3個不同派別楊樹資源遺傳多樣性的SSR分析

韓志校，張 軍，左力輝，任亞超

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 國有資產(chǎn)管理處，河北 保定 071000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071001)

3個不同派別楊樹資源遺傳多樣性的SSR分析

韓志校1，張 軍2*，左力輝2，任亞超2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 國有資產(chǎn)管理處，河北 保定 071000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071001)

利用楊樹28對SSR基本核心引物篩選出符合要求的13對引物，并采用這些引物對來自白楊派、黑楊派和青楊派的32個楊樹無性系進行PCR擴增，同時對這些樣品進行親緣關系和遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，13對引物共擴增條帶58條，其中多態(tài)性條帶58條，占擴增總帶數(shù)的100.00%。對32個楊樹樣品的遺傳距離進行分析，得到其遺傳距離為0.056～0.741，表明各樣品之間具有較豐富的遺傳多樣性。通過聚類分析可將供試樣品分為三大類，即白楊派、黑楊派和青楊派，其聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學上的結(jié)果一致，說明SSR分子標記技術在楊樹品種鑒定中具有一定的可靠性。

楊樹； SSR； 遺傳多樣性

楊樹屬于楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)，為落葉喬木[1]。楊樹在我國分布廣泛，是我國重要的綠化樹種和能源樹種[2-5]。楊屬植物種類繁雜多樣，無性繁殖比較容易，雜交品種較多，分類較困難。隨著生物技術的快速發(fā)展，分子標記技術是現(xiàn)階段林木育種上品種鑒定、性狀區(qū)分等常用到的技術手段[6]。SSR(simple sequence repeats)分子標記又稱為微衛(wèi)星分子標記，廣泛分布在真核生物的基因組中,是一類由2～4個核苷酸組成的多次串聯(lián)重復的DNA序列[7]。楊彥伶等[8]用楊樹基因組SSR引物對6個蘇柳品種進行了PCR擴增，結(jié)果表明，楊樹SSR標記完全適合于柳樹；梁海永等[9]用楊屬的10個品種作為試驗材料，采用SSR分析了各樣品之間的親緣關系；賈會霞等[10]用SSR標記構建了楊樹品種的指紋圖譜，證實用SSR標記可以有效監(jiān)測親本與子代之間的系譜關系。但SSR標記在不同派別楊樹的遺傳多樣性研究方面尚未見報道，鑒于此，擬利用13對SSR高多態(tài)性引物對來自3個派別的32個楊樹無性系進行遺傳多樣性分析，旨在為楊樹無性系的鑒定和親緣關系分析提供分子生物學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2012年6月份從中國林業(yè)科學研究院苗圃(北京)、河北農(nóng)業(yè)大學校園(保定)、河北威縣林業(yè)局苗圃場(邢臺威縣)和東北地區(qū)(沈陽)收集楊樹無性系32個，其中白楊無性系13個、黑楊無性系14個、青楊無性系5個。供試材料見表1。白楊和黑楊無性系均采取頂端嫩葉，將其用速封袋包裝，放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；青楊無性系用硅膠進行干燥處理。全部試驗在河北農(nóng)業(yè)大學林木遺傳育種實驗室完成。

表1 供試材料概況

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與引物選擇 采用改進后的CTAB法[11]提取楊樹基因組DNA。所提取的DNA使用Nanodrop2000檢測質(zhì)量濃度并稀釋到20 ng/μL，用于SSR標記。

SSR引物序列來自國際楊樹基因組委員會官方網(wǎng)站(http://web.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resources.htm)，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。從28對引物中選取13對多態(tài)性好、分辨率高、穩(wěn)定性強、特異性高的引物用于PCR擴增，引物序列和名稱見表2。

1.2.2 PCR反應體系與擴增程序 PCR反應體系為10 μL，各試劑含量為：2×TaqMaster Mix 5 μL，RNase-Free Water 3 μL，Template DNA 1 μL，F(xiàn)orward primer、Reverse primer各為0.5 μL。PCR擴增程序為：PCR擴增95 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，41～55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃ 20 min。

表2 引物序列與名稱

1.2.3 凝膠電泳與顯色 用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳40～50 min，然后凝膠用1%的AgNO3染色8～10 min，用去離子水漂洗2～3次，再用顯色液浸泡2～3 min，直至條帶顯色清晰，并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用二元性狀(binary character)編碼，選擇擴增條帶清晰且有多態(tài)性的SSR標記進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，假定膠上遷移率相同的條帶均來自同一位點上的同一等位基因。對每個樣品的擴增電泳譜帶進行統(tǒng)計，有帶記為1，無帶或模糊的記為0，形成0/1數(shù)據(jù)矩陣輸入計算機的 Excel 中。利用 POPGENE32和DPSv17.0軟件計算遺傳多樣性參數(shù)與遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹SSR引物多態(tài)性分析

利用選出的13對SSR引物對32份楊樹無性系進行擴增，共擴增出條帶58條，其中多態(tài)性條帶58條，占100.00%，每對引物擴增的位點數(shù)為2～7個不等，平均每對引物擴增4.5個位點(表3)。

從擴增結(jié)果來看，SSR引物得到的擴增產(chǎn)物片

斷大小主要分布在120～305 bp。每個引物的多態(tài)性都很高，都達到100.00%，這13對引物對所供試的32份楊樹材料的區(qū)分率達到了100.00%。從圖1可以看出，不同引物在相同材料中產(chǎn)生的譜帶信息不同，同一引物在不同的材料中產(chǎn)生的譜帶信息也不盡相同，這說明供試的楊樹無性系在DNA水平上具有一定的差異。

表3 13對SSR引物所產(chǎn)生的譜帶信息

M表示20 bp DNA Ladder Marker; 1—24為供試材料編號圖1 引物ORPM206(A)和ORPM344(B)對部分樣品的擴增譜帶

2.2 楊屬3個派別間的遺傳多樣性分析

由表4可知，楊屬3個派別之間的多態(tài)位點百分率具有一定的差異，介于55.17%～75.86%，其中最高的為白楊派，最低的是青楊派，3個派別間的高低關系表現(xiàn)為白楊派>黑楊派>青楊派；而Nei′s基因多樣性(h)、Shannon′s指數(shù)(I)和有效等位基因數(shù)(Ne)的高低關系表現(xiàn)為黑楊派>白楊派>青楊派。

表4 楊屬3個派別間的遺傳多樣性指數(shù)

2.3 楊屬3個派別間的遺傳一致度與遺傳距離

比較來自楊屬3個派別間的遺傳一致度與遺傳距離(表5)發(fā)現(xiàn)，不同派別間楊樹無性系的遺傳距離介于0.096～0.190，遺傳一致度介于0.827～0.909，尤其是黑楊派和青楊派之間的遺傳一致度最高，表明這2個派別間的遺傳分化較小，而白楊派和青楊派之間的遺傳一致度最低。

表5 楊屬3個派別間的遺傳一致度與遺傳距離

注：上三角為遺傳一致度，下三角為遺傳距離。

2.4 楊屬3個派別的32份無性系的遺傳多樣性分析

利用UPGMA法對來自楊屬3個派別共32份資源進行聚類分析可知，32份楊樹無性系之間的遺傳距離為0.056～0.741，平均遺傳距離為0.359，其中，中林2000楊和歐美107楊之間的遺傳距離最小，總之，試驗所選取的楊屬3個派別間的遺傳距離變化較大，能較好地表現(xiàn)出各個楊樹無性系之間的差異，表明選取的材料具有一定的代表性。

在遺傳距離為0.580處，32份楊樹無性系可以分為兩大類，第Ⅰ類為全部白楊派的13個無性系，第Ⅱ類為全部黑楊派的14個無性系和青楊派的5個無性系，這與3個派別間的聚類結(jié)果相一致(圖2)。

圖2 32個楊樹無性系的遺傳聚類結(jié)果

3 結(jié)論與討論

相對于其他分子標記，SSR分子標記以其周期短、試驗可重復性強、多態(tài)性較高和不受環(huán)境影響而被廣泛應用[12]。本試驗采用SSR分子標記對32個楊樹無性系進行了分析，其多態(tài)位點百分率為100.00%，均高于韓騫等[13]的93.40%和王輝等[14]的96.38%，說明本試驗供試材料具有較大的差異。

本研究采用UPGMA法對楊樹不同類群進行了遺傳多樣性分析。其中，黑楊派楊屬植物與青楊派楊屬植物聚為一類，白楊派單獨聚為了一類，這一結(jié)果與于兆英等[15]認為白楊派與楊屬其他內(nèi)群之間有一定間隔的觀點相一致。本試驗中楊屬3個派別間的Nei′s基因多樣性(h)為0.184～0.217，其排列順序依次是黑楊派>白楊派>青楊派，表明這3個楊屬派別間遺傳基礎較為狹窄，這可能是因為，楊樹常被人為地選擇優(yōu)良無性系進行雜交育種，使得所選育出的無性系常常出現(xiàn)一個共同的母本或父本，造成了遺傳多樣性較低的局面。對來自這3個派別的32份楊樹無性系進行聚類分析，結(jié)果表明，這些楊樹無性系之間的遺傳距離為0.056～0.741，各無性系之間表現(xiàn)出了很大的遺傳差異。所有楊樹無性系可以分為兩大類：一類是所有的白楊派無性系，另一類是所有的黑楊派和青楊派無性系，這一聚類結(jié)果與李樹春等[16]對不同派別楊樹無性系聚類分析結(jié)果一致，這也表明了黑楊派與青楊派之間親和力較強，雜交易得到種子。

在每個派別的具體聚類中，具有相同起源的一些樣品聚為了一類，如白楊派的毛白楊、易縣雌株都為毛白楊的天然雜種，二者最先聚在一起；北林1號和北林2號是從白楊三倍體中選育出的無性系，具有相同的起源。在黑楊派中，中林46楊、中林2000楊、歐美107楊和歐美108楊聚為一類，這幾個速生楊是美洲黑楊和歐洲黑楊的雜種后代，有著相同的起源；丹紅楊和南楊是美洲黑楊36號楊與50號楊雜交后代的雌株和雄株，二者的親本相同；中懷1號楊和中懷2號楊是美洲黑楊50號楊與帝國楊雜交后代的雌株和雄株，二者同樣具有相同的親本，在聚類中二者與身為親本之一的美洲黑楊50號楊聚在一起；廊坊楊1與作為親本之一的山海關楊聚在了一起，表現(xiàn)了較近的親緣關系。在較細微的聚類中，雜交后代之間、雜交后代與親本之間都有很強的關聯(lián)性，往往有著相同親本的無性系植株聚為一類，同時，有著同樣起源的不同種的植株也聚在了一起，表明近源種植株之間也有著很強的關聯(lián)性。因此，本研究結(jié)果進一步揭示了SSR分子標記技術在楊樹品種鑒定中的可靠性，SSR分子標記技術在無性系聚類分析中具有一定優(yōu)勢。

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Analysis of Genetic Diversity ofPopulusfrom Three Different Factions by SSR Markers

HAN Zhixiao1,ZHANG Jun2*,ZUO Lihui2,REN Yachao2

(1.Stated-owned Assets Management Bureau,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China;2.College of Forestry,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China)

Thirteen pairs of SSR primers which met the requirements were screened from 28 pairs of poplar basic core primers.The PCR amplification of 32 poplar lines from Sect.LeuceDuby,Sect.AigeirosDuby and Sect.TacamahacaSpach was done by use of these primers,and the genetic diversity and genetic relationship of these samples were analyzed at the same time.The results showed that 58 DNA bands were obtained,and polymorphic bands accounted for 100.00% of amplification bands.The calculating results showed that the genetic distance of 32 poplar lines ranged between 0.056 and 0.741,which indicated that high genetic diversity existed among the samples.The result of cluster analysis showed that the samples could be divided into three clusters,namely Sect.LeuceDuby,Sect.AigeirosDuby and Sect.TacamahacaSpach.And the clustering results were consistent with the results of traditional taxonomy,which showed the reliability of SSR molecular marker technology in identification of different species ofPopulus.

Populus; SSR; genetic diversity

2016-12-08

國家林業(yè)局科技發(fā)展中心項目(XPC-201505)

韓志校(1987-)，女，河北石家莊人，助理實驗師，碩士，主要從事實驗室管理工作。 E-mail:hzx19870517@126.com

*通訊作者：張 軍(1979-)，男，河北石家莊人，講師，博士，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail:zhangjunem@126.com

S792.11

A

1004-3268(2017)04-0099-05