披堿草×野大麥F1代愈傷組織誘導(dǎo)研究

趙 青，李造哲,*，馬青枝，李 鵬，王文學(xué)，云玲格

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

披堿草×野大麥F1代愈傷組織誘導(dǎo)研究

趙 青1，李造哲1,*，馬青枝2，李 鵬3，王文學(xué)1，云玲格1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)沙漠治理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

以披堿草×野大麥雜種F1幼穗為外植體，設(shè)置不同的激素濃度，獲得適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并選用長(zhǎng)度不同的幼穗為外植體，確定出較為合適的外植體長(zhǎng)度。愈傷組織經(jīng)過多次繼代后，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，通過更換培養(yǎng)基使其恢復(fù)生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最適培養(yǎng)條件為：以長(zhǎng)為2-3cm幼穗為外植體，MS + 3mg/L2,4-D為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MS+2,4-D 3mg/L +KT 0.5mg/L+CH 300mg/L與MS+2,4-D 4mg/L均可改善經(jīng)過長(zhǎng)期繼代生長(zhǎng)質(zhì)量較差的愈傷組織的生長(zhǎng)情況。

披堿草；野大麥；雜種F1；幼穗；愈傷組織

披堿草(Elymusdahuricus)抗寒能力強(qiáng)，草產(chǎn)量、種子產(chǎn)量均較高。野大麥(Hordeumbrevisubulatum)葉量豐富且草質(zhì)柔軟，具有分蘗能力強(qiáng)、返青早、再生性強(qiáng)、抗病蟲害、耐鹽堿等特性〔1-4〕。王照蘭等將披堿草與野大麥進(jìn)行雜交，產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具備了雙親所具有的優(yōu)良特性。在雜交后的F1代，生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，葉量增加，分蘗增多，穗型發(fā)生了一定的改變，顯示出了一定的育種潛力。但雜種F1代高度不育，開放授粉不結(jié)實(shí)，又限制了其生態(tài)價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值的進(jìn)一步利用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置不同的激素配比，通過不同的激素組合，找到較為理想的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并選取不同長(zhǎng)度幼穗作為外植體，觀察愈傷組織的生長(zhǎng)變化，通過實(shí)驗(yàn)確定出適宜誘導(dǎo)愈傷組織的外植體長(zhǎng)度，將適宜的培養(yǎng)基與合適的外植體長(zhǎng)度相結(jié)合，以達(dá)到提高出愈率的目的。多次繼代后，愈傷組織活力明顯下降，增值緩慢，質(zhì)量下降。本實(shí)驗(yàn)通過改變繼代培養(yǎng)基的激素配比，以期改善愈傷組織的生長(zhǎng)情況。

1 愈傷組織的誘導(dǎo)

1.1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為加拿大披堿草×野大麥雜種F1幼穗。

1.1.2 培養(yǎng)條件

在溫度為25±1℃的條件下暗培養(yǎng)，相對(duì)濕度為75%。

1.1.3 基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在披堿草×野大麥雜種F1處于孕穗期時(shí)，選取長(zhǎng)度為1-3cm的幼穗，放入塑封袋內(nèi)保存帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)中將保留一層幼葉的外植體放入燒杯中備用。剝?nèi)ビ兹~，用70%的乙醇消毒一分鐘，并用無菌水沖洗3-4次，再用0.1%的HgCl2消毒2-4分鐘，再用無菌水沖洗5次。將幼穗切成長(zhǎng)度為3mm左右的小段，接種到培養(yǎng)基上。每個(gè)組合12瓶，每瓶接種5段。培養(yǎng)基激素配比為MS+2,4-D(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L)+KT(0mg/L、0.5mg/L)，3%蔗糖，瓊脂粉7g/L，pH=5.8。

1.1.4 幼穗長(zhǎng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取不同長(zhǎng)度的幼穗并按照0.5-1cm、1-2cm、2-3cm、3-4cm、4-5cm進(jìn)行分類。在超凈工作臺(tái)中對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理，方法同上所述，并將幼穗切成3mm左右的小段接入培養(yǎng)基中，每瓶5段，每個(gè)處理12瓶。培養(yǎng)基配比為：MS+2,4-D3.0mg/L，3%蔗糖，瓊脂粉7g/L，pH=5.8。

1.1.5 結(jié)果觀測(cè)與統(tǒng)計(jì)方法

記錄其生長(zhǎng)情況，經(jīng)過25天左右統(tǒng)計(jì)其出愈率，并進(jìn)行繼代培養(yǎng)，出愈率統(tǒng)計(jì)有關(guān)計(jì)算公式如下：

出愈率=(愈傷組織塊數(shù)/接種外植體總塊數(shù))×100%

2 愈傷組織繼代培養(yǎng)基優(yōu)化研究

經(jīng)過多次繼代的愈傷組織生長(zhǎng)速度緩慢，內(nèi)含物質(zhì)減少且有水漬狀非胚性愈傷組織出現(xiàn)，通過改變培養(yǎng)基的激素配比，使其內(nèi)含物質(zhì)增加，愈傷組織恢復(fù)淡黃色、顆粒狀、結(jié)構(gòu)致密、結(jié)合疏松的健康狀態(tài)。本次實(shí)驗(yàn)所用材料為2015年5月中下旬所采集披堿草×野大麥雜種F1幼穗為外植體誘導(dǎo)的愈傷組織，但經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的繼代培養(yǎng)之后，體積增長(zhǎng)慢，質(zhì)量較差?；谠搶?shí)驗(yàn)背景下，本實(shí)驗(yàn)通過更改實(shí)驗(yàn)激素種類和濃度，以達(dá)到恢復(fù)愈傷組織的目的。選取生長(zhǎng)狀況以及大小相近或相似的愈傷組織作為基本材料，切成5mm大小放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每瓶放5塊。每個(gè)處理重復(fù)12瓶。共設(shè)計(jì)四種培養(yǎng)基，I：MS+2,4-D 0.5mg/L+6-BA 1.0mg/L。II：MS+2,4-D 3.0mg/L+KT 0.1mg/L+CH 400mg/L。III：MS+2,4-D 4.0mg/L。IV：MS+2,4-D 5.0mg/L，pH=5.8，蔗糖30g/L，瓊脂粉7g/L。

3 結(jié)果與分析

3.1 基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

披堿草×野大麥雜種F1幼穗在含有不同激素濃度的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，進(jìn)行暗培養(yǎng)3天后外植體開始變白，6天后在切口處出現(xiàn)極少量的乳白色的愈傷組織，15天后微量的乳白色愈傷組織開始產(chǎn)生較為明顯的增殖，25天左右愈傷組織體積增大，表面干燥。在不同激素濃度配比下，F(xiàn)1代幼穗均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織的生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)質(zhì)量不同(表1)。在只含有激素2,4-D的條件下，當(dāng)2,4-D濃度為1.0mg/L、2.0mg/L時(shí)，愈傷組織增殖緩慢，出愈時(shí)間稍長(zhǎng)，體積較小。在2,4-D濃度為3.0mg/L的情況下，愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，且生長(zhǎng)質(zhì)量較好(圖1-A)。當(dāng)2,4-D濃度大于3mg/L時(shí)，愈傷組織的出愈率隨著激素濃度的增加而下降，可見高濃度的2,4-D不利于愈傷組織的形成。當(dāng)KT濃度均為0.5mg/L時(shí)，隨著2,4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸增加，2,4-D濃度為3mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最大，為20%，之后隨著2,4-D濃度的增加誘導(dǎo)率下降。同只含有2,4-D一種激素相比，添加KT后愈傷組織的誘導(dǎo)率均低于只含有同濃度2,4-D一種激素的誘導(dǎo)率。從總體的愈傷組織生長(zhǎng)狀況來看，添加激動(dòng)素KT后愈傷組織出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象(圖1-B)，不含有激動(dòng)素KT的條件下，愈傷組織生長(zhǎng)情況更好。在2,4-D為5mg/L，KT為0.5mg/L的激素組合下，褐化最為嚴(yán)重?？梢姡贔1代愈傷組織的誘導(dǎo)中，生長(zhǎng)激素2,4-D起到了關(guān)鍵作用，而激動(dòng)素KT不適合添加在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

3.2 幼穗長(zhǎng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同長(zhǎng)度的幼穗均可以誘導(dǎo)出愈傷組織(表2)。長(zhǎng)度為0.5-1.0cm的外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)慢，體積較小。2-3cm、3-4cm長(zhǎng)的幼穗出愈率總體差異不大，2-3cm長(zhǎng)的幼穗誘導(dǎo)率略高，質(zhì)量稍好(圖1-C)，之后隨著外植體長(zhǎng)度的增加愈傷組織的出愈率降低。長(zhǎng)度在4cm以內(nèi)的外植體，在培養(yǎng)3-5天后開始變白，隨后在切口處出現(xiàn)微量愈傷組織，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，表面開始變干燥，愈傷組織的體積不斷增大。長(zhǎng)度在4cm以上的外植體，培養(yǎng)3天左右外植體開始膨大，變黃，變硬。七天左右在外植體表面產(chǎn)生乳白色、團(tuán)狀的愈傷組織并不斷增大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，顏色由開始的乳白色逐漸變?yōu)榈S色、顆粒狀的愈傷組織。

3.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)基優(yōu)化研究

經(jīng)過多次繼代的愈傷組織質(zhì)量下降，生長(zhǎng)緩慢，通過更換培養(yǎng)基后，愈傷組織的生長(zhǎng)情況有所改善。在不同的激素組合培養(yǎng)條件下，愈傷組織的生長(zhǎng)情況不同(表3)。在I號(hào)培養(yǎng)基中，降低2,4-D的濃度，添加了分裂素6-BA，出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，增長(zhǎng)緩慢。II號(hào)和III號(hào)培養(yǎng)基中的愈傷組織，均有不同程度的增加。2,4-D濃度為3.0mg/L并添加0.1mg/L的KT以及300mg/L的CH，愈傷組織的生長(zhǎng)速度提高，生長(zhǎng)情況較好、表面干燥，顏色為淡黃色，結(jié)構(gòu)疏松，適當(dāng)?shù)奶砑蛹に匾约暗鞍踪|(zhì)類物質(zhì)可以提高其生長(zhǎng)質(zhì)量。當(dāng)2,4-D含量為4mg/L，其生長(zhǎng)速度明顯提高，質(zhì)量較好，生長(zhǎng)量大(圖1-D)。IV號(hào)培養(yǎng)基中，當(dāng)2,4-D含量為5mg/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)速度未見明顯提高，且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明適當(dāng)?shù)募哟蠹に貪舛扔欣谟鷤M織的生長(zhǎng)，但過量的激素，反而會(huì)抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，引起褐化，不利于其分裂增殖。

表1 不同激素濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

A：只含2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織 B：添加KT誘導(dǎo)愈傷組織

C：幼穗長(zhǎng)為2-3cm誘導(dǎo)愈傷組織 D：轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基后愈傷組織

A:Only add the 2,4-D induced callus B:Add the KT induced callus

C：Young spikes length of callus induced by 2-3 cm D：the callus after change the culture medium

圖1 愈傷組織誘導(dǎo)

Fig.1 Callus Induction

表2 不同外植體長(zhǎng)度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3 不同激素種類及濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

4 討論

4.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響是不同的〔6〕，激素種類以及濃度大小對(duì)愈傷組織的出愈率的高低起到了關(guān)鍵作用。添加激動(dòng)素KT出愈率低于只添加激素2,4-D，KT表現(xiàn)出一定的抑制作用，2,4-D在愈傷組織的誘導(dǎo)中起主導(dǎo)作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在加拿大披堿草×肥披堿草雜種F1幼穗〔7〕、基因型和2,4-D濃度對(duì)小麥外植體離體培養(yǎng)〔8〕、羊草與灰色賴草雜種F1〔9〕以及披堿草×野大麥雜種F1幼穗培養(yǎng)再生體系的建立〔10〕、加拿大披堿草與2種國(guó)產(chǎn)披堿草雜種F1愈傷組織誘導(dǎo)〔11〕中所得出的結(jié)果相一致。外植體的長(zhǎng)度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有直接影響，本實(shí)驗(yàn)中2-3cm的幼穗外植體的出愈率高于其他長(zhǎng)度且生長(zhǎng)情況最優(yōu)。劉香利〔12〕、王秀紅〔13〕認(rèn)為長(zhǎng)度為0.5-1.0cm的幼穗適合作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，而張小紅〔14〕認(rèn)為1.0-1.5cm的幼穗作為外植體有利于誘導(dǎo)愈傷組織，云嵐認(rèn)為1-2cm的新生幼穗作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體最為理想〔15〕。這可能是因?yàn)椴煌蛐?、不同材料以及不同的生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)條件對(duì)激素的適應(yīng)、需求不同，所以導(dǎo)致其生長(zhǎng)情況也不相同。

4.2 激素對(duì)愈傷組織的影響

長(zhǎng)期繼代的愈傷組織生長(zhǎng)質(zhì)量下降，在增大生長(zhǎng)激素2,4-D的含量或者添加激動(dòng)素KT和水解酪蛋白后，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況有所恢復(fù)，通過更換培養(yǎng)基使愈傷組織的生長(zhǎng)情況得到改善。可能是由于長(zhǎng)期繼代后的愈傷組織內(nèi)細(xì)胞滲透壓發(fā)生改變，生長(zhǎng)激素水平下降，外源激素的增加對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用，通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基有利于愈傷組織胚性的保持〔16〕，但愈傷組織分化情況以及能否形成再生小植株還需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

5 結(jié)論：

(1)披堿草×野大麥雜種F1幼穗為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，3mg/L的2,4-D更有利于F1代愈傷組織的誘導(dǎo)，長(zhǎng)度為2-3cm的幼穗更適合作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織。

(2)MS+3mg/L2,4-D+0.5mg/LKT+300mg/LCH與MS+4mg/L2,4-D兩種培養(yǎng)基都可以使質(zhì)量下降的愈傷組織恢復(fù)活力，從愈傷組織外在形態(tài)來看前者更優(yōu)，但后者的生長(zhǎng)速度更快。

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Study on Callus Induction ofElymusdahuricus×HordeumbrevisubulatumF1

Zhao Qing1,Li Zaozhe1,*,Ma Qingzhi2,Li Peng3,Wang Wenxue1,Yun Lingge1

(1.College of grassland, resources and Environment ,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China;2.College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China; 3.College of desert control, Inner Mongolina Agricultural University,Hohhot 010019,China)

Young spikes ofElymusdahuricus×HordeumbrevisubulatumF1 were used as explants ,by sett the different hormone concentration ,to obtain suitable induction medium ,andthe young spikes with different length were used as the explants to determine the suitable explants length. After long-term culture of a callus, the cell growth is slow, through the replacement of the medium to restore growth.The experimental results show that with MS as the basic culture medium, add 3 mg/L 2, 4-D is better callus induction medium, induction rate of 28.3%;The length of 2-3cm young spike is more suitable for the length of explants, induction rate of 31.6%;MS + 2,4-D 3mg / L + KT 0.5mg / L + CH 300mg / L and MS + 2,4-D 4mg / L could improve the growth of long-term callus with poor growth quality.

Elymusdahuricus；Hordeumbrevisubulatum；Inter genera hybrids F1 ；Young spike ；Callus

Q943.1

A

2095—5952(2017)01—0018—06

2016-01-10

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31260575)

趙 青(1992-)，女，內(nèi)蒙古烏蘭察布市人，碩士研究生，主要從事植物資源保護(hù)與利用研究。E-mail：2260081244@qq.com

[*通訊作者]李造哲，男，教授，研究方向：植物資源保護(hù)與利用，E-mail：zaozheli@hotmail.com