平菇多糖中蛋白質(zhì)脫除方法的比較

王新嘉，雷國風，翟志軍，吳曉玉

（南昌市發(fā)酵應用技術重點實驗室/江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045）

平菇多糖中蛋白質(zhì)脫除方法的比較

王新嘉，雷國風，翟志軍，吳曉玉*

（南昌市發(fā)酵應用技術重點實驗室/江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045）

本試驗以蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率以及兩因素的綜合指標為評價指標，采用Sevage法、鹽酸-乙醇等電點法和TCA法，分析比較其對平菇多糖脫蛋白效果的影響。試驗結(jié)果表明，平菇多糖中蛋白質(zhì)脫除率最高的為Sevage法，其次為TCA法；而多糖保留率最高的為鹽酸-乙醇等電點法，其次為TCA。綜合考慮兩因素的影響，以TCA法效果最好。利用Box-Behnken試驗設計，獲得TCA法脫蛋白工藝的回歸方程，再經(jīng)響應面分析，得出脫蛋白最佳方案，即：TCA濃度5.6%，處理時間33min，處理溫度48℃，此時其綜合評價平均值為83.96%，蛋白質(zhì)脫除率為89.5%，多糖保留率為78.4%。

平菇；多糖；脫蛋白；響應面分析

平菇（Pleurotusostreatus）又名側(cè)耳、糙皮側(cè)耳，是擔子菌門傘菌目側(cè)耳科的一個種類，是我國目前栽培最多的4種主要食用菌之一。平菇營養(yǎng)物質(zhì)種類與含量都很豐富，如糖類、蛋白質(zhì)、維生素等，且其氨基酸種類齊全，礦物質(zhì)含量繁多。每100克干品中含蛋白質(zhì)19.43 g，脂肪1.71 g，糖類22.25 g，粗纖維8.21 g[1]，是獲得多糖物質(zhì)的極佳原材料。平菇多糖一般是指平菇水溶性多糖，是目前研究最多的平菇主要成分之一。大量研究結(jié)果表明，平菇多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)人體免疫等功能[2-6]，因此，開發(fā)平菇多糖產(chǎn)品將具有較好的經(jīng)濟和社會效益。

平菇多糖提取過程中往往含有無機鹽、色素、蛋白質(zhì)以及醇不溶性小分子物質(zhì)等雜質(zhì)，比如熱水浸提法獲得的多糖中蛋白質(zhì)含量約為6%～14%。含有蛋白質(zhì)的多糖溶液在柱層析分離時將堵塞凝膠而影響分離效果，并且對后續(xù)多糖結(jié)構(gòu)分析造成影響。蛋白質(zhì)脫除方法一般有Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、CTAB法[7]、大孔吸附樹脂法、等電點沉淀法、酶法及綜合法[8]等。這些方法各有優(yōu)劣。Sevage、大孔吸附樹脂、TCA、和CTAB法均有較好的脫蛋白效果，但前兩者操作復雜，多糖損失較嚴重，后兩種方法TCA和CTAB的用量與多糖損失量成正比[9]。酶解法和鹽酸等電點法盡管作用條件溫和，但因酶具有專一性、等電點法體系的極性不夠等，兩種方法除蛋白效果不太理想[10-11]。有關脫除平菇多糖中蛋白質(zhì)的報道不多，本試驗以平菇鮮品為原料，通過比較Sevage法、鹽酸-乙醇等電點法（加入乙醇以增大體系的極性）和TCA法去除平菇多糖的蛋白質(zhì)效果，優(yōu)化脫除工藝條件，篩選適宜的脫蛋白方法，為后續(xù)的研究提供理論和技術參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

平菇：購于農(nóng)貿(mào)市場。

鹽酸、氫氧化鈉：西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；正丁醇：天津市永大化學試劑有限公司；無水乙醇、三氯甲烷、葡萄糖、三氯乙酸、苯酚：天津市大茂化學試劑廠；濃硫酸、考馬斯亮藍G-250：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白：鹽城賽寶生物科技有限公司。

纖維素酶（5萬U/g）、果膠酶（10萬U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1平菇多糖的提取

將市場上購買的平菇洗凈65℃烘干后粉碎過40目篩得到粉末，常溫下干燥保存。稱量一定量的平菇干粉，按照質(zhì)量比1∶40加入蒸餾水，將pH調(diào)到5.0，再按0.5%的量加入3種酶的混合液，其中3種酶的質(zhì)量比為1∶1∶1，50℃水浴中浸提1.5 h，將水升溫至90℃，滅酶并水浴浸提3 h，3 000 r/min離心10min，棄去沉淀，將濾液濃縮到其體積的1/5至1/4，濃縮液加入4倍體積的無水乙醇過夜沉淀，3 000 r/min離心10min，抽濾，沉淀即為粗多糖。

1.2.2多糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法[12]測定多糖含量。準確稱取標準葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL及1.8mL葡萄糖標液于8支試管中，各以蒸餾水補至2.0mL，然后加入5%苯酚（新制）1.0mL及濃硫酸5.0mL，搖勻冷卻，室溫放置30min后于490 nm測光密度，以2.0mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為葡萄糖濃度（μg/ mL），縱坐標為光密度值，得標準曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curveofglucose

取稀釋到一定倍數(shù)的樣品溶液1mL，按照上述同樣的方法測定其在490 nm處的吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算多糖含量。

1.2.3多糖保留率的計算

式中：A0表示脫蛋白前樣品中多糖的質(zhì)量，μg；AI表示脫蛋白后樣品中多糖的質(zhì)量，μg。

1.2.4蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍法[13-14]。

考馬斯亮藍G-250溶液：稱取50mg考馬斯亮藍G-250，溶于25mL 95%的乙醇中，加入50mL 85%的磷酸，用蒸餾水定容至500mL。

標準蛋白溶液：稱取10mg牛血清蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，制得100μg/mL的標準蛋白溶液。蛋白質(zhì)標準曲線中標準濃度的配制見表1。

表1 蛋白質(zhì)標準曲線中標準濃度的配制Table1 Preparation of standard solution concentrationsat the protein standard curve

標準曲線的制作：按表1進行反應溶液的配制，加樣完成后，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置反應2min～5min后于1 h內(nèi)在595 nm波長下完成比色測定。以蛋白質(zhì)濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)標準曲線Fig.2 Thestandard curveof protein

1.2.5蛋白質(zhì)脫除率的計算

式中：B0表示脫蛋白前樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，μg；BI表示脫蛋白后樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，μg。

1.2.6綜合指標的計算

比較蛋白質(zhì)的脫除效果要綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率兩方面的結(jié)果，本試驗采取加權計算法，以綜合指標作為蛋白質(zhì)脫除效果的評價指標。

綜合指標=多糖保留率×50%+蛋白質(zhì)脫除率×50%

1.3除蛋白方法

1.3.1 Sevage試劑法除蛋白

蛋白質(zhì)在氯仿等有機溶劑中容易變性沉淀，釆用正丁醇∶三氯甲烷=1∶5（體積比）配制成Sevage試劑，取平菇粗多糖溶液25mL以體積比（多糖液：Sevage試劑）1∶4加入Sevage試劑，混合后放入搖床振搖20到30min，靜置分層，放出下層有機溶劑及交界處變性蛋白質(zhì)，反復進行至無蛋白層，得到脫蛋白上層液。脫蛋白過程中每進行1次吸取1mL上清液分別測多糖和蛋白含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.2鹽酸-乙醇等電點法[11]除蛋白

1.3.2.1溶液pH對蛋白質(zhì)脫除的影響

取15支10mL離心管，分別加入平菇多糖5mL，用0.1mol/LHCl將pH分別調(diào)成3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0，然后緩慢加入無水乙醇至乙醇終濃度為7%，邊加邊攪拌，混勻后置于4℃冰箱中靜置過夜，24 h后取出于離心機中3 000 r/min離心20min，取上清液測多糖及蛋白質(zhì)的含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.2.2乙醇濃度對蛋白質(zhì)脫除的影響

取24支10mL離心管，分別加入平菇粗多糖5mL，用0.1mol/LHCl將pH調(diào)成3.8，然后緩慢加入無水乙醇至乙醇終濃度分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%，邊加邊攪拌，混勻后置于4℃冰箱中靜置過夜，24 h后取出于離心機中3 000 r/min離心20min，取上清液測多糖及蛋白質(zhì)的含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.3三氯乙酸（TCA）法[15]除蛋白

1.3.3.1三氯乙酸（TCA）濃度的影響

取15支10mL離心管，分別加入平菇粗多糖溶液5mL，然后加入質(zhì)量分數(shù)為20%的三氯乙酸（TCA）至終濃度分別為5%、5.5%、6%、6.5%、7%，振蕩均勻后于50℃水浴40min，3 000 r/min離心10min除去沉淀，取上清液測多糖和蛋白含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.3.2三氯乙酸（TCA）處理時間的影響

取15支10mL離心管，分別加入平菇粗多糖溶液5mL，然后加入質(zhì)量分數(shù)為20%的三氯乙酸（TCA）至終濃度為6%，振蕩均勻后于50℃分別水浴20、30、40、50、60min，3 000 r/min離心10min除去沉淀，取上清液測多糖和蛋白含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.3.3三氯乙酸（TCA）處理溫度的影響

取15支10mL離心管，分別加入平菇粗多糖溶液5mL，然后加入質(zhì)量分數(shù)為20%的三氯乙酸（TCA）至終濃度為6%，振蕩均勻后分別于30、40、50、60、70℃水浴40min，3000 r/min離心10min除去沉淀，取上清液測多糖和蛋白含量，計算多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率。

1.3.4 3種方法的比較

按照蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率和綜合評價的綜合考慮，根據(jù)試驗結(jié)果將3種方法進行比較得出最合適的方法。

1.3.5應用Box-Behnken試驗設計分析TCA法除蛋白

在單因素試驗的基礎上，采用中心組合試驗Box-Behnken進行方案設計優(yōu)化脫蛋白工藝。選取TCA濃度、處理時間、處理溫度3個因素為自變量，分別以A、B、C表示，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平進行編碼，以綜合指標為響應值Y，因素編碼及水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素及水平表Table2 Factorsand levers in the Box-Behnken experim ental design

2結(jié)果與分析

2.1 Sevage試劑法對蛋白質(zhì)脫除及多糖保留的影響

采用Sevage法除蛋白，研究其對蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率以及綜合指標的影響，見圖3。

圖3 清除次數(shù)對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.3 Effectof elim inating tim eson theprotein rem oval rateand polysaccharide retention rate

蛋白質(zhì)脫除率隨著脫蛋白次數(shù)的增加而增加，用Sevage試劑處理1次，蛋白質(zhì)脫除率為88.73%，處理9次后，蛋白質(zhì)脫除率可達96.8%。而多糖保留率隨著清除次數(shù)的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢，Sevage試劑處理1次時，多糖保留率僅為26.22%，處理9次后，多糖保留率為13.05%。綜合指標變化幅度不大，在57%上下浮動。表明用Sevage試劑處理多次后，對蛋白質(zhì)的脫除效果明顯，但多糖損失嚴重，推測平菇多糖液中含有多糖與蛋白結(jié)合的復合物，Sevage試劑將復合物沉淀，造成多糖也被去除。因此，雖然蛋白質(zhì)脫除率很高，但多糖保留率偏低，故不選用此方法除蛋白。

2.2鹽酸-乙醇等電點法對蛋白質(zhì)脫除及多糖保留的影響

2.2.1溶液pH的影響

pH對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響見圖4。

圖4 pH對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.4 Effectof pH on theprotein rem oval rateand polysaccharide retention rate

圖4 結(jié)果表明，乙醇濃度為7%條件下，在pH 3～4之間，多糖保留率呈現(xiàn)上升的趨勢，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)的是下降的趨勢，在pH 3.8時多糖保留率達到最大，說明pH 3.8是一個臨界點，增大pH使多糖溶解；蛋白質(zhì)脫除率一直下降的原因可能是蛋白質(zhì)的等電點不在這個范圍內(nèi)。隨后研究顯示：pH 1～6范圍內(nèi)蛋白質(zhì)脫除率仍然呈現(xiàn)下降趨勢。從圖4看，綜合指標在pH 3.8時達最大值68.45%，此時蛋白質(zhì)脫除率為52.98%，多糖保留率為83.92%。

2.2.2溶液乙醇濃度的影響

在溶液pH 3.8條件下，設置乙醇濃度分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%，測定蛋白質(zhì)脫除率與多糖保留率。乙醇濃度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響見圖5。

圖5 乙醇濃度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.5 Effectof ethanolconcentration on the protein removal rate and polysaccharide retention rate

由圖5看出，蛋白質(zhì)脫除率隨著溶液中乙醇濃度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，多糖保留率在7%時達到最大值。繼續(xù)加大乙醇濃度，多糖保留率反而減小。估計由于乙醇濃度過大，可造成多糖沉淀。其綜合指標在7%時達最大值，為63.19%，此時蛋白質(zhì)脫除率為47.81%，多糖保留率為78.57%。

2.3三氯乙酸（TCA）法對蛋白質(zhì)脫除及多糖保留的影響

2.3.1溶液三氯乙酸（TCA）濃度的影響

在三氯乙酸（TCA）處理時間40min、三氯乙酸（TCA）處理溫度50℃條件下，設置溶液TCA濃度分別為5%、5.5%、6%、6.5%、7%，測定蛋白質(zhì)脫除率與多糖保留率。TCA濃度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響見圖6。

如圖6所示，隨著TCA濃度的增加，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加；但多糖保留率隨著TCA濃度的增加，呈現(xiàn)下降趨勢。估計TCA溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀時會吸附一定量的多糖，導致多糖含量下降[8]。從綜合指標來看，當TCA濃度為6%時達到最大值85.63%，此時蛋白質(zhì)脫除率為93.8%，多糖保留率為77.88%。

2.3.2三氯乙酸（TCA）處理時間的影響

圖6 TCA濃度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.6 Effectof TCA concentration on theprotein removal rateand polysaccharide retention rate

在溶液TCA濃度6%、三氯乙酸（TCA）處理溫度50℃條件下，設置三氯乙酸（TCA）處理時間分別為20、30、40、50、60min，測定蛋白質(zhì)脫除率與多糖保留率。TCA處理時間對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響見圖7。

圖7 TCA處理時間對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.7 Effectof TCA p rocessing timeon theprotein rem oval rate and polysaccharide retention rate

如圖7所示，隨著處理時間的增加，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，40min～50min后趨于平穩(wěn)。對于多糖保留率，則隨著時間的增加呈現(xiàn)下降趨勢，40min～50min后趨于平穩(wěn)。從綜合指標來看，當時間為40min時達到最大值83.31%，此時蛋白質(zhì)脫除率為83.7%，多糖保留率為82.92%。

2.3.3三氯乙酸（TCA）處理溫度的影響

在溶液TCA濃度6%、三氯乙酸（TCA）處理時間40min條件下，設置三氯乙酸（TCA）處理溫度分別為30、40、50、60、70℃，測定蛋白質(zhì)脫除率與多糖保留率。TCA處理溫度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響見圖8。

圖8 TCA處理溫度對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.8 Effectof TCA processing tem peratureon the protein rem oval rateand polysaccharide retention rate

如圖8所示，30℃～50℃時，溫度升高，蛋白質(zhì)脫除率呈現(xiàn)上升的趨勢，50℃時達到最大值；50℃以后，溫度升高，蛋白質(zhì)脫除率下降明顯。而多糖保留率在30℃～60℃時，溫度升高，總體呈現(xiàn)下降趨勢，60℃后反而上升。推測溫度升高至50℃以后，造成蛋白質(zhì)逐漸變性，一方面不利于其沉淀去除，另一方面使與蛋白質(zhì)結(jié)合的多糖分離析出，多糖保留率上升。從綜合指標來看，當溫度為50℃時達到最大值，為87.12%，此時蛋白質(zhì)脫除率為90.94%，多糖保留率為83.3%。

2.4 3種脫蛋白方法的比較

Sevage法是將平菇多糖溶液以體積比（多糖液：S evage試劑）1∶4加入Sevage試劑混合后震蕩搖勻，靜置分層后放出蛋白質(zhì)層及有機試劑，反復操作，得到脫蛋白液；鹽酸-乙醇等電點法是利用鹽酸將平菇多糖液調(diào)成一定pH，再加入乙醇至一定濃度，最后靜置離心得脫蛋白液；TCA法是在平菇多糖液中加入濃度為20%的TCA至一定濃度，混勻后水浴一段時間再離心得脫蛋白液。3種脫蛋白方法的綜合比較見圖9。

圖9 3種脫蛋白方法的綜合比較Fig.9 Com prehensive comparison of 3methodsof protein removal

由圖9可以看出，Sevage法和TCA法脫蛋白效果優(yōu)于鹽酸-乙醇等電點法，鹽酸-乙醇等電點法和TCA法的多糖保留率高于Sevage法。但3種方法綜合比較：Sevage法多糖保留率太低，而鹽酸-乙醇等電點法的蛋白質(zhì)脫除率偏低。故綜合考慮兩因素，TCA法比較合適。后期試驗采用TCA法優(yōu)化脫蛋白工藝。

2.5 Box-Behnken試驗優(yōu)化TCA法脫蛋白工藝

在2.3TCA法單因素試驗的基礎上，按照表2的Box-Behnken試驗設計方案（見1.4.4）進行三因素三水平試驗，結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table3 Box-Behnken experim entaldesignm atrix and experimental results

利用Design Expert8.05軟件對表3的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到綜合指標（Y）對自變量TCA濃度（A）、處理時間（B）、處理溫度（C）的二次多項回歸方程為：Y=-173.542 75+66.201 50A+1.254 78B+2.293 25C-0.091 500AB-0.014 000AC-0.001 650 0BC-5.617 00A2-0.010 043B2-0.022 417C2。此模型的方差分析見表4。

表4 綜合指標回歸方程模型方差分析及顯著性檢驗Table4 Varianceanalysisof the fitted regression equationmodel and significance testof comp rehensive index

續(xù)表4綜合指標回歸方程模型方差分析及顯著性檢驗Continue table4 Varianceanalysisof the fitted regression equationm odeland significance testof comprehensive index

由表4可知，模型P值為0.024 7，小于0.05，說明二次回歸模型是顯著的；擬合不足P值為0.069 0，差異不顯著，說明二次回歸模型能夠較好的反應響應值的變化，模型與實際試驗擬合程度較好。

TCA濃度（A）對綜合指標的影響達到極顯著水平（P＜0.01），處理時間（B）以及處理溫度的二次項（C2）對綜合指標的影響達到顯著水平（P＜0.05），各因素對綜合指標的影響順序是：A＞B＞C2＞A2＞C＞B2＞AB＞BC＞AC。即：TCA濃度對綜合指標影響最大，其次是處理時間。

根據(jù)回歸方程對以上3個因素繪制響應面圖及等高線圖，見圖10～圖12。

圖10 TCA濃度和處理時間對綜合指標影響的響應面圖和等高線圖Fig.10 Diagram sof responsesurfaceand contour lines for effecting of com prehensive index on TCA concentration and processing tim e

圖11 TCA濃度和處理溫度對綜合指標影響的響應面圖和等高線圖Fig.11 Diagramsof response surfaceand contour lines for effecting of com prehensive index on TCA concentration and processing tem perature

圖12 處理時間和處理溫度對綜合指標影響的響應面圖和等高線圖Fig.12 Diagramsof response surfaceand contour lines for effecting of comprehensive index on processing timeand p rocessing temperature

3個圖分別表示TCA濃度、處理時間、處理溫度3個因素中1個因素取零點時其余2個因素對綜合指標的影響。響應面坡度越陡峭，表明響應值對于操作條件的改變越敏感，該因素對綜合指標的影響越大；反之則表明因素對綜合指標的影響越小。在其他試驗因素固定不變的情況下，考察交互項對綜合指標的影響，響應面分析圖可用于評價試驗因素對綜合指標影響的兩兩交互作用。由圖10～圖12可知，3個響應面均為開口向下的凸形曲面，說明響應值（綜合指標）存在極高值且TCA濃度、處理時間和處理溫度3個因素之間兩兩交互作用均不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。3個響應曲面的等高線中心均位于-1～1之間，說明最優(yōu)條件存在于所設計的因素水平范圍之內(nèi)。對回歸方程求解得到對綜合指標的最優(yōu)條件為：TCA濃度5.6%，處理時間33min，處理溫度48℃，綜合指標86.66%。

為驗證響應面法所得模型的準確性，取TCA濃度5.6%，處理時間33min，處理溫度48℃，對模型進行檢驗，共進行3次平行驗證試驗，3次平行試驗的綜合指標分別為84.64%、84.49%、82.76%，平均值為83.96%（蛋白質(zhì)脫除率為89.5%，多糖保留率為78.4%），與理論預測值相比相對誤差為3.11%，可見該模型能較好地模擬和預測蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的綜合指標。

3討論

本文對Sevage法、TCA法和鹽酸-乙醇等電點法去除平菇多糖中蛋白質(zhì)進行了分析比較。Sevage法是利用蛋白質(zhì)易在有機溶劑中變性沉淀原理去除蛋白。試驗結(jié)果顯示：用Sevage試劑處理1次，蛋白質(zhì)脫除率為88.73%，多糖保留率僅為26.22%；處理9次后，蛋白質(zhì)脫除率可達96.8%，而多糖保留率為13.05%。Sevage法在除蛋白過程中，隨著大部分蛋白質(zhì)去除，多糖損失量也在加大。王金璽[16]在分離平菇多糖中的蛋白質(zhì)時，運用Sevage法除蛋白發(fā)現(xiàn)在脫蛋白次數(shù)達到7次時，蛋白質(zhì)脫除率已達95%，但平菇多糖已損失一半以上，與本研究的結(jié)果一致。

鹽酸-乙醇等電點法中鹽酸和乙醇都是極性分子，能破壞蛋白質(zhì)親水膠體顆粒使之聚沉；其中乙醇溶劑可增大體系極性，有助于蛋白質(zhì)分子之間的相互結(jié)合而形成沉淀。本試驗結(jié)果表明：脫除蛋白的最佳條件為乙醇濃度7%，pH 3.8，此時蛋白質(zhì)脫除率為52.98%，多糖保留率為83.92%。尹麗敏等[17]利用鹽酸-乙醇等電點法除去油茶籽多糖中的蛋白質(zhì)時，獲得最佳工藝條件為pH 3.4，乙醇添加量13%，靜置時間3天，此時蛋白質(zhì)脫除率為92.68%，多糖保留率為61.78%。運用鹽酸-乙醇等電點法去除平菇多糖蛋白鮮見報道。從本試驗的結(jié)果看，雖然多糖損失較少，但脫蛋白效果不太理想。與尹麗敏等人的研究有較大差異，推測試驗材料不同，多糖和蛋白質(zhì)特性存在差異，導致脫蛋白效率不一致。

三氯乙酸（TCA）法利用酸性條件下三氯乙酸與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，且TCA作為蛋白質(zhì)變性劑能使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團，使之聚集沉淀。從本試驗的結(jié)果看，TCA法蛋白脫除率與三氯乙酸含量呈正相關，但多糖保留率隨著TCA量的加大逐漸減小。鄧啟[18]利用TCA法去除黑木耳多糖中的蛋白質(zhì)時發(fā)現(xiàn)隨著三氯乙酸含量的增加，蛋白質(zhì)脫除率在增加，但是多糖的保留率卻在下降。TCA濃度為5%時，蛋白質(zhì)脫除率為76.9%，多糖保留率為56.4%；TCA為9%時，蛋白質(zhì)脫除率為82.2%，多糖保留率為41.9%。估計黑木耳中蛋白質(zhì)與多糖連接緊密，多糖隨蛋白質(zhì)一起聚集沉淀，因此與本研究結(jié)果存在差異。本試驗從三氯乙酸濃度、三氯乙酸處理時間和處理溫度著手，運用Box-Behnken試驗優(yōu)化TCA法脫蛋白工藝，經(jīng)響應面分析得到最佳工藝條件為三氯乙酸終濃度5.6%，處理時間33min，處理溫度48℃，其綜合評價均值為83.96%，蛋白質(zhì)脫除率為89.5%，多糖保留率為78.4%，蛋白質(zhì)脫除與多糖保留的效果優(yōu)于Sevage法和鹽酸-乙醇等電點法。

4結(jié)論

本試驗分別采用Sevage法、鹽酸-乙醇等電點法和TCA法脫除平菇多糖中的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，3種脫蛋白方法對平菇多糖中的蛋白質(zhì)均有不同程度的脫除作用，Sevage法和TCA法最為顯著，Sevage法處理9次后，蛋白質(zhì)脫除率可達96.8%，但多糖保留率僅為13.05%。鹽酸-乙醇等電點法雖多糖保留率較高，為83.92%，但蛋白質(zhì)脫除率偏低，為52.98%。因此，綜合考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率兩因素，得出最理想的脫蛋白方法為TCA法，運用響應面分析獲得最佳脫蛋白方案為TCA濃度5.6%，處理時間33min，處理溫度48℃，此時的綜合指標均值為83.96%，蛋白質(zhì)脫除率為89.5%，多糖保留率為78.4%。

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Com parison of M ethods for Rem oving Protein from Polysaccharide of Pleurotus ostreatus

WANGXin-jia，LEIGuo-feng，ZHAIZhi-jun，WUXiao-yu*
（Collegeof Bioscienceand Bioengineering，JiangxiAgriculturalUniversity/Nanchang Key Laboratory for Fermentation Application Technology，Nanchang330045，Jiangxi，China）

The effectsofprotein removal from polysaccharide of Pleurotusostreatus were analyzed by comparing the threemethods of Sevage，hydrochloric acid-ethanol isoelectric point and TCA with protein removal rate，polysaccharide retention rate and comprehensive index as evaluation index.The result showed that protein removal rate ofpolysaccharide by themethod of Sevagewas the highest，and followed by themethod of TCA.The bestway for polysaccharide retention rate was themethod of hydrochloric acid-ethanol isoelectric point，and secondwas TCA.And in consequence the TCAmethod was themosteffective one among the threewaysby considering the two factors of protein removal rate and polysaccharide retention rate.A regression equation of the protein removal from polysaccharide of Pleurotus ostreatus by the way of TCA was obtained using the Box-Behnken test design，and then the optimal conditions of the process for protein removalwas established by response surface analysis，whichwas TCA concentration 5.6%，processing time 33min，and temperature 48℃. Under these conditions，the average of comprehensive evaluation was 83.96%，the protein removal rate and polysaccharides retention ratewas89.5%and 78.4%，respectively.

Pleurotusostreatus；polysaccharide；removalofprotein；responsesurfaceanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.024

2016-06-23

農(nóng)產(chǎn)品加工省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金項目（粵農(nóng)科蠶[2012]9號）

王新嘉（1991—），男（漢），碩士研究生，主要從事微生物資源開發(fā)利用研究。

*通信作者：吳曉玉，教授，博士。