牡丹多糖的提取及其對自由基和亞硝酸根離子的清除作用

黃海霞，孫麗蓉，司曉磊，郁飛燕

(河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471023)

牡丹多糖的提取及其對自由基和亞硝酸根離子的清除作用

黃海霞，孫麗蓉，司曉磊，郁飛燕

(河南科技大學 農(nóng)學院，河南 洛陽 471023)

牡丹； 多糖； Sevage法； 自由基； 亞硝酸根

1 材料和方法

1.1 材料來源與處理

牡丹根于2012年11月采自洛陽國際牡丹園。將牡丹根洗凈后抽去其髓部，置于烘箱內(nèi)30 ℃烘干，用粉碎機將其粉碎，過篩孔內(nèi)徑為420 μm的金屬篩。再將牡丹根粉末于35 ℃條件下恒溫干燥12 h，密封保存在棕色試劑瓶內(nèi)備用。

1.2 方法

1.2.1 牡丹多糖的制備工藝

1.2.1.1 牡丹多糖提取工藝流程 牡丹根粉末→乙醚脫脂→10.00 g脫脂后粉末，加入200 mL蒸餾水，80 ℃水浴3 h后過濾→10 mL濾液中加入Sevage試劑(氯仿和正丁醇按一定比例混合)去蛋白→恒溫振蕩器上高速振蕩25 min后置入分液漏斗內(nèi)，靜置30～45 min→取上清液進行真空干燥至1/3體積→加等體積95%乙醇，靜置過夜→6 000 r/min離心20 min，棄上清→洗滌晶體，真空干燥。

1.2.1.2 Sevage法脫蛋白優(yōu)化 由于牡丹根中含有粗脂肪和蛋白質(zhì)，要得到純度較高的多糖，脫脂、脫蛋白的操作就顯得十分重要。以蛋白質(zhì)清除率為指標，分別考察Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、提取液與Sevage試劑體積比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)對脫蛋白效果的影響。

1.2.2 牡丹根中粗脂肪、蛋白質(zhì)及多糖含量的測定 粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法的殘重法[8]。利用考馬斯亮藍G-250法[8]測定蛋白質(zhì)含量，以小牛血清白蛋白為標準物質(zhì)，蛋白質(zhì)標準曲線方程為y=145.67A595(R2=0.993 6)，根據(jù)牡丹根多糖溶液去蛋白前后的蛋白質(zhì)含量計算蛋白質(zhì)清除率，以確定最佳的脫蛋白方法。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[9]，以葡萄糖作標準物，多糖標準曲線方程為y=155.32A490(R2=0.997 3)。

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的測定 精確移取不同質(zhì)量濃度牡丹多糖溶液2 mL于試管中，再加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，搖勻，室溫放置30 min，測定波長517 nm處的吸收值，即為A樣品(將2 mL乙醇與2 mL樣品溶液混勻后作為空白調(diào)零)。2 mL乙醇和2 mL DPPH溶液混勻后測定A517，即為A對照。

清除率=(A對照-A樣品)/A對照×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2007 統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹根中主要物質(zhì)組成

由圖1可知，粗脂肪、蛋白質(zhì)和多糖3種物質(zhì)總量高達47%，其中多糖在牡丹根中含量相對較高，約占29%，粗脂肪與蛋白質(zhì)所占比例相對低些。

2.2 Sevage法脫蛋白工藝的最佳方案

由表1可知，當Sevage試劑的加入量一定時，隨著Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比的增加，蛋白質(zhì)清除率先增大后減小，呈“幾”字型變化，當二者體積比為3∶1時，蛋白質(zhì)清除率最大，達到11.8%。

在Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為3∶1的條件下，測定多糖提取液與Sevage試劑體積比為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1時的蛋白質(zhì)清除率，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)清除率隨體積比增加而增加，當體積比從3∶1增加到4∶1時，蛋白質(zhì)清除率增加1.2倍，從4∶1增加至5∶1時，蛋白質(zhì)清除率僅增加了6.1%。綜上所述，運用Sevage法去除多糖提取液中蛋白質(zhì)的最佳方案為：氯仿與正丁醇體積比為3∶1，提取液與Sevage試劑體積比為4∶1。

圖1 牡丹根中各組分含量分布表1 不同處理的蛋白質(zhì)清除率

項目V氯仿∶V正丁醇(Sevage試劑)2∶13∶14∶15∶1V提取液∶VSevage試劑2∶13∶14∶15∶1蛋白質(zhì)清除率/%4.111.86.65.93.05.211.412.1

2.3.1 DPPH自由基清除率 由圖2所示，不同質(zhì)量濃度的牡丹多糖溶液對DPPH自由基有不同程度的清除效果。隨著多糖溶液濃度的增加，DPPH自由基的清除率也增加。多糖質(zhì)量濃度在0～1.0 g/L時，DPPH自由基的清除率變化明顯，隨濃度增加清除率迅速增大。當多糖質(zhì)量濃度高于2.5 g/L時，清除率變化基本已達到穩(wěn)定狀態(tài)；高質(zhì)量濃度(10.0 g/L)下，DPPH自由基的清除率可達68.97%。因此，當多糖溶液質(zhì)量濃度為2.5 g/L時對DPPH自由基的清除效果較好。

圖2 不同質(zhì)量濃度多糖溶液對DPPH自由基清除率的影響

圖3 不同質(zhì)量濃度多糖溶液對·清除率的影響

圖4 不同質(zhì)量濃度多糖溶液對清除率的影響

3 結(jié)論與討論

本研究通過脫脂、Sevage試劑去蛋白、多糖的濃縮、沉淀及洗滌等一系列操作，成功制備出牡丹多糖晶體，確定去蛋白的最佳方案為：Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比為3∶1，多糖提取液與Sevage試劑添加量體積比為4∶1。這一結(jié)論與扈瑞平等[13]的結(jié)果相吻合，但蛋白質(zhì)清除率與其結(jié)果相比偏低。同時本試驗結(jié)果表明，牡丹根中物質(zhì)組成大致為粗脂肪含量為6%、蛋白質(zhì)含量為12%，多糖含量較為豐富，約為29%。

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Extraction of Polysaccharide from Peony and Its Scavenging Effects on Free Radicals and Nitrite Ion

HUANG Haixia,SUN Lirong,SI Xiaolei,YU Feiyan

(Agricultural College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)

peony; polysaccharides; Sevage method; free radicals; nitrite

2016-10-12

黃海霞(1977-)，女，陜西清澗人，副教授，碩士，主要從事天然植物抗氧化研究。 E-mail:huanghaixia_228@163.com

S682.1

A

1004-3268(2017)04-0134-04