牙源性干細(xì)胞來源的外泌體的研究進(jìn)展

宮晟凱，孫仔昂，王 曉，蔣文凱，王 瑋

外泌體(exosomes)是細(xì)胞主動向胞外分泌的大小均一的囊泡樣小體，囊泡中包含有膽固醇、蛋白質(zhì)(如各種細(xì)胞因子)及核酸(如DNA、mRNA、micro RNA)等分子[1]，具有細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、修復(fù)血管、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨組織修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等[2]生理功能。不同類型的細(xì)胞均可以釋放出外泌體[3]。而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的外泌體由于具有與MSCs相似的生物學(xué)特性及功能，且比MSCs更穩(wěn)定和易于保存受到了更多研究者的青睞[4-5]。

牙齒組織來源的MSCs均來自頭顱神經(jīng)嵴細(xì)胞，其獨(dú)特的組織特異性使其和其外泌體在神經(jīng)再生性疾病、牙髓牙本質(zhì)再生、牙周組織再生以及其他難治性疾病方面具有潛在的優(yōu)勢。牙齒組織來源的MSCs，即牙源性干細(xì)胞，主要包括牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、根尖牙乳頭干細(xì)胞(apical papilla stem cells，SCAP)、脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)、牙囊祖細(xì)胞(dental follicle progenitor cells，DFPCs)和牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)等[6]。這些干細(xì)胞主要來自于阻生智齒、正畸拔除的前磨牙、脫落乳牙等醫(yī)療丟棄組織，取材方便，無醫(yī)源性創(chuàng)傷；且均具有多向分化潛能、易分離培養(yǎng)、核型穩(wěn)定、增殖速率高等特點(diǎn)[5]。近年來，牙源性干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)以及組織再生等領(lǐng)域的應(yīng)用受到了大量的關(guān)注，但同時干細(xì)胞治療也存在一些問題如免疫排斥、干細(xì)胞遺傳物質(zhì)變異、體外擴(kuò)增保存不易、倫理等問題[7-8]。而外泌體既保留了MSCs的功能又避免細(xì)胞移植相關(guān)的限制和風(fēng)險，具有較廣的應(yīng)用價值。本文將對牙源性干細(xì)胞來源的外泌體在組織修復(fù)與再生方面的研究進(jìn)展進(jìn)行探討。

1 外泌體概述

外泌體是體內(nèi)活細(xì)胞分泌的一種膜性小囊泡，屬于胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的一種，可介導(dǎo)細(xì)胞相互間信息的傳遞[9]。外泌體在核內(nèi)體網(wǎng)中形成，當(dāng)多囊泡小體與胞膜融合時釋放出細(xì)胞，直徑在30～150 nm之間。研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源的外泌體具有不同的功能，其攜帶的信號分子包含脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、mRNAs、miRNA以及siRNA等，均與它們存在的微環(huán)境緊密相關(guān)[10]。外泌體通過配體/受體識別，大胞飲、內(nèi)吞、吞噬或直接與受體細(xì)胞胞膜融合等方式，進(jìn)入到受體細(xì)胞內(nèi)，并將攜帶的信號分子釋放到受體細(xì)胞中，從而觸發(fā)了受體細(xì)胞或器官中必要的分子反應(yīng)[11]。外泌體在許多疾病如癌癥、免疫系統(tǒng)疾病、感染和心臟大血管疾病等的生理和病理過程中充當(dāng)了不可忽視的角色[12-13]。

大量的證據(jù)表明外泌體參與了組織損傷修復(fù)和再生的過程，因此我們有可能利用這些天然粒子啟動復(fù)雜的生物學(xué)過程來促進(jìn)組織損傷修復(fù)與再生。與運(yùn)送細(xì)胞及細(xì)胞因子到達(dá)體內(nèi)組織的傳統(tǒng)方式相比，外泌體的優(yōu)勢在于[10]：首先，外泌體含有多種生理性相關(guān)因子及蛋白，可以同時激活目標(biāo)組織的多種通路，有利于提高治療效果，且由于其是天然來源，故具有較好的生物相容性和穩(wěn)定性；其次，外泌體不含遺傳程序，不會引起目標(biāo)細(xì)胞的基因修飾或改造；再次，外泌體比較穩(wěn)定，一般不會改變表型，治療結(jié)果具有可重復(fù)性和可預(yù)測性?；谝陨蟽?yōu)勢，外泌體在各個方面已嶄露頭角。外泌體可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及促血管化相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白分泌，不僅可以促進(jìn)新血管的形成，還可以加速它們在損傷位點(diǎn)的成熟[14]。同時外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)中也扮演著重要的角色，可以調(diào)節(jié)髓鞘形成、神經(jīng)元的生長和存活以及清理病理性蛋白等[15]。另外，研究表明MSCs來源的外泌體具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的極化和增殖[16]。而近年來人們發(fā)現(xiàn)外泌體在骨組織和牙組織再生方面也有較好的效果：研究發(fā)現(xiàn)人脂肪干細(xì)胞來源的外泌體錨定在PLGA支架上有效促進(jìn)了骨再生[17]。MSCs來源的外泌體與脫礦骨基質(zhì)支架復(fù)合有效促進(jìn)了血管化和骨再生[18]。人類誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞來源的外泌體與磷酸三鈣支架復(fù)合，可通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)成骨分化(在缺損模型中顯著促進(jìn)了血管化和骨再生)[19]。牙齒的發(fā)生是由表皮-間充質(zhì)間的交流以及各種生長因子共同調(diào)節(jié)完成的。外泌體在表皮-間充質(zhì)間的交流中扮演著重要角色。研究表明，表皮來源的外泌體促進(jìn)了MSCs的成牙分化和礦化，而MSCs來源的外泌體誘導(dǎo)表皮細(xì)胞產(chǎn)生了基底膜的復(fù)合物、釉原蛋白和成釉蛋白[20]。除了以上外泌體，牙齒組織如牙髓細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞以及牙齒來源的MSCs也能分泌外泌體，它們在組織損傷修復(fù)及再生過程中也發(fā)揮著重要作用。

2 牙源性干細(xì)胞來源的外泌體的生物學(xué)功能

牙源性干細(xì)胞通過內(nèi)分泌和/或旁分泌外泌體作用與不同類型的靶細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞間通信，廣泛參與細(xì)胞生物學(xué)活動的調(diào)控。

2.1 促血管再生作用

牙髓作為牙齒內(nèi)部唯一的軟組織，在其修復(fù)再生營養(yǎng)供給和疾病防御等方面起著重要的主導(dǎo)作用，血管生成是牙髓再生的關(guān)鍵。冼雪紅等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)牙髓細(xì)胞來源的外泌體促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、促血管形成相關(guān)因子的表達(dá)以及管腔的形成，在此過程中通過抑制p38 MAPK信號通路提高了管腔形成能力。柳鑫等[22]也發(fā)現(xiàn)不同濃度的人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)外泌體可提高內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，且其增殖促進(jìn)作用具有濃度依賴性，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔，這表明hDPSCs來源的外泌體可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。以上均表明牙源性干細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)牙髓血管的修復(fù)再生。

2.2 免疫調(diào)節(jié)作用

巨噬細(xì)胞在炎癥環(huán)境及組織再生調(diào)控中扮演著重要的角色，其兩種亞型分別起到促炎(M1)和抗炎(M2)的作用。而促進(jìn)巨噬細(xì)胞由促炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)化，對于實(shí)現(xiàn)調(diào)控組織再生顯得尤為重要。王巧云等[23]通過提取大鼠牙髓干細(xì)胞(rDPSCs)的外泌體，構(gòu)建皮膚缺損模型，檢測外泌體處理的皮膚創(chuàng)傷組織中巨噬細(xì)胞向不同亞型極化相關(guān)因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，可能促進(jìn)皮膚組織的修復(fù)再生。此外，蘇曉磊等[24]利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷，并分別用LPS和LPS聯(lián)合的DPSCs外泌體處理損傷肺泡巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示經(jīng)過高劑量DPSCs外泌體處理后的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β表達(dá)量明顯降低，表明外泌體對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制MAPK通路和激活NF-κB信號通路有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)SHED來源的外泌體具有抑制急性期炎癥反應(yīng)的作用，且可以保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激引起的凋亡，對如炎癥和氧化應(yīng)激等病理過程具有保護(hù)意義[25-26]。同時，王孟宏等[27]研究發(fā)現(xiàn)SHED來源的外泌體miR-100-5p能夠抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，緩解顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎，抑制髁突軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，而且SHED來源的外泌體可以通過移動小膠質(zhì)細(xì)胞極化來減少神經(jīng)炎癥，可改善大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)，減少皮質(zhì)損傷[28]。Zheng等[29]也發(fā)現(xiàn)PDLSCs來源的外泌體能通過Th17/Treg/miR-155-5p/SIRT1調(diào)節(jié)作用減輕炎癥微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)，能最大限度地控制多個下游損傷信號因子，可能為牙周炎治療尋找新的靶點(diǎn)。外泌體由于通過誘導(dǎo)細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子和促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的形成，因而被認(rèn)為是MSCs免疫調(diào)節(jié)作用的驅(qū)動力[30-31]。

2.3 促成牙分化作用

施萬(Schwann)細(xì)胞是成牙本質(zhì)細(xì)胞的主要來源。Li等[32]發(fā)現(xiàn)來自hDPSCs的外泌體，特別是來自LPS預(yù)處理的hDPSCs，可以促進(jìn)Schwann細(xì)胞的增殖，遷移和牙源性分化，它們可以遷移到損傷部位，并在牙齒發(fā)育和再生過程中分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。Hu等[33]通過研究DPSCs來源的外泌體的micro RNA表達(dá)譜，表明了在成牙分化誘導(dǎo)條件下分離的DPSCs來源的外泌體是誘導(dǎo)DPSCs分化的較好誘導(dǎo)因子。同時，Huang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，成牙分化誘導(dǎo)條件下牙髓細(xì)胞來源的外泌體更好地促進(jìn)了DPSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙分化，當(dāng)其與DPSCs復(fù)合后在體內(nèi)牙齒切片上促進(jìn)了牙髓樣組織再生。此外，蔣歡[35]也證明了SCAP來源的外泌體能夠被大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)吞，促進(jìn)其向成牙本質(zhì)分化和礦化結(jié)節(jié)的形成。Ivica等[36]研究發(fā)現(xiàn)牙髓細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移與增殖，且此外泌體可在纖維蛋白水凝膠中實(shí)現(xiàn)有效緩釋，為通過以干細(xì)胞歸巢的方式實(shí)現(xiàn)無髓牙齒牙髓再生提供新的技術(shù)支持。綜上所述，牙源性干細(xì)胞來源的外泌體在促進(jìn)細(xì)胞的遷移和成牙分化方面具有重要價值。

2.4 促進(jìn)骨損傷修復(fù)

口腔頜面部是人體的重要器官，牙槽骨因感染、外傷等原因造成的缺損是口腔頜面部常見的疾病之一[37]。外泌體在生理和病理?xiàng)l件下對骨重建有很好的作用，另外，PDLSCs與骨損傷修復(fù)也存在著密不可分的關(guān)系，在牙周組織再生中具有重要作用[38]。Chew等[39]發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體載膠原蛋白海綿有效地修復(fù)了缺損促進(jìn)了牙周組織的骨和牙周膜再生，推測MSCs來源的外泌體可通過增加細(xì)胞的運(yùn)動和增殖來促進(jìn)牙周組織再生。費(fèi)棟棟[40]也證實(shí)PDLSCs內(nèi)部不同細(xì)胞存在成骨異質(zhì)性，其外泌體在介導(dǎo)細(xì)胞成骨分化中具有重要作用。

2.5 治療神經(jīng)退行性病變

2.6 其他方面

口腔內(nèi)的傷口愈合速度會比其他部位的傷口愈合速度要快，牙齦組織的修復(fù)速度大約是皮膚損傷修復(fù)速度的兩倍，其中很重要的原因之一就是GMSCs，而外泌體作為旁分泌的主要成分,傳遞信息物質(zhì)、參與細(xì)胞間通訊，在GMSCs發(fā)揮修復(fù)作用的過程中具有重要的作用。時權(quán)等[42]研究發(fā)現(xiàn)，GMSCs來源的外泌體聯(lián)合殼聚糖/絲素蛋白凝膠海綿能有效促進(jìn)糖尿病皮膚創(chuàng)面的修復(fù)。同時，Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)GMSCs及其外泌體與小腸黏膜下-細(xì)胞外基質(zhì)(SIS-ECM)或其外泌體的聯(lián)合移植能夠促進(jìn)舌乳頭的恢復(fù)、味蕾再生和神經(jīng)支配，為舌癌患者術(shù)后的舌重建提供了可能。此外，牙源性干細(xì)胞來源的外泌體在抗腫瘤方面也發(fā)揮著重要作用。Stanko等[4]發(fā)現(xiàn)用氧化鐵納米粒子標(biāo)記DPSCs能夠維持體內(nèi)腫瘤的趨化性，且由自殺基因yCD：UPRT導(dǎo)入的DP-MSCs釋放的外泌體能夠很容易穿透整合人類的腫瘤細(xì)胞，在前藥5-氟胞嘧啶的存在下，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3 總 結(jié)

外泌體是由各種細(xì)胞分泌的一種直徑為30～150 nm、由脂質(zhì)雙分子層包裹的微囊泡結(jié)構(gòu)，富含多種生物分子、生物蛋白和核酸。外泌體可通過旁分泌或內(nèi)分泌方式作用于靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。其具有免疫調(diào)節(jié)作用，具備“促炎和抗炎”的雙重功能，是組織損傷修復(fù)不可或缺的因子[44]；且可以介導(dǎo)細(xì)胞間信息傳遞及特殊功能的分子轉(zhuǎn)移，對于促組織修復(fù)再生具有重要作用[45-46]，近年來的研究表明外泌體可能是一種很有前景的干細(xì)胞替代物，可能成為“無細(xì)胞治療”的有效手段[34,47-48]，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

牙源性干細(xì)胞由于取材方便，易于培養(yǎng)，且具有神經(jīng)源性等優(yōu)勢，使其外泌體在組織損傷修復(fù)與組織再生領(lǐng)域成為潛在的優(yōu)勢資源。文中引用的多項(xiàng)研究表明，牙源性干細(xì)胞來源的外泌體在血管再生、免疫調(diào)節(jié)、成牙分化、骨損傷修復(fù)、治療神經(jīng)退行性病變以及皮膚、味蕾再生、腫瘤治療等方面均已取得較好的療效(圖1)。根據(jù)現(xiàn)有的研究，來源于牙齒不同部位的干細(xì)胞分泌的外泌體都有其獨(dú)特的功能，比如DPSCs來源的外泌體功能更多體現(xiàn)在血管再生、免疫調(diào)節(jié)以及治療神經(jīng)退行性疾病方面，而PDLSCs來源的外泌體功能則更多體現(xiàn)在牙周膜和骨組織再生方面，這與其來源的干細(xì)胞的生物學(xué)特性是緊密相關(guān)的。當(dāng)然目前對于牙源性干細(xì)胞來源外泌體的研究仍處于早期階段，研究也僅限于對于每種外泌體單一功能的研究，尚沒有在各個領(lǐng)域進(jìn)行系列研究，因此還有許多未知的領(lǐng)域等待我們探索和發(fā)現(xiàn)。

圖1 牙源性干細(xì)胞來源的外泌體的生物學(xué)功能

目前，關(guān)于外泌體的研究仍存在一些問題：①外泌體的提取和鑒定尚無明確統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，提取方法并不能保證在足夠產(chǎn)量的前提下得到較高純度的外泌體，仍需改進(jìn)提取方法或開發(fā)新的方法；②外泌體在組織損傷修復(fù)以及再生過程中的潛在作用機(jī)制仍不清楚，其中哪些成分參與了此過程并發(fā)揮作用仍需研究；③在組織再生領(lǐng)域，外泌體到達(dá)目標(biāo)組織會出現(xiàn)大量的流失，無法達(dá)到有效作用濃度，如何實(shí)現(xiàn)外泌體的有效緩釋并研究其作用于目標(biāo)組織的有效濃度仍是亟待解決的問題。