通心絡對巨噬細胞極化的影響

李紅蓉，常麗萍，劉玉金，魏 聰，梁俊清，賈振華

[1. 河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2.國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊 050035；3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡病學重點學科，河北 石家莊 050035；4.河北省絡病重點實驗室，河北 石家莊 050035]

◇復方藥物藥理學◇

通心絡對巨噬細胞極化的影響

李紅蓉1,2，常麗萍1,2，劉玉金1,2，魏 聰2,3，梁俊清3,4，賈振華1,2

[1. 河北醫(yī)科大學研究生學院，河北 石家莊 050017；2.國家中醫(yī)藥管理局重點研究室(心腦血管絡病)，河北 石家莊 050035；3.國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)絡病學重點學科，河北 石家莊 050035；4.河北省絡病重點實驗室，河北 石家莊 050035]

目的 研究通心絡對巨噬細胞向M2、M1型極化的影響及其對Notch信號通路的作用。方法 采用PMA分別聯(lián)合IL-4、LPS誘導THP-1細胞分別向M2、M1型巨噬細胞極化并給予通心絡進行干預，檢測其標志分子IL-10、TNF-α、IL-6的表達及巨噬細胞極化相關Notch信號通路蛋白的表達。結(jié)果 M2組細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平升高，IL-6、TNF-α的水平差異無統(tǒng)計學意義；M1組細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平明顯降低，IL-6、TNF-α水平明顯升高；通心絡組細胞培養(yǎng)上清中IL-10水平升高，IL-6、TNF-α水平下降。M2組細胞active Notch-1、DLL4、Hes-1蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，M1組細胞active Notch-1、DLL4、Hes-1蛋白表達明顯升高，通心絡組細胞active Notch-1、DLL4、Hes-1蛋白表達明顯降低，各組Notch-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 通心絡可抑制巨噬細胞向M1型極化，其機制可能與抑制Notch-1信號通路活化有關。

動脈粥樣硬化； 通心絡； 巨噬細胞； 極化； Notch； 炎癥

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)病變部位同時存在M1和M2型巨噬細胞，是斑塊形成、纖維帽破裂和血栓形成的關鍵因素[1]。在不穩(wěn)定斑塊中以M1型為主，而在穩(wěn)定斑塊組織中以M2型為主[2]。M1型由于其促炎及組織損傷作用在早期AS形成過程中占主導作用；M2型巨噬細胞，釋放抑炎因子，促進斑塊纖維帽形成，增強斑塊穩(wěn)定性[3]。Notch信號是巨噬細胞生物學功能的關鍵調(diào)節(jié)器，激活Notch信號能促進巨噬細胞向M1型分化，阻斷Notch信號后，即使給予M1型誘導因素，巨噬細胞也不能極化為M1型，而是向M2型極化[4]。近來研究表明通心絡可以從多方面、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，但尚未見到通心絡對于巨噬細胞極化的研究[5]。本實驗將就通心絡能否通過阻斷Notch信號通路活化起到抑制巨噬細胞向M1型極化并減少炎癥因子產(chǎn)生的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要儀器 THP-1細胞(中國科學院上海細胞庫)，通心絡超微粉(石家莊以嶺藥業(yè))，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(Amersco公司)，佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA，Sigma公司)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS，Sigma公司)，人重組IL-4(美國Peprotech公司)，IL-10、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(Abcam公司)，兔抗人Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1抗體(Abcam公司)，BCA蛋白定量分析試劑盒、細胞核/細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒(Pierce公司)，分光光度計、多功能酶標儀(BioTek公司)，odyssey掃膜儀(Li-Cor公司)、顯微鏡(Zeiss公司)、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)。

1.2 通心絡超微粉溶液的制備 參照文獻[6]制備通心絡超微粉溶液，取適量通心絡超微粉溶于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，超聲促溶1 h，6 500×g離心10 min，收集上清液并用0.22 μm微孔過濾器過濾除菌，離心所得沉淀于60℃烘干并稱量，以計算和校正所得溶液中藥物濃度，于-20℃保存?zhèn)溆?，用時稀釋至目標濃度。

1.3 細胞培養(yǎng) 用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。實驗分為5組，取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板或6 cm皿中培養(yǎng)，待細胞生長穩(wěn)定后，分別對各組細胞進行處理。對照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；PMA組：含PMA(5 μg·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；M2組：含PMA(5 μg·L-1)、mrIL-4(100 μg·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；M1組：含PMA(5 μg·L-1)、LPS(200 μg·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；通心絡組：含TXL(300 mg·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h，繼而用含PMA(5 μg·L-1)、LPS(200 μg·L-1)、TXL(300 mg·L-1)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收取各組細胞培養(yǎng)上清或蛋白用于指標檢測。

1.4 倒置顯微鏡觀察巨噬細胞形態(tài)變化 將各組THP-1細胞進行相應處理后，置于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.5 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中M2型巨噬細胞標志分子IL-10、M1型巨噬細胞標志分子IL-6、TNF-α的水平 將各組細胞進行相應處理后，收集細胞培養(yǎng)上清，按照各指標試劑盒所附操作方法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.6 Western blot法檢測細胞目的蛋白表達 將各組THP-1細胞進行相應處理后，提取各組細胞蛋白，用BCA蛋白定量分析試劑盒進行蛋白定量。Western blot法檢測Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1蛋白表達。用Odyssey掃膜儀對結(jié)果進行半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值表示檢測樣品中目的蛋白的相對含量進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞形態(tài)變化 THP-1細胞為懸浮細胞，經(jīng)PMA誘導后發(fā)生貼壁，PMA、IL-4誘導的THP-1細胞偽足伸展；PMA、LPS誘導的THP-1細胞形態(tài)狹長。其形態(tài)特征的差異可能是由于M2型巨噬細胞有較強的吞噬功能。見Fig 1。

Fig 1 The morphological change of M2 and M1 macrophages(40×)

2.2 細胞培養(yǎng)上清中IL-10、IL-6、TNF-α、水平 ELISA結(jié)果顯示，Control組與PMA組比較，IL-10、IL-6、TNF-α的水平差異無統(tǒng)計學意義，說明實驗濃度的PMA對巨噬細胞極化表型沒有影響。與對照組比較，M1組IL-6、TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；M2組IL-10水平升高 (P<0.01)，IL-6、TNF-α的水平差異無統(tǒng)計學意義；說明M2和M1型巨噬細胞模型建立成功。與M1組比較，在M1型誘導因素存在的情況下，TXL組IL-6、TNF-α的水平明顯降低(P<0.01)，說明TXL可以抑制LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化。見Tab 1。

Tab 1 Expression of IL-10,IL-6,TNF-α(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol；△△P<0.01vsM1；##P<0.01vsM2

2.3 細胞Notch信號通路蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，Control組與PMA組比較，Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，可以排除實驗濃度的PMA對Notch信號通路產(chǎn)生的影響。與對照組和M2組比較，M1組Notch-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與M1組比較，TXL組active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表達明顯降低(P<0.01)；說明TXL可以抑制LPS誘導的巨噬細胞Notch信號通路的活化。見Fig 2。

Fig 2 The relative protein expression of Notch-1,active Notch-1,DLL4,Hes-1

3 討論

單核/巨噬細胞在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用。研究表明，AS病變部位同時存在M1型和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞分泌較多的炎癥因子而促進AS的發(fā)展；M2型高表達抑炎因子而促進組織修復和穩(wěn)定斑塊[3]，而且M2型巨噬細胞在斑塊逆轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮重要作用，在斑塊逆轉(zhuǎn)動物模型中觀察到了M2型巨噬細胞相關標志基因高表達[7]。炎癥是血管內(nèi)皮的重要損傷因素，而血管內(nèi)皮的損傷又是AS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此抑制M1型巨噬細胞的形成有助于防止AS的發(fā)生發(fā)展。

采用PMA分別聯(lián)合IL-4、LPS建立M2型和M1型巨噬細胞模型[8]。觀察到PMA可以誘導懸浮的THP-1細胞貼壁，LPS誘導的巨噬細胞形態(tài)狹長，偽足較少；IL-4誘導的巨噬細胞形態(tài)不規(guī)則有較多的偽足，可能與M2型巨噬細胞具有較強的吞噬功能有關[9]。LPS誘導的巨噬細胞高表達M1型標志分子IL-6和TNF-α，低表達M2型標志分子IL-10；而IL-4誘導的巨噬細胞高表達IL-10，低表達IL-6和TNF-α，表明M1和M2型巨噬細胞極化模型的成功建立。在M1型巨噬細胞誘導因素存在的條件下，通心絡可以抑制巨噬細胞IL-6和TNF-α的表達，上調(diào)IL-10的表達，表明通心絡可以抑制巨噬細胞向M1型極化。采用Notch信號抑制劑GSI作用于LPS誘導的巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)GSI可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的方式下調(diào)TNF-α的蛋白表達，而對IL-10 mRNA有上調(diào)作用，對IL-6 mRNA有下調(diào)作用[10]。通心絡的作用與Notch信號抑制劑GSI的作用具有一致性，因此，有理由推測通心絡抑制巨噬細胞向M1型極化的作用可能涉及到Notch信號通路的參與。

Notch信號通路是巨噬細胞生物學功能的關鍵調(diào)節(jié)器，激活Notch信號可促進巨噬細胞向M1型極化[4]。LPS是TLR4受體激動劑，是誘導巨噬細胞向M1型極化的經(jīng)典因素，可以通過MyD88 依賴或非依賴的途徑上調(diào)巨噬細胞Notch-1的表達，活化Notch下游基因Hes1和Deltex的表達。NF-κB信號通路是Notch信號通路調(diào)節(jié)巨噬細胞促炎癥反應的主要通路，LPS可以引起NF-κBp50和NF-κBp65核轉(zhuǎn)位增強，而應用GSI或敲除Notch信號的方式阻斷Notch信號通路可以明顯抑制p50的核轉(zhuǎn)位而對p65的核轉(zhuǎn)位沒有影響。LPS可以劑量-時間依賴性的促進單核細胞DLL4 mRNA和蛋白的表達，沉默TLR4基因或使用NF-κB抑制劑SN50可抑制DLL4 mRNA的表達[11]。本研究實驗結(jié)果顯示，IL-4誘導的M2組巨噬細胞Notch-1及其活化形式active Notch-1、配體DLL4及下游關鍵轉(zhuǎn)錄因子Hes-1表達與對照組比較無明顯變化；而LPS刺激可以促進巨噬細胞Notch信號通路的活化，上調(diào)active Notch-1、DLL4和Hes-1的蛋白表達；應用通心絡可以抑制LPS刺激引起的巨噬細胞active Notch-1、DLL4和Hes-1的蛋白表達。實驗結(jié)果表明，通心絡可以通過抑制Notch信號的活化，抑制LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化，減少炎癥因子的表達。

Notch信號途徑是復雜的信號網(wǎng)絡，多種Notch受體和配體同時存在且多種胞內(nèi)和胞外蛋白可以通過不同的機制調(diào)控Notch信號；Notch信號在激活后還可以觸發(fā)其他信號途徑。Notch信號通路與其他調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的信號通路具有廣泛的網(wǎng)絡聯(lián)系，如Toll樣受體(TLRs)，干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor,IRF)、NF-κB、MAPK和JAK/STAT信號通路。多種影響Notch信號的復雜因素在整個信號傳導過程中相互聯(lián)系，使得Notch信號成為復雜的信號網(wǎng)絡[12]。對于通心絡如何作用于Notch信號通路及其作用是否涉及其他通路將進行進一步研究。

(致謝：本實驗于河北省絡病重點實驗室完成！)

[1] Mangge H, Becker K, Gostner J M. Antioxidants,inflammation and cardiovascular disease[J].WorldJCardiol, 2014, 6(6): 462-77.

[2] Quillard T, Charreau B. Impact of notch signaling on inflammatory response in cardiovascular disorders[J].IntJMolSci, 2013, 14(4): 6863-88.

[3] Chen F Y, Zhou J, Guo N, et al. Curcumin retunes cholesterol transport homeostasis and inflammation respose in M1 macrophage to prevent atherostasis[J].BiochermBiophysResCommun, 2015, 15(10):1-7.

[4] Singla R D, Wang J, Singla D K. Regulation of Notch 1 signaling in THP-1 cells enhances M2 macrophage differentiation[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol, 2014, 307(11):H1634-42.

[5] 李紅蓉,張 肖,常麗萍,等.通心絡膠囊抗動脈粥樣硬化研究進展[J]. 中成藥, 2016, 38(2):386-91.

[5] Li H R, Zhang X, Chang L P, et al. The research progression on anti-atherosclerosis of Tongxinluo[J].ChinTraditPatentMed, 2016, 38(2):386-91.

[6] Cui H H, Li X D, Li N,et al.Induction of autophagy by tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury[J].JCardiovascPharmacol,2014,64(2):180-90.

[7] 王 姍, 孫桂波, 羅 云, 孫曉波. 動脈粥樣硬化斑塊逆轉(zhuǎn)的研究進展[J]. 中國藥理學通報, 2016, 32(8): 1059-63.

[7] Wang S, Sun G B, Luo Y, Sun X B.Advanced research progress on atherosclerosis plague regression[J].ChinPharmacolBull, 2016, 32(8):1059-63.

[8] Zhang F, Liu H, Jiang G, et al. Changes in the proteomic profile during the differential polarization status of the human monocyte-derived macrophage THP-1 cell line[J].Proteomics, 2015, 15(4): 773-86.

[9] Horckmans M, Ring L, Duchene J, et al. Neutrophils orchestrate post-myocardial infarction healing by polarizing macrophages towards a reparative phenotype[J].EurHeartJ, 2017,38(3):187-97.

[10]Palaga T, Buranaruk C, Rengpipat S, et al. Notch signaling is activated by TLR stimulation and regulates macrophage functions[J].EurJImmunol, 2008, 38(1): 174-83.

[11]Fung E, Tang S M, Ganner J P,et al. Delta-like 4 induces notch signaling in macrophages:implications for inflammation[J].Circulation, 2007, 115(23): 2948-56.

[12]Shang Y, Smith S, Hu X. Role of Notch signaling in regulating innate immunity and inflammation in health and disease[J].ProteinCell, 2016,7(3):159-74.

Effect of Tongxinluo on polarization of macrophages

LI Hong-rong1,2, CHANG Li-ping1,2, LIU Yu-jin1,2, WEI Cong2,3, LIANG Jun-qing3,4, JIA Zhen-hua1,2

[1.GraduateSchoolofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2.KeyLaboratoryofStateAdministrationofTCM(Cardio-CerebralVesselCollateralDiseases),Shijiazhuang050035,China;3.KeyDisciplinesofStateAdministrationofTCMforCollateralDiseases,Shijiazhuang050035,China;4.KeyLaboratoryofHebeiProvinceforCollateralDiseases,Shijiazhuang050035,China]

Aim To study the effect of Tongxinluo on the polarization of macrophages to type M2 and M1, and on Notch signaling pathway.Methods THP-1 was respectively induced by PMA and IL-4 or LPS to M2 and M1 type polarized macrophages, and treated by Tongxinluo. The expressions of marker molecules IL-10, TNF-α, IL-6 and protein of Notch signaling pathway were detected.Results The level of IL-10 increased in M2 group and there was no statistical difference on the level of IL-6 and TNF-α; the level of IL-10 decreased and IL-6, TNF-α increased in M1 group; the level of IL-10 increased and IL-6,TNF-α decreased in TXL group. There was no statistical difference in the expression of active Notch-1, DLL4 and Hes-1 between control group and M2 group; the expression of active Notch-1, DLL4 and HES-1 increased significantly in M1 group; the expression of active Notch-1, DLL4 and HES-1 decreased significantly in TXL group; there was no significant difference in the expression of Notch-1 protein in each group.Conclusion The polarization of macrophages to M1 type can be inhibited by Tongxinluo, and its mechanism may be related to the inhibition of activation of Notch-1 signaling pathway.

atherosclerosis; tongxinluo; macrophage; polarization; notch; inflammation

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1248.050.html

2016-11-10,

2016-12-15

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No 2012CB518606)

李紅蓉(1989-)，女，博士生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病防治，Tel:0311-60703020,E-mail:hongrongli@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.025

A

1001-1978(2017)04-0577-04

R287；R329.24；R392.12；R541.4