 和全氮含量有密切關(guān)系，增加葉片 NO3--N 和全氮含量，可以顯著提高 Rubisco基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，增加葉片 NH4+-N 含量雖然也能提高 Rubisco 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，但效果不如 NO3--N明顯。

由表 4 可知，葉片和籽粒中 GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與 NH4+-N 和全氮含量間均呈顯著或極顯著的正相關(guān)，與葉片和籽粒的 NO3--N 含量間分別呈不顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)。說明葉片和籽粒中 GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與葉片和籽粒的 NH4+-N 和全氮含量高低關(guān)系很密切，增加灌漿成熟期葉片和籽粒的 NH4+-N 和全氮含量，可以顯著提高葉片和籽粒的 GS 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。葉片和籽粒 NO3--N 含量高低對(duì) GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量影響并不很明顯。

表3 Rubisco 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與葉片不同形態(tài)氮含量間的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between the transcription levels of Rubisco gene and different form nitrogen contents of leaves

表4 谷氨酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與葉片和籽粒不同形態(tài)氮含量間的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients between the transcription levels of glutamine synthetase gene and different form nitrogen contents in leaves and grain

3 討論

RuBP 羧化酶是光合作用的關(guān)鍵酶之一，該酶的活性大小和含量高低是評(píng)價(jià)植物光合作用能力的重要指標(biāo)。普遍認(rèn)為葉片氮含量和光合作用能力之間呈現(xiàn)高度正相關(guān)[11-12]，一定范圍內(nèi)增加氮素施用量會(huì)增加 RuBP 羧化酶的活性[13]。Miyazaki 等[14]的研究結(jié)果表明，硝酸銨可以不同程度的增加 RuBP 羧化酶各亞基基因的表達(dá)量。Parry 等研究認(rèn)為 RuBP 羧化酶基因的表達(dá)量與酶含量之間在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)[11]，提高 RuBP 羧化酶的活性可以增加光合產(chǎn)物的量[15]。由本試驗(yàn)結(jié)果又可知，水稻劍葉中 RuBP 羧化酶各亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量及葉片全氮和 NO3--N 含量都隨著穗肥氮素施用量的增加而增加，并且 RuBP羧化酶各亞基基因的表達(dá)量與葉片全氮和 NO3--N 含量呈極顯著的正相關(guān)。因此，增加氮素營(yíng)養(yǎng)之所以能提高水稻葉片光合效率，是因?yàn)樘岣吡巳~片含氮量，進(jìn)而提高 RuBP 羧化酶各亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，致使提高 RuBP 羧化酶的含量，最終提高 RuBP羧化酶的活性，而且增加氮素營(yíng)養(yǎng)還能延長(zhǎng) RuBP羧化酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)峰值的持續(xù)時(shí)間，為進(jìn)一步提高葉片光合效率提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。NO3--N 對(duì) RuBP羧化酶活性的調(diào)節(jié)作用主要是通過 RuBP 羧化酶基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。

Tabuchi 等[16]研究結(jié)果表明，GS1;1 對(duì)于水稻籽粒灌漿起非常關(guān)鍵的作用，OsGS1;1 缺失水稻突變體植株的灌漿速率和灌漿程度都嚴(yán)重降低，并且 OsGS1;3不能補(bǔ)償 OsGS1;1 的功能。劉麗等[17]研究指出，谷氨酰胺合成酶活性的增加會(huì)增加籽粒的灌漿程度。在水稻灌漿成熟期增加植株谷氨酰胺合成酶的含量和活性將有利于水稻籽粒灌漿過程。Hye 等[18]、Cai等[19]研究結(jié)果表明，谷氨酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的升高會(huì)顯著增加組織內(nèi)谷氨酰胺合成酶的含量。Cao 等[20]指出水稻組織內(nèi) NO3--N 含量的升高對(duì)谷氨酰胺合成酶的活性有正向調(diào)節(jié)作用。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，穗肥氮素施用量的增加使水稻灌漿中后期葉片和籽粒中 GS 同工型基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量明顯升高，而且也提高 NO3--N 含量。因此，增加穗肥氮素施用量不僅可以提高 GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量為提高 GS 含量保證物質(zhì)基礎(chǔ)，而且 NO3--N 的累積還有利于提高其 GS 活性。OsGS1;1 和 OsGS1;3 含量及活性的增加會(huì)加快葉片中干物質(zhì)向籽粒中運(yùn)輸，加快籽粒的灌漿速率[16]。而 OsGS2 活性的增加能夠有效的保護(hù)光合組織受到高濃度 NH4+-N 破壞[21]。所以增加灌漿成熟期氮素營(yíng)養(yǎng)無論對(duì)提高水稻葉片光合作用還是加快籽粒灌漿都非常有利。在水稻生產(chǎn)上以提高產(chǎn)量為目的的超高產(chǎn)栽培，齊穗期應(yīng)適當(dāng)施用氮肥，以提高灌漿成熟期葉片和籽粒的氮濃度，為提高葉片光合效率和加快籽粒灌漿進(jìn)而提高粒重和成熟度提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，Rubisco 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與NH4

+-N 含量間、GS 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與組織內(nèi) NO3--N含量間相關(guān)性都不大，說明 NH4+-N 對(duì) RuBP 羧化酶活性和 NO3--N 對(duì) GS 活性的調(diào)節(jié)作用并不是通過基因轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，而是通過其它途徑，因此進(jìn)一步深入研究 NH4+-N 和 NO3

--N 對(duì)酶活性的調(diào)控機(jī)理，對(duì)有效控制該酶活性大小，進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量和改善稻米品質(zhì)很有意義。

[1]金 正勛, 錢春 榮, 楊靜等. 水稻灌漿成熟 期 籽粒谷氨酰胺 合成酶活性變化及其與稻米品質(zhì)關(guān)系的初步研究 [J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2007, 21(1)： 103-106. Jin Z X, Qian C R, Yang J, et al. Changes of activity of glutamine synthetase during grain filling and its influence on rice grain quality[J]. Chinese Journal of Rice Science, 2007, 21(1)： 103-106.

[2]Forde B G. Local and long-range signaling pathways regulating plant responses to nitrate [J]. Annual Review of Plant Biology, 2002, 53(53)： 203-224.

[3]Sugiharto B, Sugiyama T. Effects of nitrate and ammonium on gene expression of phosphoenolpyruvate carboxylase and nitrogen metabolism in maize leaf tissue during recovery from nitrogen stress [J]. Plant Physiology, 1992, 98(98)： 1403-1408.

[4]Oliveira I C, Coruzzi G M. Carbon and amino acids reciprocally modulate the expression of glutamine synthetase in arabidopsis [J]. Plant Physiology, 1999, 121(121)： 301-310.

[5]Evans J R. Photosynthesis and nitrogen relationships in leaves of C 3 plants [J]. Oecologia, 1989, 78(1)： 9-19.

[6]Koichi M, Tomoko H, Shuji M, et al. Unusual small subunit that is not expressed in photosynthetic cells alters the catalytic properties of rubisco in rice [J]. Plant Physiology, 2014, 164(1)： 69-79.

[7]Suzuki Y, Ohkubo M, Hatakeyama H, et al. Increased rubisco content in transgenic rice transformed with “sense” rbcs gene [J]. Plant & Cell Physiology, 2007, 48(4)： 626-637. [8]Jain M, Nijhawan A, Tyagi A K, et al. Validation of housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative real-time pcr [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2006, 345(2)： 646-651.

[9]Gordon S A, Fleck A, Bell J. Optimal conditions for the estimation of ammonium by the berthelot reaction [J]. Annals of Clinical Biochemistry, 1978, 15(5)： 270-275.

[10]Oliveira I C, Timothy B, Knight T J, et al. Overexpression of cytosolic glutamine synthetase. Relation to nitrogen, light, and photorespiration [J]. Plant Physiology, 2002, 129(3)： 1170-1180.

[11]Parry M A, Andralojc P J, Mitchell R A, et al. Manipulation of rubisco： The amount, activity, function and regulation [J]. Nature Medicine, 2013, 19(5)： 536-538.

[12]Andersson I, Backlund A. Structure and function of rubisco[J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2008, 46(3)： 275-291.

[13]剛爽, 王敬國(guó), 楊亮等. 氮素用量對(duì)寒地水稻氮代謝關(guān)鍵酶活性的

影響 [J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究, 2010, 31(2)： 224-227.

Gang S, Wang J G, Yang L, et al. Effects of nitrogen level on key enzyme to nitrogen metabolism of rice in cold region[J]. Research of Agricultural Modernization, 2010, 31(2)： 224-227.

[14]Miyazaki N, Ueno O, Saitou K. Effects of nitrogen on the expression of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit multigene family members in rice (Oryza sativa L.) [J]. Plant Production Science, 2013, 16(1)： 71-82.

[15]Parry M A, Andralojc P J, Scales J C, et al. Rubisco activity and regulation as targets for crop improvement [J]. Journal of Experimental Botany, 2013, 64(3)： 717-730.

[16]Tabuchi M, Sugiyama K, Ishiyama K, et al. Severe reduction in growth rate and grain filling of rice mutants lacking osgs1;1, a cytosolic glutamine synthetase1;1 [J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2005, 42(5)： 641-651.

[17]劉麗, 鄒德堂. 氮素用量對(duì)水稻籽粒谷氨酰胺合成酶活性及產(chǎn)量的

影響 [J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 40(10)： 1-4.

Liu L, Zou D T. Effect of nitrogen application on glutamine synthetase activity and yield of rice grain[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2009, 40(10)： 1-4.

[18]Hye Jung L, Abdula S E, Dae Won J, et al. Overexpression of the glutamine synthetase gene modulates oxidative stress response in rice after exposure to cadmium stress [J]. Plant Cell Reports, 2013, 32(10)： 1521-1529.

[19]Cai H M, Xiao J H, University H A. Co-suppressed glutamine synthetase2 gene modifies nitrogen metabolism and plant growth in rice [J]. Chinese Science Bulletin, 2010, 55(9)： 823-835.

[20]Cao Y, Fan X R, Sun S B, et al. Effect of nitrate on activities and transcript levels of nitrate reductase and glutamine synthetase in rice [J]. Pedosphere, 2008, 18(5)： 664-673.

[21]Vikas Dhikav M D, Gupta S, Dm K S A. Regulation of glutamine synthetase isoforms in two differentially drought-tolerant rice (Oryza sativa L.) cultivars under water deficit conditions [J]. Plant Cell Reports, 2013, 32(2)： 183-193.

Expression response of Rubisco and GS isoform gene to the ratio of tillering and heading nitrogen fertilization at rice filling stage

ZHU Fang-xu, GUO Xue-dong, TONG La-ga, ZHANG Yu-lei, PAN Dong, LI Ming-yue,
LI Dan, ZHANG Zhong-chen, JIN Zheng-xun*
( College of Agronomy, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China )

【Objectives】Nitrogen nutrition affects the transcription level of ribulose 1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) and glutamine synthetase (GS) gene, and studying the relationship between the gene expression and nitrogen supply levels will help understanding mechanism of nitrogen nutrition on rice growth and nitrogen use efficiency at the molecular regulation level.【Methods】In a pot experiment, two rice cultivars of multi-panicle and high yield type and heavy panicle and super japonica cultivar in cold region were used as test materials. The N∶P2O5∶K2O input ratio was 1∶0.5∶1. Half of N fertilizer was basal applied, the left was divided into tillering fertilizer and panicle fertilizer, and four ratios of tillering to panicle fertilizers were designed, 10%∶40%, 20%∶30%, 30%∶20% and 40%∶10%. The transcription expression of Rubisco and GSgene and the accumulation of different forms of nitrogen in rice leaves at the filling stage were investigated.【Results】The results showed that the contents of total N, NO3--N and NH4+-N of leaves and grains of rice were significantly increased with the increase of the tillering fertilizer rate. Simultaneously, the expression levels of the large and small subunit genes of Rubisco were increased in different extents, among them the expression levels of OsRBCSL, OsRBCS2 and OsRBCS4 were up-regulated significantly, while those of OsRBCS3 and OsRBCS5 were up-regulated to some extent, and the high expression duration of Rubisco subunits gene were extended. The expression level of OsGS1;1 in leaves and grains was enhanced at the middle and late filling stage, while those of OsGS2 gene only showed high expression level in leaves at the middle and late filling stage, and those of OsGS1;3 gene exhibited high expression level during the whole filling stage. The expression levels of five rubisco subunit genes had significant or highly significant positive correlation with the contents of NO3--N and total nitrogen in leaves, and the expression levels of three glutamine synthetase isoenzyme gene had significant or highly significant positive correlation with the contents of NH4+-N and total nitrogen in leaves and grains.【Conclusions】The expression dynamic of OsRBCL and GS genes are not responded to different cultivars or nitrogen supply during the filling stage. High contents of NO3--N and total nitrogen in leaves significantly increased the amount of Rubisco gene transcriptional expression, and high contents of NH4+-N and total nitrogen in leaves and grains significantly increased the amount of GS gene transcriptional expression.

japonica rice; nitrogen; filling stage; Rubisco; GS; gene expression

2016-03-24 接受日期：2016-08-05

科技部“十三五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD23B05-11）；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目；黑龍江省糧食產(chǎn)能提升協(xié)同創(chuàng)新中心資助。

朱方旭（1987—），男，黑龍江大慶人，碩士研究生，從事水稻遺傳育種研究。E-mail:zhufangxu0109@163.com

* 通信作者 E-mail:zxjin326@hotmail.com

+-N 和全氮含量間均呈顯著或極顯著的正相關(guān)?！窘Y(jié)論】在灌漿過程中 OsRBCL 基因和 GS 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化動(dòng)態(tài)不因品種或氮素營(yíng)養(yǎng)不同而發(fā)生質(zhì)的變化，不同基因?qū)Φ貭I(yíng)養(yǎng)的響應(yīng)程度并不相同，增加葉片 NO3--N 和全氮含量，可以顯著提高 Rubisco 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，增加灌漿成熟期葉片和籽粒的 NH4+-N 和全氮含量，可以顯著提高葉片和籽粒的 GS 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。