群體和單細胞微囊藻對短期高光脅迫的生理響應

徐 沙楊燕君許金鑄施軍瓊宋立榮吳忠興

(1. 西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室, 重慶 400715; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

群體和單細胞微囊藻對短期高光脅迫的生理響應

徐 沙1楊燕君1許金鑄1施軍瓊1宋立榮2吳忠興1

(1. 西南大學三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室, 重慶市三峽庫區(qū)植物生態(tài)與資源重點實驗室, 重慶 400715; 2. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072)

為了探討不同形態(tài)的微囊藻(Microcystis)對光的耐受能力及其應對機制, 研究比較了短期高光強條件下群體微囊藻和單細胞微囊藻的生理響應, 結果表明, 在高光強脅迫下, 群體和單細胞微囊藻的葉綠素含量、最大電子傳遞速率(ETRmax)均降低, 但與單細胞微囊藻相比, 群體微囊藻的下降幅度較小; 在高光強脅迫下, 群體微囊藻的過氧化氫酶(CAT)與超氧化物歧化酶(SOD)的活性均顯著增加, 而單細胞微囊藻只有CAT活性增加; 在短期高光脅迫下, 群體微囊藻的死亡率沒有顯著變化。這些結果表明群體微囊藻比單細胞微囊藻能耐受更高的光強, 也暗示了群體微囊藻在野外高光強條件下更具競爭優(yōu)勢。

群體和單細胞微囊藻; 光強; 生理響應; 藍藻水華

近年來隨著工農業(yè)的發(fā)展, 湖泊內氮、磷含量不斷增加, 使得水體富營養(yǎng)化趨勢日益嚴重, 藍藻水華頻繁發(fā)生, 對環(huán)境和人類產生了嚴重危害[1,2]。在長期的進化過程中, 藍藻已經發(fā)展了一套獨特的生理學機制和適應特性, 形成了極強的生態(tài)競爭,導致了水華的形成。然而, 藍藻如何在短時間內形成水華, 其機制一直受到廣泛關注。

在藍藻水華的形成過程中, 光是重要的因素之一。研究表明藻類光合作用和生長速率的調節(jié)往往與其對不同光質和光譜的光積累響應有密切關系[3]。但當長期暴露320 μE/(m2·s)光強下, 往往導致藻類大量死亡, 其原因是在高光強下, 光氧化和光呼吸抑制了光合作用效率[4]。然而, 在水華形成的過程中, 藍藻細胞往往暴露在高光強下, 藍藻如何適應這種高光強條件則未見探討。

微囊藻(Microcystis)是一種全世界廣泛分布的水華藍藻, 其水華的發(fā)生和產生的微囊藻毒素已經引起了許多的生態(tài)環(huán)境問題[1,5]。Abeliovich等[6]研究發(fā)現微囊藻若長期培養(yǎng)在高光強下, 藻細胞易導致光氧化過程的形成, 降低光合效率。然而, 該研究主要以實驗室培養(yǎng)的單細胞微囊藻為材料, 研究已表明群體微囊藻解聚的過程中可能引起其生理生化指標及其抗性的改變[7], 因而不能很好反映自然條件下微囊藻的生理生化特征。在自然環(huán)境條件下微囊藻主要是以群體形式存在[8], 因此, 本研究比較了群體微囊藻和單體微囊藻在短期高光強培養(yǎng)下的生理生化響應, 旨在探究群體微囊藻對高光強的耐受規(guī)律及其響應機制, 為闡明微囊藻水華的形成及發(fā)生機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藻株來源和培養(yǎng)

實驗選用藻種來源于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB-collection), 各藻株的相關特征信息如表 1所示。藻株的培養(yǎng)條件為: 光強25 μE/(m2·s),溫度(25±1)℃, 光周期12h∶ 12h。當藻株生長到對數期時, 藻液經離心后, 獲得對數期藻細胞, 然后加入新鮮的BG11培養(yǎng)液, 接種濃度為A680=0.2, 置光強為25和350 μE/(m2·s)下, 持續(xù)光照培養(yǎng)24h, 其中25 μE/(m2·s)為對照組。每個處理實驗設3個平行。

1.2 葉綠素含量和可溶性蛋白的測定

葉綠素用80%丙酮于4℃抽提24h, 離心后, 上清液用分光光度計測定663 nm的光吸收值, 通過Wetsttein公式Chl.a (mg/L)=12.72×A663-2.7×A645計算得到葉綠素含量。總的可溶性的蛋白含量采用考馬斯亮藍結合法測定。

表 1 實驗中所用微囊藻藻株信息Tab. 1 The information of Microcystis used in this study

1.3 最大光化學效率(Fv/Fm)和電子傳遞速率(Electron Transfer Rate, ETR)

用浮游植物熒光分析儀(PHYTO-PAM, Waltz公司, 德國)測定藻細胞的最大光化學效率及電子傳遞速率, 測定方法參見Maxwell等方法[9]。

1.4 抗氧化物酶活性的測定

過氧化氫酶(Catalase, CAT)的活性根據Aebi[10]所描述的方法測定。計算公式為CAT=(Am-As)/ (0.1×V×1×Cp), Cp指蛋白質濃度mg/mL。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性根據Dhindsa等光化還原氧化法[12]進行測定。酶活性采用SOD=[(Amax-A560)/Amax]/0.5公式計算。

1.5 細胞死亡率

所有樣品經FDA (Fluorescein diacetate)染色后,用流式細胞儀(Epics Altra Coulter, Beckman, USA)對細胞活性進行檢測。群體微囊藻的處理及FCM測定步驟見Wu等方法[7], 其中FCM激發(fā)光為488 nm,檢測熒光為505—545 nm。

1.6 數據統(tǒng)計

所有實驗設置3個平行, one-way ANOVA進行LSD顯著性檢驗(SPSS)。

2 結果

2.1 不同形態(tài)微囊藻葉綠素含量比較

在短期高光強處理下, 兩種形態(tài)微囊藻的葉綠素a的含量均顯著下降(P＜0.05, 圖 1)。24h時, 單體微囊藻7806、942和905的Chl. a含量比初始時分別降低了96.2%、65.6%和87.3%, 群體微囊藻938、907和909的Chl. a含量分別降低了50%、30.4%和 29.5%。而在25 μE/(m2·s)光強下, 培養(yǎng)24h后, Chl. a含量變化不顯著(圖 1)。

2.2 最大光合效率(Fv/Fm)的變化

高光強培養(yǎng)24h后, 比較了6株微囊藻的最大光合效率(Fv/Fm), 結果表明群體和單細胞微囊藻的最大光合效率均顯著性降低(ANOVA, P＜0.01, 圖 2)。單細胞微囊藻7806、942和905 分別下降了86.1%、100%和90.9%; 群體微囊藻、938、907和909分別下降了29.7%、56%和51.4%。

2.3 群體和單體微囊藻ETRmax的變化

圖 1 光強對群體和單體微囊藻葉綠素含量的影響Fig. 1 The effects of light intensity on Chl. a of colonial and single-celled Microcystis strains*表示P＜0.05; **表示P＜0.01; 下同* means P＜0.05 level; ** means P＜0.01 level; the same applies below

圖 2 光強對單體和群體微囊藻最大光合效率(Fv/Fm)的影響Fig. 2 The effects of light intensity on Fv/Fmof colonial and single-celled Microcystis strains

由表 2可知, 單體微囊藻在高光強培養(yǎng)3h后,ETRmax下降了73.4%—92.8%(ANOVA, P＜0.01), 而群體微囊藻938、907和909的ETRmax分別由0時的45.2、87.5和63.7 electrons/(m2·s)下降到30.1、70.2和51.6 μmol electrons/(m2·s)。24h, 群體和單體微囊藻的ETRmax比3h時有所增加。

表 2 群體和單體微囊藻的ETRmax比較Tab. 2 The comparison of ETRmaxof colonial and single-celled Microcystis

2.4 群體和單細胞微囊藻的抗氧化酶活性的變化

對群體和單細胞微囊藻的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)分析表明, 群體微囊藻和單細胞微囊藻在應對光脅迫方面有明顯的差異(圖 3)。24h時, 群體微囊藻的SOD酶活性比初始時增加了1.3—3.4倍(圖 3a)。然而, SOD酶活性在單細胞微囊藻中并未表現出明顯變化。

圖 3 群體和單細胞微囊藻抗氧化酶活性的變化Fig. 3 The effects of light intensity on the enzymes activities of colonial and single-celled Microcystis strains

對群體和單細胞微囊藻的CAT酶活性比較分析表明(圖 3b), 無論是群體微囊藻還是單細胞微囊藻, 它們的CAT酶活性均呈現出顯著增加態(tài)勢(ANOVA, P＜0.05)。然而, 與群體微囊藻相比, 單細胞微囊藻CAT酶活顯著增加(ANOVA, P＜0.05)。單細胞微囊藻24h的CAT酶活分別是0的3.5—5.9倍, 而群體微囊藻則為1.4—1.8倍。在正常光照培養(yǎng)下的微囊藻, 其SOD和CAT酶活均未發(fā)現明顯的變化(圖 3)。

2.5 群體和單細胞微囊藻細胞死亡率的變化

如表 3所示, 在高光強處理24h后, 群體與單細胞微囊藻的死亡率均有上升, 但多數細胞仍保持相對較高的活性。在24h的高光強處理后, 單細胞微囊藻死亡率與初始值相比增加了約1.5—7.8倍, 而群體微囊藻死亡率與初始值相比增加了約1.3—1.5倍。

表 3 光強對群體和單細胞微囊藻細胞死亡率的影響Tab. 3 The effects of high light intensity on the mortality rate of colonial and single-celled Microcystis

3 討論

3.1 光強對不同形態(tài)微囊藻葉綠素的影響

光是所有光合自養(yǎng)生物的重要影響因素, 不同生物對光的利用能力直接影響其種群分布及結構[13]。Huisman等[14]認為浮游植物對光強的響應及應答取決于種的差異, 這表明外界光強的變化能影響浮游植物的生長和組成。微囊藻是常見的一種水華藍藻, 然而, 其不同形態(tài)種類對光強的響應及應答機制仍未見報道。為了了解微囊藻應對高光脅迫機制, 研究了兩種形態(tài)的微囊藻對高光強的生理生化特征, 結果表明在高光強脅迫下群體和單體微囊藻的葉綠素a均降低, 但單體微囊藻葉綠素降低幅度明顯大于群體微囊藻(圖 1)。這一結果證實了先前對Anacystis nidulans[15]和銅綠微囊藻[16]的研究, 即光強的增加, Chl. a濃度降低。這暗示了群體微囊藻能夠耐受更高的光強。

3.2 光強對不同形態(tài)微囊藻光合效率的影響

Silva等[17]對Synechocystis sp.研究表明在高光強下培養(yǎng), 藻類的光合效率會不斷散失并伴隨著光抑制現象產生。一旦吸收的能量超過消耗的能量,光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)將發(fā)生損害[18], 導致PSⅡ反應中心的電子傳遞失活或鈍化, 甚至導致蛋白D1降解[19]。因此, 若受損的光合系統(tǒng)Ⅱ不及時修復, 類囊體膜上將大量積累失活或鈍化的PSⅡ, 使得光量子產率下降[17]。本研究結果發(fā)現高光強顯著降低了單細胞的Fv/Fm、ETRmax值(圖 2、表 2)。因此, 推測單細胞微囊藻的PSⅡ反應中心被高光強抑制或損傷。然而, 與單細胞微囊藻相比, 群體微囊藻的Fv/Fm和ETRmax降低幅度較少。這進一步說明了群體微囊藻在高光脅迫下表現出更強的耐性。

3.3 抗氧化酶活性對不同光強的響應

Eloff等[20]研究表明水華表層的微囊藻受到高光作用易發(fā)生光氧化作用, 而導致微囊藻細胞死亡。此外, 研究也發(fā)現一些藍藻通過降低自身光合色素的光氧化達到適應水體表面高光強脅迫[21]。而光氧化往往導致了細胞內高水平的自由基(O2-)產生, 因此, 降低細胞體內自由基O2-的傷害則對藍藻的適應策略具有重要的作用。卿人韋等[22]對極大螺旋藻和Canini等[23]對微囊藻的研究表明高光脅迫下大量的抗氧化酶活性的增加。本研究也發(fā)現高光脅迫下群體微囊藻SOD和CAT酶活性和單細胞微囊藻CAT酶活性都顯著增加(圖 3)。這表明微囊藻細胞在高光脅迫下產生了光氧化現象, 導致了大量的清除自由基酶被激活。然而, 群體微囊藻和單細胞微囊在應對光氧化方面存在著一定的差異,群體微囊藻能夠產生SOD和CAT酶來清除光氧化產生的自由基O2-, 而單細胞微囊藻則只通過CAT酶來清除藻細胞內的O2-(圖 3), 表明了在清除自由基能力方面, 相對于單體微囊藻來說, 群體微囊藻具有一定的優(yōu)勢。至于為什么單細胞微囊藻的SOD變化不顯著, 則還有待進一步的研究。

Silva等[17]研究發(fā)現了光限制具有時間效應, 隨著光照時間增長, 聚球藻的光合及熒光活性部分被恢復。我們的研究也證實了這一結論, 即隨著光照時間的增加, 微囊藻的最大電子傳遞速率及最大熒光效率有所增加(表 2), 這說明隨著微囊藻對光強的適應, 其PSⅡ反應中心已部分被修復, 表明了微囊藻對光照強度具有一定的耐受性。此外, 本研究也對群體和單細胞微囊藻的存活率進行了比較, 發(fā)現脅迫處理后, 微囊藻細胞的存活率仍然較高, 說明了在350 μE/(m2·s)光照下微囊藻活力并未被破壞或抑制, 進一步證實了微囊藻能耐受較高的光強。與單細胞相比, 群體微囊藻細胞表現出較低的死亡率, 其原因可能是由于群體微囊藻能產生大量的SOD和CAT來清除光氧化造成的損傷。此外, Tien等[24]對英國5個淡水湖泊進行研究發(fā)現, 微囊藻水華發(fā)生的季節(jié), 水體中胞外多糖(EPS)含量最高。EPS被認為是藍藻抵御極端環(huán)境條件的重要物質[25]。群體微囊藻胞外存在著大量的EPS, 因而在一定程度上保護了細胞免受高光強的損傷, 從而降低了群體微囊藻的光抑制效應, 保證了群體微囊藻的存活率。

綜上所述, 微囊藻能耐受較高的光強, 但與單細胞微囊藻相比, 群體微囊藻葉綠素a和光合受脅迫較小, 表明了群體微囊藻在野外高光強的環(huán)境能夠比單細胞微囊藻更具優(yōu)勢。

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THE PHYSIOLOGICAL RESPONSE OF COLONIAL AND SINGLE-CELLED FORM OF MICROCYSTIS TO SHORT-TERM HIGH STRESS

XU Sha1, YANG Yan-Jun1, XU Jin-Zhu1, SHI Jun-Qiong1, SONG Li-Rong2and WU Zhong-Xing1
(1. Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region (Ministry of Education), Chongqing Key Laboratory of Plant Ecology and Resources Research in Three Gorges Reservoir Region, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Light is one of the important factors for algae growth and product by photosynthesis. This study investigated the physiological response of colonial and single-celled form of Microcystis to light intensity. The results showed that the Chl. a and ETRmaxin colonial and single-celled forms of Microcystis were declined by high light intensity with a bigger decrease in single-celled form of Microcystis. The enzyme activities of SOD and CAT in colonial and singlecelled form of Microcystis were increased by high light intensity. The colonial form of Microcystis decreased the photooxidate damage by increasing SOD and CAT activities, while single-celled Microcystis reduced damage through CAT activity only. The mortality rate of colonial form of Microcystis showed no significantly difference by short-term high light intensity. These suggest that colonial form of Microcystis had higher tolerance to high light intensity when compared with single-celled form of Microcystis, explaining that colonial Microcystis are predominate strains in water blooms.

Colonial and single-celled Microcystis; Light intensity; Physiological response; Cyanobacterial bloom

Q945.78

A

1000-3207(2017)02-0443-05

10.7541/2017.55

2016-01-29;

2016-04-25

國家自然科學基金(31170372); 西南大學博士基金(SWU110065)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31170372); Doctoral Found Project of China SWU (SWU110065)]

徐沙(1991—), 女, 陜西咸陽人; 碩士研究生; 主要從事藻類生理學研究。E-mail: 18883341908@163.com

吳忠興(1975—), 男, 教授; 主要從事藻類生理生態(tài)及分子系統(tǒng)性學研究。E-mail: wuzhx@swu.edu.cn