干細(xì)胞治療糖尿病研究：進(jìn)展、挑戰(zhàn)和發(fā)展前景

張怡，孟慶雪，付寅生

1.老年性疾病干細(xì)胞技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心；2.黑龍江省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心；3.黑龍江天晴干細(xì)胞股份有限公司；黑龍江 哈爾濱 150028

干細(xì)胞治療糖尿病研究：進(jìn)展、挑戰(zhàn)和發(fā)展前景

張怡1,2，孟慶雪1,2，付寅生3

1.老年性疾病干細(xì)胞技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心；2.黑龍江省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心；3.黑龍江天晴干細(xì)胞股份有限公司；黑龍江 哈爾濱 150028

糖尿病是一類伴隨嚴(yán)重腎衰竭、失明、糖尿病足、高血壓和心血管疾病等并發(fā)癥的代謝性疾病。目前，臨床治療手段均無法實(shí)現(xiàn)糖尿病治愈。干細(xì)胞可以對失衡的免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，還能分化為胰島樣分泌細(xì)胞，從而為糖尿病治愈提供了可能。本文著重從胰島樣細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞包埋技術(shù)入手，總結(jié)了干細(xì)胞研究和治療技術(shù)在糖尿病中的進(jìn)展和存在的問題，并對未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。

糖尿??；干細(xì)胞；胰島生成細(xì)胞；細(xì)胞包埋

糖尿病是一種慢性代謝性、多因素疾病，由絕對（Ⅰ型糖尿?。┖拖鄬Γá蛐吞悄虿。┑囊葝u素缺乏導(dǎo)致高血糖癥，兩者之間的共同點(diǎn)均是胰島β細(xì)胞功能不足，除此兩類之外，還包括其他特殊糖尿病和妊娠糖尿病[1-2]。Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者居多，臨床早期無明顯癥狀，癥狀期會出現(xiàn)三多一少現(xiàn)象，常常伴隨身體多系統(tǒng)的損害，嚴(yán)重傷害身體，甚至威脅生命。流行病學(xué)研究表明，2010年中國總體已有的糖尿病患者達(dá)11.6％，約50％的中國成年人為糖尿病前期人群，這些人群在沒有控制的情況下很可能逐步發(fā)展成為糖尿病患者[3]。2011/2012年期間調(diào)查數(shù)據(jù)也揭示出12％～14％的美國成年人是糖尿病患者，全球患病人數(shù)成倍增加已屬必然[4]。糖尿病可由基因或基因和環(huán)境共同作用引起。Ⅰ型糖尿病的發(fā)病主要是自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞破壞，無法維持葡萄糖水平的穩(wěn)定[5-7]。人類白細(xì)胞抗原基因上有多個基因與免疫介導(dǎo)的糖尿病易感性有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[8]，同時環(huán)境因素對糖尿病的發(fā)生起到了實(shí)質(zhì)性作用[9]。Ⅱ型糖尿病患者通常存在基因缺陷，發(fā)病機(jī)制包括胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，任何引起此種發(fā)病機(jī)制變化的條件均為誘發(fā)因素，包括基因突變、生活方式、環(huán)境、年齡、胰島素抵抗、糖尿病家族史及種族[10]。

1 糖尿病治療的新思路

糖尿病治療主要是血糖控制和胰島移植。血糖控制常見的醫(yī)療手段是通過各種口服藥物或胰島素替代治療暫時改善患者癥狀，2014年獲準(zhǔn)在美國上市的經(jīng)肺給藥快速起效的吸入式胰島素Afrezza[11]和目前進(jìn)入ⅡB期臨床研究的口服式胰島素ORMD-0801[12]為糖尿病病人方便地使用胰島素提供了新可能。然而在控制血糖水平的同時，咳嗽等副作用明顯[13]，同時不能精準(zhǔn)模擬β細(xì)胞對葡萄糖的動態(tài)調(diào)節(jié)作用，是此類非治愈性治療手段的重要缺陷，在此期間病人仍會因為糖尿病引起一系列并發(fā)癥，如腎衰竭或失明、糖尿病足、心血管疾病等[14]。胰島移植，特別是對重癥患者來說是一種更直接的治療方法，但由于面臨的供體缺乏、胰腺/胰島分離費(fèi)用高、移植產(chǎn)生的瞬時血液介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、需要多次移植和長期服用免疫排斥藥物等問題而不能在臨床上廣泛應(yīng)用[15]。糖尿病患者胰島功能的改善對延緩并發(fā)癥的發(fā)生尤為重要，借助干細(xì)胞技術(shù)，在糖尿病患者體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注的研究方向。采用干細(xì)胞治療糖尿病，希望解決的問題[16-17]包括：獲得更多的胰島β細(xì)胞；激活、再生體內(nèi)自身胰島細(xì)胞；調(diào)節(jié)紊亂的免疫系統(tǒng)；降低胰島素的抵抗作用。干細(xì)胞理論和技術(shù)的迅速崛起，給糖尿病治療提供了新的思路，打破了以往治療中存在的局限性，為糖尿病徹底治愈提供了可能。我們按照干細(xì)胞移植的不同方式，總結(jié)了近年來干細(xì)胞治療糖尿病的研究進(jìn)展，也對目前的技術(shù)、臨床研究困境和存在的問題做了回顧。

2 干細(xì)胞治療糖尿病的研究進(jìn)展

2.1 干細(xì)胞誘導(dǎo)成為胰島素生成細(xì)胞后移植

干細(xì)胞具有多向分化潛能，在一定條件下可分化為胰島β細(xì)胞或胰島素生成細(xì)胞（insulin-pro?ducing cells，IPCs）[18]，這是替代現(xiàn)有短缺的胰島細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)臨床糖尿病治療的重要途徑。目前用于誘導(dǎo)分化β細(xì)胞的干細(xì)胞包括成體干細(xì)胞[19]、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）等[20]。誘導(dǎo)分化方法分為化合物分段誘導(dǎo)法[19-22]、基因修飾法[23-24]、microRNA[25]、共培養(yǎng)誘導(dǎo)法等4種?；衔镎T導(dǎo)法最早可以追溯到2006年Tim?per等的研究工作，后為很多研究者發(fā)展演變。Czubak等報道了一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化IPCs的體系，在多種生長因子、煙酰胺、高濃度葡萄糖和無血清DMEM的作用下，經(jīng)過3個階段的分化可獲得高達(dá)31.4％的C肽陽性細(xì)胞[19]。Was?sef等[26]應(yīng)用艾塞那肽-4和TGF-β誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為β細(xì)胞，分別比較間充質(zhì)干細(xì)胞和已分化間充質(zhì)干細(xì)胞對Ⅰ型糖尿病大鼠的治療效果，發(fā)現(xiàn)二者均使胰島素 1、Smad3、PDX1、PAX-4、neuroD等基因的表達(dá)增加，胰島素水平顯著提高，并且已分化間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果要優(yōu)于未分化間充質(zhì)干細(xì)胞。有研究者建立了從iPSCs有效誘導(dǎo)為PDX-1+、NKX-6.1+胰芽細(xì)胞的培養(yǎng)條件，人類PDX-1+、NKX-6.1+細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后，經(jīng)體外葡萄糖的刺激，在小鼠血液中發(fā)現(xiàn)人類C肽[27]。Abouzaripour等[28]對小鼠骨髓的研究發(fā)現(xiàn)含有表達(dá)多能干細(xì)胞陽性標(biāo)志物SSEA-1的細(xì)胞，除此之外，還表達(dá)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4、CXC趨化因子受體4和干細(xì)胞抗原1，SSEA-1陽性細(xì)胞在特定分化培養(yǎng)基的作用下產(chǎn)生胰島素分泌細(xì)胞，表達(dá)Pdx1和Glut2蛋白，更重要的是葡萄糖的存在能刺激胰島素分泌。基因修飾法產(chǎn)生IPCs的技術(shù)主要是讓干細(xì)胞單獨(dú)過表達(dá)PDX1或同時過表達(dá)PDX1和NGN3基因，從而提高轉(zhuǎn)錄因子FoxA2、Nkx2.2和NeuroD的水平[29]。Raikwar等[30]把PDX1轉(zhuǎn)染到ESCs的細(xì)胞核，下游的靶基因被激活，使ESCs定向分化為胰島素分泌細(xì)胞，帶有PDX1基因的胚胎干細(xì)胞移植給糖尿病小鼠，可分化為胰島β細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖尿病小鼠血糖水平。Limbert[29]等通過高表達(dá)PDX1和NGN3基因，在糖尿病鼠體內(nèi)葡萄糖升高時誘導(dǎo)胰島素和C肽水平。盡管Plaisance[31]和Klooster?man[32]等分別報道了miRNA在調(diào)節(jié)胰島功能中的作用，直到2015年[30]才將miR-375和anti-miR-9共轉(zhuǎn)導(dǎo)到間充質(zhì)干細(xì)胞中誘導(dǎo)IPCs的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)導(dǎo)后 14d 形 成 表 達(dá) Sox17、FoxA2、Nkx2.2、Glut2、Pdx1和Ngn3的細(xì)胞團(tuán)，共轉(zhuǎn)導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞在分化成為IPCs的同時，表現(xiàn)出葡萄糖依賴。利用共培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)的以上研究顯示，在體外干細(xì)胞可通過不同的誘導(dǎo)方法分化為胰島β細(xì)胞，補(bǔ)充已損傷的β細(xì)胞并發(fā)揮胰島功能，在一定程度上控制血糖水平，成為治療糖尿病的有效方法。

2.2 干細(xì)胞直接移植

干細(xì)胞可能的直接分化和免疫調(diào)節(jié)作用，是干細(xì)胞治療糖尿病的初衷，包括干細(xì)胞直接局部或靜脈注射2種方式。如此簡單的方式是否能夠達(dá)到預(yù)期的結(jié)果一直是科學(xué)家關(guān)注的話題，而臨床研究中，治療糖尿病的干細(xì)胞種類也包括了造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島前體細(xì)胞等，來源也包括了自體和異體。Couri等[33]對23例新患Ⅰ型糖尿病的患者采用非清髓自體造血干細(xì)胞移植，在29.9個月的隨訪中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)患者C肽水平顯著提高且實(shí)現(xiàn)了胰島素非依賴性。Gu等[34]進(jìn)行自體非清髓性造血干細(xì)胞移植Ⅱ期臨床試驗，包括14～30歲的28名Ⅰ型糖尿病患者，在造血干細(xì)胞移植前后，大多數(shù)患者出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少、發(fā)熱、惡心、嘔吐、脫發(fā)和骨髓抑制，沒有發(fā)生嚴(yán)重的急性藥物毒性、感染或器官損傷；42個月的隨訪表明，53.6％患者治療后完全緩解，為不依賴胰島素，非DKA組緩解率70.6％，DKA組緩解率27.3％；在23.8±12.7個月中，8名患者完全緩解（緩解率28.6％），7名患者復(fù)發(fā)開始使用胰島素，在DKA組僅在6和18個月觀察到空腹C肽水平和C-max水平顯著升高，無死亡病例。Cantú-Rodríguez等[35]選取長期胰島素依賴、8～25歲、GAD抗體呈陽性、C肽水平＞1.0ng/mL及確診3個月以內(nèi)的16位患者為研究對象，進(jìn)行AHSCT治療，經(jīng)過56個月的隨訪發(fā)現(xiàn)，44％的患者在隨訪期間不依賴胰島素，37％的患者減少胰島素使用，19％的患者未得到任何緩解。Wang等[36]利用Meta分析了15個2008～2014年發(fā)表的自體干細(xì)胞治療Ⅱ型糖尿病的臨床研究（總計包括497個病人，3～12個月的隨訪）結(jié)果，比對后得出的結(jié)論是，自體干細(xì)胞（包括自體骨髓單核細(xì)胞和自體外周血單核細(xì)胞）在一定程度上對Ⅱ型糖尿病可以顯著控制血糖、提高胰島素生物合成和從現(xiàn)存的β細(xì)胞中分泌出來。

異體干細(xì)胞直接移植治療糖尿病臨床研究中細(xì)胞來源包括羊膜、尿源、臍帶、臍血等。Liu等[37]將異體羊膜干細(xì)胞用于Ⅰ型糖尿病年輕患者，在36個月的隨訪中未使用胰島素，高血糖情況得到改善。Jiang等[38]分離外來體尿源干細(xì)胞（USCs-Exo），經(jīng)尾靜脈注射鏈脲霉素誘導(dǎo)的SD糖尿病大鼠，每周1次，連續(xù)12周，持續(xù)觀察USCs-Exo對腎臟和血管生成的影響，體外試驗表明USCs-Exo對足細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，能減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。USCs-Exo分泌的生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子β1、血管生成素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7等，可能會促進(jìn)血管再生和細(xì)胞存活。Thakkar等[39]應(yīng)用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合自體或異體造血干細(xì)胞移植治療Ⅰ型糖尿病，血清中糖化血紅蛋白和C肽水平都有所改善，谷氨酸脫羧酶抗體降低，平均胰島素需要量減少，在治療過程中無不良反應(yīng)發(fā)生。Skyler等[40]采用Mesoblast的異體骨髓間充質(zhì)前體細(xì)胞（MPCs）進(jìn)行多中心、隨機(jī)、單盲Ⅱ型糖尿病臨床試驗，采用階梯式MPCs注射量（0.3×106～2.0×106/kg），發(fā)現(xiàn)所有治療組在1周后都實(shí)現(xiàn)了HbA1c的降低，高劑量組（2.0×106/kg）HbA1c顯著下降并保持到在12周仍有33％的患者的HbA1c＜7％。El-Badawy從4122個臨床研究項目中對符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的22項（包含524個Ⅰ型糖尿病病例）進(jìn)行Meta分析[41]，包括自體和異體細(xì)胞以及多種細(xì)胞同時移植的案例，結(jié)果表明，干細(xì)胞直接移植對選定的病人是安全有效的。輸注的細(xì)胞種類、來源、疾病治療階段對治療效果影響顯著，Meta分析發(fā)現(xiàn)最好的治療結(jié)果來自CD34陽性造血干細(xì)胞移植，58.9％患者可以實(shí)現(xiàn)平均16個月的胰島素停用，而臍帶血干細(xì)胞移植治療結(jié)果不如骨髓造血干細(xì)胞移植理想，采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療Ⅰ型糖尿病有顯著優(yōu)勢。

2.3 干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)法

不論是Ⅰ型還是Ⅱ型糖尿病，都存在免疫系統(tǒng)的紊亂，這就是利用干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力進(jìn)行糖尿病研究的設(shè)計理念。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs不僅可以抑制單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞（DC）的分化，還能抑制DC產(chǎn)生TNF-α、抑制漿細(xì)胞樣DC（pDC）對分泌IL-10的上調(diào)，以及抑制對免疫排斥有作用的CD4+、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的擴(kuò)增。通過PGE2和IDO的調(diào)節(jié)作用，MSCs可以抑制NK細(xì)胞的活化、細(xì)胞毒性和IFN-γ的分泌[42]。這些免疫調(diào)節(jié)作用在MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)、共移植體系中均有展現(xiàn)。糖尿病大鼠體內(nèi)移植異體胰島細(xì)胞的同時，若共移植同一來源的MSCs，使得T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α下調(diào)，結(jié)果移植的胰島細(xì)胞存活周期將超過1個月，而單獨(dú)移植的胰島細(xì)胞僅在動物體內(nèi)存活1周[43]。小鼠實(shí)驗結(jié)果也類似，Borg等[44]在STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的糖尿病小鼠腎臟、肝臟和眼內(nèi)分別共移植胰島和MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs并沒有促進(jìn)β或α細(xì)胞增殖、細(xì)胞外層黏連蛋白增加，也沒有MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島分泌細(xì)胞，而是在移植的早期起到調(diào)節(jié)共移植的胰島細(xì)胞存活的作用。干細(xì)胞外泌體（exosomes）的免疫調(diào)節(jié)能力對糖尿病人胰島微環(huán)境中其他細(xì)胞的營養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用也有文獻(xiàn)報道[45]。MSCs外泌體參與了PGE2和TGF-β信號通路和IL-10的分泌，因而將T細(xì)胞的炎性反應(yīng)向抗炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)變。而過表達(dá)siFas和anti-miR-375的骨髓MSCs抑制了胰島細(xì)胞中Fas和miR-375的表達(dá)，從而提高胰島細(xì)胞活性和對抗炎性因子的作用[46]。臨床研究中，Zhao等[47-48]則充分利用了臍血中特殊的多能干細(xì)胞（cord blood stem cells，CB-SCs）的免疫調(diào)節(jié)能力，發(fā)明了一種體外干細(xì)胞教育器（stem cell ed?ucator，SCE），病人失衡的免疫細(xì)胞經(jīng)過單采機(jī)采出后流經(jīng)固定了CB-SCs的SCE，“受教育”后再循環(huán)回到患者體內(nèi)，完成一個治療過程，此過程干細(xì)胞并不移植入患者體內(nèi)。目前此方法在中國和西班牙對Ⅰ、Ⅱ型糖尿病分別進(jìn)行了臨床研究。15名Ⅰ型糖尿病患者應(yīng)用干細(xì)胞教育器進(jìn)行治療，包括對照組3人，殘存β細(xì)胞的患者6人和無殘存β細(xì)胞的患者6人，經(jīng)過SCE治療的患者CD28和ICOS表達(dá)量增加，血清中TGF-β1水平顯著增加，空腹C肽水平持續(xù)性提高，改善血糖控制并降低糖化血紅蛋白水平[47]。SCE方法對記憶T細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能是其起到治療作用的機(jī)理之一，經(jīng)SCE治療后，naive CD4+T細(xì)胞、CD4+中央記憶T細(xì)胞持續(xù)顯著增加，而CD4+效應(yīng)記憶T細(xì)胞和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞持續(xù)降低，從而使Ⅰ型糖尿病患者血糖控制得到長期改善[49]。在SCE對36位Ⅱ型糖尿病臨床研究中，患者Th1和Th2類細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-12、IL-17A都顯著降低，CD86+CD14+單核細(xì)胞顯著下降，1次治療后隨訪病人對胰島素的敏感性增強(qiáng)，糖化血紅蛋白含量顯著下降，C肽水平顯著升高[48]，從而緩解了JNK和/或IKKβ/NF-κB途徑促進(jìn)的Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗的發(fā)生。2015年12月美國FDA也批準(zhǔn)了Hackensack University Medical Center提出的使用SCE進(jìn)行Ⅰ型糖尿病的Ⅰ期臨床研究的申請。

2.4 結(jié)合組織工程材料后移植

利用組織相容性材料做成的半透膜對移植的胰島細(xì)胞進(jìn)行包埋，以保證小分子物質(zhì)（葡萄糖、胰島素、O2、細(xì)胞代謝物）的交換和對免疫系統(tǒng)（免疫細(xì)胞、免疫球蛋白、補(bǔ)體等大分子）的隔離，這種技術(shù)的發(fā)展歷史可追溯到50多年前[50]。隨后的50年中，macrocapsulation（包埋大量移植細(xì)胞）和microcapsulation（包埋1～3個細(xì)胞）的包囊技術(shù)[51]在胰島細(xì)胞包埋研究中均有長足發(fā)展。不論是血管外還是血管內(nèi)置型macrocapsules，其特點(diǎn)都是胰島樣細(xì)胞可以類似在天然胰島組織中一樣聚集成團(tuán)，細(xì)胞之間和細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間的通訊保持完好，需要解決的問題是包埋的細(xì)胞團(tuán)和血管的近距離接觸，解決O2供給不及時、葡萄糖和胰島素的響應(yīng)滯后等現(xiàn)象。與之相反，mi?crocapsules的特點(diǎn)是移植容易，但不易從身體中移除，微囊的孔徑分布不均，即使是1％的抗體、補(bǔ)體或細(xì)胞因子的滲透都會啟動免疫抑制反應(yīng)，從而易對移植細(xì)胞造成攻擊[52]。目前研究最充分的包埋聚合材料是從天然海藻中提取的海藻酸鹽水凝膠材料，以其為主要成分，經(jīng)交聯(lián)、修飾、組合獲得多種microcapsules，在孔徑分布、囊壁硬度、生物相容性和滲透性上均有所改善。Calafio?re領(lǐng)導(dǎo)的小組最早采用海藻酸鹽制作的microcap?sules包埋人異體胰島細(xì)胞，對無服用免疫抑制劑的Ⅰ型糖尿病患者進(jìn)行臨床研究[53-54]，經(jīng)過3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)起初病人均能降低血糖和減少胰島素使用且沒有發(fā)現(xiàn)對移植物的排斥反應(yīng)，但長期隨訪結(jié)果不理想，病人都恢復(fù)了原有的胰島素使用劑量。Living Cell Technologies從2009至今針對Ⅰ型糖尿病完成了3項臨床研究，移植物為以海藻酸鹽為內(nèi)層、IMMUPEL為外層的豬胰島包埋微囊（DIABECELL），最終結(jié)果尚未報道。Cerco Medical公司用海藻酸鹽做成了狀似紙片的mac?rocapsules（名為 Islet Sheet），每張 Islet Sheet大小為4cm×6cm×0.3mm，可置放10萬個胰島細(xì)胞，預(yù)計皮下移植6張Islet Sheet可使得一個病人擺脫胰島素的使用。此項研究正在進(jìn)行Ⅰ型糖尿病模型狗的試驗[55]。近幾年，對干細(xì)胞來源的胰島樣細(xì)胞的包埋研究逐漸增多，Vegas等[56]應(yīng)用三唑硫嗎啉氧化物（TMTD）修飾的海藻酸鹽做成500μm、1.5mm 和 1.5mm TMTD 細(xì)胞包埋微囊，結(jié)果表明1.5mm TMTD海藻球包裝的干細(xì)胞來源的β細(xì)胞效果最明顯，可維持正常血糖超過70d，C肽水平也最高，同時發(fā)現(xiàn)TMTD海藻球能抑制先天性免疫細(xì)胞群的活化、減輕免疫應(yīng)答、維持干細(xì)胞分化獲得的β細(xì)胞一直保持其分化狀態(tài)。在多個采用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性干細(xì)胞途徑獲得胰島樣細(xì)胞的研究中，ViaCyte研究項目進(jìn)展最快，其移植細(xì)胞PEC-01是由胚胎干細(xì)胞規(guī)?；T導(dǎo)擴(kuò)增獲得的未成熟內(nèi)分泌細(xì)胞組成[57]，PEC-01在macrocapsules（Encaptra微囊給藥系統(tǒng)）的包埋下形成既可整體又可完整取出的移植物（VC-1），Encaptra給藥系統(tǒng)包囊材質(zhì)為雙層聚四氟乙烯（PTFE）結(jié)構(gòu)，內(nèi)層為400nm孔徑，外層為5μm孔徑。動物研究表明，這種雙層結(jié)構(gòu)既可保護(hù)包埋細(xì)胞，又可促進(jìn)新生血管在包埋材料內(nèi)形成、促進(jìn)VEGF擴(kuò)散和營養(yǎng)供應(yīng)[58-59]。2014年美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)行Ⅰ/Ⅱ期臨床研究[60]，2016年10月再次批準(zhǔn)VC-1進(jìn)行多中心3年隨訪研究。

3 干細(xì)胞技術(shù)治療糖尿病的挑戰(zhàn)

干細(xì)胞技術(shù)雖然在糖尿病治療中展現(xiàn)出了前所未有的希望，但真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用仍存在很多問題，需要更多的研究去解決。

文獻(xiàn)報道的經(jīng)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞后進(jìn)行糖尿病研究的方法雖然很多，但分化步驟均相當(dāng)復(fù)雜，成體干細(xì)胞分化胰島樣細(xì)胞效率明顯不如iPS或胚胎干細(xì)胞來源，獲得的IPCs分泌胰島素能力也明顯低于生理狀態(tài)下的β細(xì)胞。有研究者計算，根據(jù)目前誘導(dǎo)后的細(xì)胞胰島素分泌能力，有可能未來需要至少移植109個IPCs，量大得足以組成一個正常人胰島組織中全部細(xì)胞量[61]，而且目前大多數(shù)研究還是實(shí)驗室平皿規(guī)模的試驗，大規(guī)模生物反應(yīng)器級別的擴(kuò)增、誘導(dǎo)過程、系統(tǒng)化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍需要建立。另外一個瓶頸問題是誘導(dǎo)后的胰島素樣細(xì)胞在體內(nèi)是否能夠長期穩(wěn)定存活？是不是會隨著時間的延長出現(xiàn)去分化現(xiàn)象？因為沒有和宿主的免疫系統(tǒng)隔離，其在體內(nèi)受糖尿病病人失衡的免疫微環(huán)境攻擊的可能性極大，其細(xì)胞活性、胰島素分泌能力和同步響應(yīng)血糖的能力均會受到挑戰(zhàn)。解決此問題的關(guān)鍵，有可能需要和胰島β細(xì)胞移植或胰島內(nèi)分泌細(xì)胞PEC-01移植一樣，利用組織工程材料進(jìn)行包埋，那么包埋技術(shù)的選擇將是又一個瓶頸問題。不論是海藻酸鈉生物材料還是其他正在研究的有機(jī)、無機(jī)材料或者納米材料，都需要使包埋后的移植細(xì)胞能象正常的胰島組織一樣，在150～200μm附近有動脈毛細(xì)血管存在，從而可以及時實(shí)現(xiàn)血O2擴(kuò)散、養(yǎng)分?jǐn)U散和代謝物移除。良好的生物相容材料在隔離機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的同時，要把握細(xì)胞包埋材料促血管形成作用、移植方式、移植物尺寸/厚度、移植物移除方便程度等因素之間的平衡，降低移植后細(xì)胞因接收O2和養(yǎng)分不及時而死亡的幾率[62]。第三個問題是如何解決干細(xì)胞誘導(dǎo)后的胰島素樣細(xì)胞的協(xié)同作用，正常機(jī)體和胰島移植時是利用了組織或多細(xì)胞協(xié)同方式實(shí)現(xiàn)機(jī)體的胰島素分泌調(diào)控方式，而IPCs或單獨(dú)的β細(xì)胞移植僅僅提供一種胰島細(xì)胞，因此其和胰島內(nèi)其他支持性細(xì)胞沒有起到協(xié)調(diào)作用，未來要解決多細(xì)胞和IPCs的協(xié)調(diào)作用，從而模擬自然胰島狀態(tài)。

從干細(xì)胞直接移植角度分析，采用此方法進(jìn)入臨床研究的遠(yuǎn)比分化后進(jìn)行移植的報道多，然而問題是很多研究因為沒有清晰的對照組，而且大多研究病例數(shù)有限，從而其結(jié)果的公信度受到質(zhì)疑。例如Wang等[37]用Meta分析的15個研究項目的病例數(shù)大多低于50，隨訪時間均較短，且其中有12項來自一個國家，因此整體來講，臨床試驗獲得的結(jié)論有一定的局限。這15項臨床研究基本都是根據(jù)病人意愿而非隨機(jī)入組，因而對于自體干細(xì)胞治療Ⅱ型糖尿病的結(jié)論還需要更大隊列研究方可得出系統(tǒng)的結(jié)論。另外，直接干細(xì)胞移植多項研究均是針對早期糖尿病患者有治療效果的關(guān)鍵，新發(fā)病或處于糖尿病早期、糖尿病酮癥酸中毒輕的患者總體治療效果顯著[41]，因此對于晚期患者，如何直接采用干細(xì)胞進(jìn)行治愈性糖尿病治療仍是未解決的難題。另外，近年報道了幾個利用干細(xì)胞移植治療糖尿病的失敗的臨床研究，包括佛羅里達(dá)大學(xué)和Juvenile Diabe?tes Research Foundation（JDRF）資助的臍帶血干細(xì)胞在青少年Ⅰ型糖尿病臨床試驗的失敗[63]、Osiris Therapeutics 骨髓來源的 MSCs（Prochymal）在Ⅱ期臨床試驗1年隨訪結(jié)果顯示其糖尿病治療組C肽水平和對照組無差別。這也不禁讓我們思考，異體干細(xì)胞直接移植是否是治愈糖尿病的研究方向？選用何種類型干細(xì)胞、進(jìn)行何種預(yù)處理、糖尿病適應(yīng)癥如何選擇才是合理的臨床試驗策略？異體干細(xì)胞，尤其是目前采用較多的胚胎或iPS來源的干細(xì)胞會否在體內(nèi)造成致瘤風(fēng)險？

4 結(jié)語

糖尿病發(fā)生在胰臟，但卻是一個代謝性、全身性、遺傳性疾病，目前仍然無法根治。采用干細(xì)胞技術(shù)對糖尿病的研究仍處于“嬰兒期”，仍有諸多機(jī)理性問題沒有揭示，很多技術(shù)難題尚未攻克，臨床轉(zhuǎn)化過程的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無法統(tǒng)一，統(tǒng)一的臨床方案還須實(shí)踐。但近年來干細(xì)胞在細(xì)胞分化、組織包埋、免疫教育、組織再生等領(lǐng)域突破中起到的作用，給糖尿病從治療走向治愈道路開啟了一條蹊徑。美國Juvenile Diabetes Cure Alli?ance于2013年將干細(xì)胞教育技術(shù)SCE列為6個可能治愈糖尿病的項目之一，2015年又從380個研究項目中篩選出11項可能治愈癌癥的項目，其中包括干細(xì)胞教育SCE項目和Viacyte的胚胎干細(xì)胞來源的胰島內(nèi)分泌細(xì)胞包埋移植項目[64]。糖尿病患者有望利用干細(xì)胞技術(shù)，改變傳統(tǒng)糖尿病藥物和胰島素?zé)o法實(shí)現(xiàn)的如對血糖變化的實(shí)時響應(yīng)、控制糖化血紅蛋白含量、提高胰島細(xì)胞再生修復(fù)、降低多重糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，從而走向再生修復(fù)之路。隨著材料技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)和基因技術(shù)的發(fā)展，干細(xì)胞治療糖尿病曙光在望，人類將有望突破現(xiàn)有瓶頸，徹底治愈糖尿病。

[1] Kuo C Y,Lin C H.Stem cell therapy:differentiation potential of insulin producing cells from human adi?pose derived stem cells and umbilical cord MSCs[J].Int J Clin Med Res,2014,1（1）:21-25.

[2] Tsai P J,Wang H S,Lin C H,et al.Intraportal injec?tion of insulin-producing cells generated from human bone marrow mesenchymal stem cells decreases blood glucose level in diabetic rat[J].Endocr Res,2014,39（1）:26-33.

[3] Xu Y,Wang L,He J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310（9）:948-959.

[4] Menke A,Casagrande S,Geiss L,et al.Prevalence and trends in diabetes among adults in the United States,1988-2012[J].JAMA,2015,314（10）:1021-1029.

[5] Lehuen A,Diana J,Zaccone P,et al.Immune cell crosstalk in type 1 diabetes[J].NatRev Immunol,2010,10:501-513.

[6] Figliuzzi M,Bonandrini B,Silvani S,et al.Mesenchy?mal stem cells help pancreatic islet transplantation to control type 1 diabetes[J].World J Stem Cells,2014,6（2）:163-172.

[7] American Diabetes Association.Diagnosis and classifi?cation of diabetes mellitus[J].Diabetes Care,2013,S67-S74.

[8] Noble J A,Erlich H A.Genetics of type 1 diabetes[J].Cold Spring Harb Perspect Med,2012,2:a007732.

[9] Nokoff N,Rewers M.Pathogenesis of type 1 diabetes:lessons from natural history studies of high-risk indi?viduals[J].Ann N Y Acad Sci,2013,1281:1-15.

[10]Li P,Zhang J F,Li L,et al.The impact of a family history of type 2 diabetes on insulin secretion and in?sulin sensitivity in individuals with varying glucose tol?erance[J].Am J Med Sci,2013,345:22-27.

[11]FDA approves Afrezza to treat diabetes[EB/OL].http://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm403122.htm.

[12]Eldor R,Arbit E,Corcos A,et al.Glucose-reducing effect of the ORMD-0801 oral insulin preparation in patients with uncontrolled type 1 diabetes:a pilot study[J].PLoS One,2013,8（4）:e59524.

[13]Mikhail N.Safety of technosphere inhaled insulin[J].Curr Drug Saf,2017,12（1）:27-31.

[14]Rahmati S,Alijani N,Kadivar M.In vitro generation of glucose-responsive insulin producing cells using len?tiviral based pdx-1 gene transduction of mouse（C57BL/6）mesenchymal stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,437（3）:413-419.

[15]Rekittke N E,Ang M,Rawat D,et al.Regenerative therapy of type 1 diabetes mellitus:from pancreatic is?let transplantation to mesenchymal stem cells[J].Stem Cells Int,2016,2016:3764681.

[16]El-Badri N,Ghoneim M A.Mesenchymal stem cell therapy in diabetes mellitus:progress and challenges[J].J Nucleic Acids,2013,2013:194858.

[17]Chhabra P,Brayman K L.Stem cell therapy to cure type 1 diabetes:from hype to hope[J].Stem Cells Transl Med,2013,2:328-336.

[18]Domínguez-Bendala J,Lanzoni G,Inverardi L,et al.Concise review:mesenchymal stem cells for diabetes[J].Stem Cells Transl Med,2012,1（1）:59-63.

[19]Czubak P,Bojarska-Junak A,Tabarkiewicz J,et al.A modified method of insulin producing cells'generation from bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].J Diabetes Res,2014,2014:628591.

[20]Quiskamp N,Bruin J E,Kieffer T J.Differentiation of human pluripotent stem cells into β-cells:potential and challenges[J].BestPractRes Clin Endocrinol Metab,2015,29（6）:833-847.

[21]Timper K,Seboek D,Eberhardt M,et al.Human adi?pose tissue-derived mesenchymal stem cells differenti?ate into insulin,somatostatin,and glucagon expressing cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,341（4）:1135-1140.

[22]Dave S D,Vanikar A V,Trivedi H L.In-vitro genera?tion of human adipose tissue derived insulin secreting cells:upregulation of Pax-6,Ipf-1 and Isl-1[J].Cyto?technology,2014,66（2）:299-307.

[23]Bahrebar M,Soleimani M,Karimi M H,et al.Genera?tion of islet-like cell aggregates from human adipose tissue-derived stem cells by lentiviral overexpression of PDX-1[J].Int J Organ Transplant Med,2015,6（2）:61-76.

[24]Allahverdi A,Abroun S,Jafarian A,et al.Differentia?tion ofhuman mesenchymalstem cellsintoinsulin producing cells by using a lentiviral vector carrying PDX1[J].Cell J,2015,17（2）:231-242.

[25]Jafarian A,Taghikani M,Abroun S,et al.The genera?tion of insulin producing cells from human mesenchy?mal stemcells by MiR-375 and anti-MiR-9[J].PLoS One,2015,10（6）:e0128650.

[26]Wassef M A,Fouad H,Sabry D,et al.Therapeutic ef?ficacy of differentiated versus undifferentiated mesen?chymal stem cells in experimental typeⅠdiabetes in rat[J].Biochem Biophys Rep,2016,5:468-475.

[27]Toyoda T,Mae S,Tanaka H,et al.Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iP?SCs into pancreatic bud-like progenitor cells[J].Stem Cell Res,2015,14（2）:185-197.

[28]Abouzaripour M,Pasbakhsh P,Atlasi N,et al.In vi?tro differentiation of insulin secreting cells from mouse bone marrow derived stage-specific embryonic antigen 1 positivestem cells[J].CellJ,2016,17（4）:701-710.

[29]Limbert C,P?th G,Ebert R,et al.PDX1 and NGN3-mediated in vitro reprogramming of human bone mar?row-derived mesenchymal stromal cells into pancreatic endocrine lineages[J].Cytotherapy,2011,13（7）:802-813.

[30]Raikwar S P,Zavazava N.Spontaneous in vivo differ?entiation of embryonic stem cell-derived pancreatic en?doderm-like cells corrects hyperglycemia in diabetic mice[J].Transplantation,2011,91（1）:11-20.

[31]Plaisance V,Abderrahmani A,Perret-Menoud V,et al.microRNA-9 controls the expression of Granuphilin/Slp4 and the secretory response of insulin-producing cells[J].J Biol Chem,2006,281（37）:26932-26942.

[32]Kloosterman W P,Lagendijk A K,Ketting R F,et al.Targeted inhibition of miRNA maturation with mor?pholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic is?let development[J].PLoS Biol,2007,5（8）:e203.

[33]Couri C E,Oliveira M C,Stracieri A B,et al.C-pep?tide levels and insulin independence following autolo?gous nonmyeloablative hematopoietic stem cell trans?plantation in newly diagnosed type 1 diabetes mellitus[J].JAMA,2009,301（15）:1573-1579.

[34]Gu W Q,Wang W Q,Sun S Y.Diabetic ketoacidosis at diagnosis influences complete remission after treat?ment with hematopoietic stem cell transplantation in adolescents with type 1 diabetes[J].Diabetes Care,2012,35:1413-1419.

[35]Cantú-Rodríguez O G,Lavalle-González F,Herrera-Rojas M á,et al.Long-term insulin independence in type 1 diabetes mellitus using a simplified autologous stem cell transplant[J].J Clin Endocrinol Metab,2016,101（5）:2141-2148.

[36]Wang Z X,Cao J X,Li D,et al.Clinical efficacy of autologous stem cell transplantation for the treatment of patients with type 2 diabetes mellitus:a meta-anal?ysis[J].Cytotherapy,2015,17:956-968.

[37]Liu Y,Cao D L,Guo L B,et al.Amniotic stem cell transplantation therapy for type 1 diabetes:a case re?port[J].J Int Med Res,2013,41:1370-1377.

[38]Jiang Z Z,Liu Y M,Niu X,et al.Exosomes secreted by human urine-derived stem cells could prevent kid?ney complications from typeⅠdiabetes in rats[J].Stem Cell Res Ther,2016,7（1）:24.

[39]Thakkar U G,Trivedi H L,Vanikar A V,et al.Insu?lin-secreting adipose-derived mesenchymalstromal cellswith bone marrow-derived hematopoietic stem cells from autologous and allogenic sources for typeⅠdiabetes mellitus[J].Cytotherapy,2015,17（7）:940-947.

[40]Skyler J S,Fonseca V A,Segal K R,et al.Allogene?ic mesenchymal precursor cells in type 2 diabetes:a randomized,placebo-controlled,dose-escalation safety and tolerability pilot study[J].Diabetes Care,2015,38（9）:1742-1749.

[41]El-Badawy A,El-Badri N.Clinical efficacy of stem cell therapy for diabetes mellitus:a Meta-analysis[J].PLoS One,2016,11（4）:e0151938.

[42]Spaggiari G M,Capobianco A,Abdelrazik H,et al.Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell pro?liferation,cytotoxicity,and cytokine production:role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin E2[J].Blood,2008,111:1327-1333.

[43]Solari M G,Srinivasan S,Boumaza I,et al.Marginal massislettransplantation with autologousmesenchy?mal stem cells promotes long-term islet allograft sur?vivaland sustained normoglycemia[J].JAutoimmun,2009,32:116-124.

[44]Borg D J,Weigelt M,Wilhelm C,et al.Mesenchymal stromal cells improve transplanted islet survival and is?let function in a syngeneic mouse model[J].Diabetolo?gia,2014,57（3）:522-531.

[45]Hess D,Li L,Martin M,et al.Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration[J].Nat Bio?technol,2003,21（7）:763-770.

[46]Wen D,Peng Y,Liu D,et al.Mesenchymal stem cell and derived exosome as small RNA carrier and Immu?nomodulator to improve islet transplantation[J].J Con?trol Rel,2016,238:166-175.

[47]Zhao Yong,Jiang Zhaoshun,Zhao Tingbao,et al.Re?versal of type 1 diabetes via isletb cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells[J].BMC Med,2012,10:3.

[48]Zhao Yong,Jain S,Thaker H,et al.Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells（CB-SCs）in stem cell educator therapy:phase Ⅰ/Ⅱ clinical tri?al[J].BMC Med,2013,11:160.

[49]Delgado E,Perez-Basterrechea M,Suarez-Alvarez B,et al.Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy:phase 1/2 clinical trial[J].EBioMedicine,2015,2（12）:2024-2036.

[50]Algire G H.Diffusion-chamber techniques for studies of cellular immunity[J].Ann N Y Acad Sci,1957,69（4）:663-667.

[51]Yang H K,Yoon K H.Current status of encapsulated islet transplantation[J].J Diabetes Complications,2015,29（5）:737-743.

[52]Wilson J T,Chaikof E L.Challenges and emerging technologies in the immunoisolation of cells and tissues[J].Adv Drug Deliv Rev,2008,60（2）:124-145.

[53]Calafiore R,Basta G,Luca G,et al.Microencapsulat?ed pancreatic islet allografts into nonimmunosup?pressed patients with type 1 diabetes[J].Diabetes Care,2006,29（1）:137-138.

[54]Basta G,Montanucci P,Luca G,et al.Long-term met?abolic and immunological follow-up of nonimmunosup?pressed patients with type 1 diabetes treated with mi?croencapsulated islet allografts[J].Diabetes Care,2011,34（11）:2406-2409.

[55]Storrs R,Dorian R,King S R,et al.Preclinical devel?opment of the islet sheet[J].Ann N Y Acad Sci,2001,944（1）:252-266.

[56]Vegas A J,Veiseh O,Gürtler M,et al.Long-term gly?cemic control using polymer-encapsulated human stem cell-derived beta cells in immune-competent mice[J].Nat Med,2016,22（3）:306-311.

[57]Agulnick A D,Ambruzs D M,Moorman M A,et al.Insulin-producing endocrine cells differentiated in vi?tro from human embryonic stem cells function in mac?roencapsulation devices in vivo[J].Stem Cells Transl Med,2015,4（10）:1214-1222.

[58]Sweet I R,Yanay O,Waldron L,et al.Treatment of diabetic rats with encapsulated islets[J].J Cell Mol Med,2008,12（6b）:2644-2650.

[59]Stem cells translational medicine[EB/OL].https://medi?calxpress.com/news/2016-02-johnson-viacyte-diabetes.html.

[60]Stem cells translational medicine[EB/OL].https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02239354?term=viacyte&rank=2.

[61]Bhonde R R,Sheshadri P,Sharma S,et al.Making surrogate β-cells from mesenchymal stromal cells:per?spectives and future endeavors[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,46:90-102.

[62]Schweicher J,Nyitray C,Desai T A.Membranes to achieve immunoprotection of transplanted islets[J].Front Biosci（Landmark Ed）,2014,19:49-76.

[63]Haller M J,Wasserfall C H,Hulme M A,et al.Autol?ogous umbilical cord blood transfusion in young chil?dren with type 1 diabetes fails to preserve C-peptide[J].Diabetes Care,2011,34（12）:2567-2569.

[64]Practical cure projects[EB/OL].http://thejdca.org/practi?calcureprojects.

Stem Cell Therapy for Diabetes Mellitus:Progress,Chal?lenges and Perspectives

ZHANG Yi1,2*,MENG Qing-Xue1,2,FU Yin-Sheng3
1.National and Local Joint Stem Cell Research&Engineering Center for Aging Diseases;2.Heilongjiang Re?search Center for Stem Cell Engineering;3.Heilongjiang Tian Qing Stem Cell Co.,Ltd.;Harbin 150028;China
*Corresponding author,E-mail:neo_yi_zhang@163.com

Diabetes mellitus is a group of metabolic diseases with serious long-term complications such as chronic kidney failure,blindness,foot ulcers,hypertension or cardiovascular diseases.Up to now,there has been no any regular treatment known to cure diabetes.Stem cells have the ability to be differentiated into insulin-pro?ducing pancreatic β cells in vitro and reserve the impaired immune system in vivo,which provide a therapeutic po?tential to cure these diseases.We summarized current progress,challenges and perspectives of stem cell research and therapy in diabetes focusing on insulin producing cell differentiation,immune modulation and cell encapsula?tion.

diabetes mellitus;stem cells;insulin producing cells;cell encapsulation

R587.1

A

1009-0002（2017）04-0568-09

2016-12-19

黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃（GA14C105）

張怡（1966-），女，博士，教授級高級工程師；孟慶雪（1987-），女，碩士；二者為共同第一作者

張怡，（E-mail）neo_yi_zhang@163.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.033