PCR檢測(cè)兔支氣管敗血波氏桿菌方法的建立及應(yīng)用

馬超鋒，陳 銘，徐永杰

(1.信陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽464000； 2.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

PCR檢測(cè)兔支氣管敗血波氏桿菌方法的建立及應(yīng)用

馬超鋒1，陳 銘1，徐永杰2*

(1.信陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽464000； 2.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000)

為建立準(zhǔn)確、快速檢測(cè)兔支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica)的PCR方法，根據(jù)GenBank中波氏桿菌ptxA基因設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用建立的PCR方法擴(kuò)增兔波氏桿菌，可擴(kuò)增出870 bp的目的片段。該方法特異性好，僅對(duì)波氏桿菌有特異性的擴(kuò)增，而對(duì)大腸埃希菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌等病原菌的擴(kuò)增結(jié)果呈陰性；敏感性較高，最低檢測(cè)限可達(dá)6.8×10-7μg/mL；用建立的PCR方法檢測(cè)臨床疑似感染支氣管敗血波氏桿菌病兔的臟器及鼻拭子樣品,可擴(kuò)增出目的條帶，且與細(xì)菌分離的結(jié)果一致?？梢?，建立的檢測(cè)方法敏感、特異，可用于臨床上兔波氏桿菌病的快速診斷及鑒定。

兔波氏桿菌； PCR；ptxA基因

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)是一種革蘭氏陰性小桿菌,寄生在動(dòng)物呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，能引起多種哺乳動(dòng)物發(fā)生呼吸道的急性或慢性炎癥。該菌能感染豬、犬、貓、兔、鼠、猴以及刺猬、狐、粟鼠等野生動(dòng)物。兔波氏桿菌病是由支氣管敗血波氏桿菌引起的兔的一種呼吸道疾病。研究表明，兔群發(fā)生的以鼻腔分泌物增多、打噴嚏、食欲不振和發(fā)育不良為特征的卡他性炎癥中,大部分是由支氣管敗血波氏桿菌引起的[1]。本病通過呼吸道傳播，帶菌兔和病兔鼻腔分泌物中的病菌隨咳嗽、噴嚏飛沫污染飼料、飲水、籠舍和空氣傳染給健康兔。病菌常存在于兔上呼吸道黏膜上，不良因素刺激、家兔抵抗力下降、病菌侵入機(jī)體引起發(fā)病。該病病程長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)生，難治愈，易造成患兔生長(zhǎng)障礙,飼料利用率低,給養(yǎng)兔業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

河南省是養(yǎng)兔大省，其中信陽市有較大的存欄量?，F(xiàn)階段，疾病問題仍然是影響信陽市養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展的重要因素，特別是流行性腹脹、傳染性鼻炎以及球蟲病的發(fā)病率和死亡率仍然較高，給養(yǎng)殖戶帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。波氏桿菌病是兔群常發(fā)的細(xì)菌性疾病，特別是季節(jié)交替時(shí)，波氏桿菌可引起兔群發(fā)生以鼻炎為主要癥狀的呼吸道疾病，若與巴氏桿菌混合感染,危害更重[3]。Spanoghe[4]調(diào)查32個(gè)兔場(chǎng),波氏桿菌的感染率為20%～47%。國內(nèi)學(xué)者檢測(cè)了不同的鼻炎和胸膜肺炎患兔,波氏桿菌的檢出率分別為35.8%[5]、46.0%[6]。由此可見,波氏桿菌仍然是兔呼吸道病的重要病原。目前，國外關(guān)于支氣管敗血波氏桿菌分子生物學(xué)方面的研究報(bào)道較多[5-12]，而有關(guān)支氣管敗血波氏桿菌檢測(cè)方法的報(bào)道卻很少[11]，國內(nèi)關(guān)于兔波氏桿菌的檢測(cè)，大都是通過傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)方法檢測(cè)該菌[13-19]。這些方法不但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且檢出率不高。因此，臨床上常延誤該病的及時(shí)確診和有效治療。此外，有關(guān)波氏桿菌分子生物學(xué)的檢測(cè)僅局限于根據(jù)鞭毛基因設(shè)計(jì)的PCR方法，故有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。鑒于此，針對(duì)支氣管敗血波氏桿菌ptxA基因(百日咳毒素S1亞基啟動(dòng)子基因)[20]設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以建立支氣管敗血波氏桿菌特異性檢測(cè)方法，旨在為兔波氏桿菌病的診斷治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、臨床樣本 家兔支氣管敗血波氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌等試驗(yàn)菌株由信陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；203份待檢樣品采自信陽市疑似感染支氣管敗血波氏桿菌的兔群鼻拭子。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、10×緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖、DNA提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；馬丁肉湯、麥康凱培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基等購自南京卓越生物公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR儀(德國Biometre公司),電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(以色列DNA公司)，5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)，SPX-150B智能型生化培養(yǎng)箱(上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中波氏桿菌ptxA基因的序列，應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，預(yù)期PCR擴(kuò)增核酸片段大小870 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。上游引物：5′-GGCACCATCAAAACGCAGAGGGG-3′；下游引物：5′-ATTACCGAGTTGGGCGGGGCTG-3′。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 無菌條件下，取波氏桿菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株畫線接種于LB瓊脂平板，取多殺性巴氏桿菌接種于鮮血瓊脂平板,于37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察。挑取濕潤、光滑小菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 模板DNA的制備 無菌條件下，將波氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每個(gè)平板用6 mL生理鹽水洗脫菌落，取2 mL菌液制備模板DNA。分別將大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于LB平板或鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，每個(gè)平板用6 mL生理鹽水洗脫菌落，取2 mL菌液制備模板DNA，置于4 ℃?zhèn)溆没?20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.3 PCR方法建立

1.2.3.1 PCR反應(yīng) 總反應(yīng)體系25 μL：TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，10×緩沖液(Mg2+)2.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL,ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，57 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 采用25 μL反應(yīng)體系，以波氏桿菌DNA為模板，設(shè)定不同的退火溫度(54.0、54.4、55.2、56.4、57.8、59.0、59.7、60.0 ℃)和引物濃度梯度(0.781 25、1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mmol/L)，分別進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，以出現(xiàn)目的條帶清晰度高且無明顯雜帶為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳反應(yīng)條件。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，PCR產(chǎn)物按5︰1混合6×Loading Buffer進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖凝膠、電壓100 V，室溫電泳30 min。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍攝。

1.2.3.4 PCR特異性試驗(yàn) 按照1.2.2的步驟分別提取兔支氣管敗血波氏桿菌、大腸埃希菌、無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌的模板DNA，在相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物的特異性，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(以三蒸水為模板)。

1.2.3.5 PCR 敏感性試驗(yàn) 支氣管敗血波氏桿菌模板DNA用ddH2O連續(xù)10倍梯度稀釋，按照上述已優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶的最低DNA模板濃度為最低檢出量。

1.2.4 臨床樣品波氏桿菌的PCR檢測(cè) 為鑒定建立PCR方法的適用性，對(duì)1份人工感染樣品及采集的203份鼻拭子進(jìn)行檢測(cè)。人工感染樣品的制備：復(fù)蘇凍干保存的支氣管敗血波氏桿菌于馬丁肉湯，37 ℃、190 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。參照范志宇[21]建立的支氣管波氏桿菌人工感染模型，調(diào)整菌液濃度為2×108cfu/mL，選擇2只未免疫健康家兔(體質(zhì)量為0.5 kg，由信陽市某兔場(chǎng)提供)，1只家兔靜脈注射2 mL菌液，1只家兔靜脈注射2 mL生理鹽水作為對(duì)照。接種后，2只供試家兔隔離飼養(yǎng)，以確保人工感染組和對(duì)照組之間不會(huì)相互感染。待人工感染組兔出現(xiàn)波氏桿菌病的疑似臨床癥狀時(shí)，分別無菌解剖取出家兔的心、肝、脾、肺、腎等組織，提取DNA，采用建立的家兔波氏桿菌PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)的條件優(yōu)化結(jié)果

設(shè)定不同的退火溫度和不同的引物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，各退火溫度下目的條帶均很亮，引物濃度為3.125 mmol/L(第6組)時(shí)，目的條帶最亮，且雜帶較少(圖1、圖2)。故選擇60.0 ℃為最適退火溫度，3.125 mmol/L為最適引物濃度。

M.DL1500 DNA Marker； 1—8.分別為退火溫度60.0、59.7、 59.0、57.8、56.4、55.2、54.4、54.0 ℃圖1 PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

將波氏桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、多殺性巴氏桿菌基因組DNA作為PCR反應(yīng)模板，按照上述已優(yōu)化反應(yīng)體系和條件擴(kuò)增，結(jié)果顯示，僅以波氏桿菌菌株為模板的反應(yīng)體系擴(kuò)增出約870 bp的條帶，以其他菌株為模板的反應(yīng)體系及空白對(duì)照組均未見條帶(圖3)。表明該P(yáng)CR反應(yīng)體系及條件具有很高的特異性。

M.DL2000 DNA Marker； 1—8.分別為引物濃度100、50、25、12.5、 6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mmol/L圖2 PCR反應(yīng)引物濃度優(yōu)化結(jié)果

M.DL2000 DNA Marker； 1—6.分別為陰性對(duì)照、支氣管敗血波氏 桿菌、巴氏桿菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌圖3 PCR反應(yīng)特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

初始模板質(zhì)量濃度經(jīng)核酸蛋白儀檢測(cè)為6.8×10-1μg/mL。將支氣管敗血波氏桿菌模板DNA依次進(jìn)行10倍倍比稀釋。取不同稀釋度的模板DNA 1 μL 進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，模板質(zhì)量濃度低至6.8×10-7μg/mL時(shí)(第7組)，仍可擴(kuò)增出約870 bp的目的片段(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker； 1—10.DNA模板質(zhì)量濃度分別為 6.8×10-1—6.8×10-10 μg/mL圖4 PCR方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR檢測(cè)方法的臨床檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室人工感染家兔后所收集的臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，可見約870 bp左右條帶，對(duì)照組未見條帶(圖5)。用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)鑒定，結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。對(duì)203份鼻拭子進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出陽性樣品18份，陽性率為8.9%。

M.DL2000 DNA Marker； 1—3分別為陰性對(duì)照、陽性樣品、陰性樣品圖5 臨床檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

根據(jù)GenBank中支氣管敗血波氏桿菌的ptxA基因的序列，應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立了兔支氣管敗血波氏桿菌基因片段的檢測(cè)方法。依照有關(guān)退火溫度的計(jì)算和預(yù)測(cè)，本研究對(duì)退火溫度和引物濃度分別進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。對(duì)兔大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌以及空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果表明，本研究所建立的PCR檢測(cè)方法特異性很高；敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品的量?jī)H有6.8×10-7μg/mL時(shí)，仍能夠擴(kuò)增出特異性條帶，說明該P(yáng)CR方法檢測(cè)支氣管敗血波氏桿菌具有很高的敏感性。

本研究所建立和優(yōu)化的PCR試驗(yàn)方法不需要進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，只需要從病料中提取DNA，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，具有檢測(cè)速度快、靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在24 h內(nèi)即可檢測(cè)出結(jié)果，縮短了病原的檢測(cè)時(shí)間(傳統(tǒng)檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，時(shí)間為3～5 d)。用本研究所優(yōu)化的PCR方法對(duì)臨床的人工感染病料和所采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，均能夠檢出目的條帶，可用于臨床上兔波氏桿菌病的快速診斷及鑒定。

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Establishment and Application of PCR Assay for the Diagnosis ofBordetellabronchisepticaInfection in Rabbits

MA Chaofeng1,CHEN Ming1,XU Yongjie2*

(1.Xinyang Animal Disease Control and Prevention Center,Xinyang 464000,China；2.College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000,China)

To establish accurate and rapid PCR method for detectingBordetellabronchiseptica(Bb) in rabbits,a pair of specific primers was designed based onptxAgene of Bb in GenBank.This established PCR method can be used to amplify Bb in rabbits,and the target fragment was 870 bp in length.This method was specific in amplification of Bb,while being negative in amplifying such pathogens asEscherichiacoli,Streptococcusagalactiae,Staphylococcusaureus,Pasteurellamultocida,etc.Meanwhile,the method was highly sensitive,with minimum detection limit being 6.8×10-7μg/mL.The PCR method was applied in detecting samples of suspected disease rabbits’ organs and noses.The amplified target fragment was identical with the result of the bacterial isolation method.Therefore,this detection method is both specific and sensitive and can be applied in rapid clinical diagnosis and identification of Bb inrabbits.

Bordetellabronchiseptica; PCR;ptxAgene

2016-11-20

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2015GGJS-139)

馬超鋒(1981-)，男，河南禹州人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物疫病防控。E-mail：machaofeng5@163.com

*通訊作者：徐永杰(1980-)，男，河南商城人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究。E-mail：13523899902@126.com

S855.1

A

1004-3268(2017)04-0124-04