生物催化合成中生物酶破碎過(guò)程溫度與濃度對(duì)酶活的影響

何連順，張仲良，米造吉，李斌水，馬 靜，馬 騰

（氨基酸衍生物生物催化技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（河北）精晶藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050000）

生物催化合成中生物酶破碎過(guò)程溫度與濃度對(duì)酶活的影響

何連順，張仲良，米造吉，李斌水，馬 靜，馬 騰

（氨基酸衍生物生物催化技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（河北）精晶藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050000）

生物體內(nèi)均含有生物酶，生物酶既是生命活動(dòng)的產(chǎn)物，又是生命必不可少的條件之一。具有生物催化功能的生物大分子（生物酶）在不同濃度和不同溫度條件下，對(duì)各種各樣的生化反應(yīng)有重要的影響。無(wú)論酶的化學(xué)組成主要是蛋白質(zhì)（蛋白類(lèi)酶P-酶）還是核糖核酸（核酸類(lèi)酶R-酶），作為催化劑與非酶催化相比，均有專(zhuān)一性強(qiáng)、催化效率高、條件溫和等特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)溫度和濃度的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)了對(duì)濕菌體氨基酸衍生物生物酶酶活的影響，當(dāng)溫度變化30℃或酶濃度增加3倍時(shí)，在相同的超聲破碎條件下，酶活均降低90%以上，酶活衰減直接影響了氨基酸及其衍生物的催化功能。

生物酶；酶活；氨基酸；衍生物

生物酶催化合成技術(shù)作為生物化學(xué)的分支學(xué)科，在氨基酸及其衍生物工業(yè)應(yīng)用上的主要作用是作為催化劑來(lái)起到轉(zhuǎn)化、分解、加成、氧化還原等作用。生物酶分離純化是將酶從細(xì)胞或其他含有酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開(kāi)，以獲得符合研究或使用要求的酶的過(guò)程。主要內(nèi)容包括菌體破碎、酶的提取、離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、結(jié)晶等[1]。

酶的種類(lèi)繁多，已知的約有4 000多種[2]，它們存在不同生物體內(nèi)的不同部位。對(duì)于不同的生物體，或同一生物體的不同組織細(xì)胞，由于結(jié)構(gòu)不同、所處環(huán)境不同，破碎的方法和條件也有所不同，為了得到生物酶，必須根據(jù)酶的特性進(jìn)行不同手段的處理，常規(guī)的破碎方法有機(jī)械破碎、化學(xué)破碎、酶促破碎等方式。機(jī)械破碎主要依托剪切力或溫度、壓力等物理因素的作用，使細(xì)胞破碎，包括高壓均漿法、研磨法、超聲波破碎等。化學(xué)破碎主要通過(guò)化學(xué)試劑改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物質(zhì)釋放出來(lái)，常用的試劑有酸堿、表面活性劑、丙酮、丁醇、吐溫、特里頓等。酶促破碎主要是通過(guò)酶制劑或自身酶系的作用，是細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。常用的溶菌酶、糖苷酶、蛋白水解酶、酯酶、纖維素酶、果膠酶等。

酶的活性對(duì)于工業(yè)過(guò)程生產(chǎn)率至關(guān)重要，在破碎的同時(shí)要保障酶活，通常單位酶活是最重要的參考指標(biāo)，即1g濕菌體酶所在對(duì)應(yīng)溫度條件下，每分鐘生成1μmol產(chǎn)物所需酶量，單位為IU/g。生物催化相比傳統(tǒng)化學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)人們?nèi)耸乱丫?，但直到近年?lái)才突飛猛進(jìn)[3]。本課題將重點(diǎn)檢測(cè)在不同溫度和濕菌體濃度下采用超聲波破碎，檢測(cè)溫度對(duì)酶活的影響。

1 儀器與試藥

JY92-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波立誠(chéng)儀器有限公司）；安捷倫1260高效液相（日本Agilent technologies 公司）、生物濕菌體（精晶藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處理方法

將生物濕菌體用PBS緩沖液溶解，考慮到實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中環(huán)境的控制手段和實(shí)際可操作性，分別按照以下編號(hào)條件下進(jìn)行超聲破破碎，生物濕菌體分別在不同溫度、不同濃度條件下先穩(wěn)定15min，之后進(jìn)行超聲破碎，破碎功率800W：破碎3s，間隔2s，如此連續(xù)操作15min，之后分別將A-1～A-4所得酶液保存在（10±1）℃條件下放置1h檢測(cè)酶活，將B-1～B-4所得酶液保存在（30±1）℃條件下放置1h檢測(cè)酶活。

表1 A/B兩組實(shí)驗(yàn)條件

2.2 酶活檢測(cè)方法

用同樣底物濃度的原料體系50mL，濃度5%，分別加入A-1～B-4濕菌體量的酶液5mL，催化轉(zhuǎn)化10min，檢測(cè)產(chǎn)物生成量，根據(jù)公式計(jì)算可得酶活。

2.2.1 色譜條件

色譜柱：氨基鍵合硅膠柱，4.6mm×250mm，5μm流速：1.0mL/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm

柱溫：30℃進(jìn)樣體積：20μl

流動(dòng)相：稱13.6g磷酸二氫鉀、1.05g庚烷磺酸鈉至1 000ml量瓶中，加1 000ml純化水溶解后加52ml乙腈，混勻，過(guò)濾，超聲脫氣。

2.2.2 待測(cè)樣品制備

精密量取上述待測(cè)酶液1ml至10ml量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過(guò)濾進(jìn)樣；

精密量取空白溶液0.5ml至50ml量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過(guò)濾進(jìn)樣，記錄色譜圖至15min。

2.2.3 酶活計(jì)算

式中：

W1：對(duì)照品的質(zhì)量，（mg）；

S：對(duì)照品的含量；

A1：生成產(chǎn)物的面積；

A0：空白中產(chǎn)物的面積；

n1：酶液稀釋倍數(shù)；

50：反應(yīng)體系；

W2：濕菌體的質(zhì)量，（mg）；

AST：產(chǎn)物對(duì)照品的面積；

n2：產(chǎn)物對(duì)照品的稀釋倍數(shù)；

M：產(chǎn)物的分子量；

10：反應(yīng)時(shí)間，（min）。

2.3 結(jié)果及分析

根據(jù)以上條件，跟蹤檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)計(jì)算可得表2：

為了更好的體現(xiàn)在不同濃度和不同溫度下，酶活變化情況，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，做成曲線圖，見(jiàn)圖1和圖2：

表2 AB兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 A組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 B組實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由以上可以看出，在實(shí)際應(yīng)用操作環(huán)境下兩組對(duì)照試驗(yàn)的趨勢(shì)是一致的，當(dāng)酶濃度在10%時(shí)，在溫度10℃條件下，進(jìn)行超聲波破碎，酶活濃度最高，當(dāng)溫度升高到40℃時(shí)，生物濕菌體酶酶活降低90%以上，提高酶濃度到30%，現(xiàn)象一致，即表明，濕菌體酶活衰減濕菌體比較合適的濃度為A-1條件。

3 討論

通過(guò)A/B兩組實(shí)驗(yàn)不難看出，濕菌體的破碎受濃度和溫度的影響，在較低溫度下，能很好的保持酶的活性，隨著溫度的升高和酶濃度的升高，破碎均造成了酶活的降低，可能原因是生物酶自身發(fā)生了斷裂或三維立體結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這種改變?cè)诟邼舛仁潜憩F(xiàn)比較明顯，也有可能是溫度的升高造成了酶蛋白或者酶核酸發(fā)生了變性，最終體現(xiàn)出酶活的降低。

[1] 郭勇，鄭惠平.酶學(xué)[M].廣州.華南理工大學(xué)出版社，2000.

[2] Tao Junhua .Biocatalysis for the PHarmaceutical industry.John wiley &sons（Asia）Pte Ltd.2009.

Effects of Temperature and Concentration on Enzyme Activity in Biological Process of Biocatalytic Synthesis in Biocatalytic Synthesis

He Lian-shun，Zhang Zhong-liang，Mi Zao-ji，Li Bin-shui，Ma Jing，Ma Teng

Biological organisms contain both biological enzymes，biological enzymes is the product of life activities，but also one of the essential conditions of life.The biological macromolecules（biological enzymes）with biocatalytic function have important effects on various biochemical reactions under different concentration and temperature conditions.Whether the chemical composition of the enzyme is mainly protein（proteinase P-enzyme）Or ribonucleic acid（nucleic acid enzyme R-enzyme），as a catalyst and non-enzyme catalysis compared to have specificity，high catalytic efficiency，mild conditions and so on.In this experiment，we studied the effects of temperature and concentration on the activity of the enzyme of the amino acid derivatives of the wet bacteria.When the temperature was changed by 30 ℃ or the enzyme concentration was increased by 3 times，under the same ultrasonic crushing conditions，The average activity decreased by more than 90%，and the decay of enzyme activity directly affected the catalytic function of amino acids and their derivatives.

biological enzyme；enzyme activity；amino acid；derivative

Q814

B

1003-6490（2017）01-0130-02

2017-01-18

何連順（1987—），男，河北石家莊人，工程師，主要從事于生物酶催化合成技術(shù)、高分子材料合成及應(yīng)用技術(shù)、結(jié)晶技術(shù)等工作。