響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取廢棄煙葉中蘆丁的研究

李海洋，李瑩，李榮華，呂永華，夏巖石，李鐘，郭培國，*

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省煙草專賣局，廣東廣州510610；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取廢棄煙葉中蘆丁的研究

李海洋1，李瑩1，李榮華1，呂永華2，夏巖石1，李鐘3，郭培國1，*

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣東省煙草專賣局，廣東廣州510610；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

以煙草廢棄煙葉作材料，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取提取溫度、超聲時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為優(yōu)化因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對廢棄煙葉中蘆丁的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明蘆丁提取的最佳工藝參數(shù)為：提取溫度57.5℃、超聲時間20.3min和乙醇體積分?jǐn)?shù)32.6%，提取率為13.7mg/g，與理論預(yù)測值的相對誤差為1.0%，說明響應(yīng)面法可以很好地優(yōu)化廢棄煙葉中蘆丁的提取工藝。這一結(jié)果可為煙草廢棄物的綜合利用提供參考。

響應(yīng)面法；廢棄煙葉；蘆??；提取

蘆丁（又稱蕓香苷）屬于多羥基黃酮類化合物，是一種天然抗氧化劑[1]，具有抗菌、消炎、抗氧化等多種藥理活性，在臨床上主要用于治療高血壓、心血管疾病、胃病、皮膚病、痛風(fēng)等多種疾病[2]，現(xiàn)已廣泛用于醫(yī)藥、保健食品和化妝品等行業(yè)。蘆丁廣泛存在于植物中，提取方法主要有堿提取酸沉淀法、熱水提冷析出法、大孔樹脂分離法、超聲輻射法、乙醇浸提法等[3-6]，但多存在提取效率低、成本高、工藝流程長、提取蘆丁的純度差等不足[7]。近年來的研究表明超聲波輔助提取蘆丁的效果較好，提取率高且需時較少[8-9]。蕓香科的蕓香草、豆科的槐米和蓼科的苦蕎等是目前國內(nèi)蘆丁提取的主要原料[7，10-11]，但這些植物原料資源緊缺，難以滿足市場的需求。

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國和消費(fèi)國[12]，在煙草收獲和生產(chǎn)過程中存在大量的低次煙葉、煙筋、煙莖和煙花等煙草廢棄物[13]，大多被作為垃圾隨地焚燒處理，造成了嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染。然而，煙草廢棄物卻是具有很高潛在價值的資源，含有多種活性成分，可用于煙草的綜合開發(fā)利用[14]。現(xiàn)階段，對煙草廢棄物中的煙堿、茄尼醇、蛋白質(zhì)等活性成分綜合利用的研究較多[15-16]，鮮見有對約占煙草干重1%蘆丁的開發(fā)利用報道[17-18]。因此，從煙草廢棄物中提取蘆丁，不僅可減少環(huán)境污染，還能為保健、醫(yī)藥和化工等行業(yè)提供原料，實現(xiàn)煙草的綜合利用。

本研究利用廢棄煙葉作原料，采用超聲波輔助提取法，通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化，考察煙草蘆丁提取的因素，確定煙草蘆丁提取的最佳工藝，為煙草廢棄物的綜合利用提供參考。

1材料和方法

1.1材料

供試材料為煙草品種K326調(diào)制后的廢次煙葉，購自于廣東省南雄市湖口鎮(zhèn)煙草收購站，干燥粉粹后過20～80目篩，密封保存。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯化鋁、醋酸鈉、石油醚、冰乙酸、無水乙醇等均為分析純：廣州化學(xué)試劑廠。

SB25-12DT超聲清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-2000紫外分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量120℃干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 5 g，60%乙醇溶解，搖勻，定容至100mL，制成濃度為0.105mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取蘆丁標(biāo)樣0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于6個干凈的10mL容量瓶中，分別加入1mL 0.1mol/L三氯化鋁和1.5mL 0.2mol/L醋酸鈉-醋酸緩沖液（pH=5.2），搖勻，靜置10min，定容，以0號為空白對照，在420 nm波長處測定0～5號標(biāo)樣的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

1.2.2提取方法

精密稱取廢棄煙葉干燥粉末1 g，置于50mL錐形瓶中，按設(shè)定的提取條件（提取溫度、提取次數(shù)、超聲時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行提取，并抽濾得到提取液，測得蘆丁的提取量。

1.2.3單因素試驗

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curveof rutin

分別以超聲時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)為影響因子，探討其對蘆丁提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化廢棄煙葉中蘆丁超聲波輔助提取條件

為了選擇最優(yōu)提取條件，依據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定提取3次，料液比1∶3（g/mL），根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理[19-20]，選擇超聲時間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素進(jìn)行三個水平的中心組合試驗如表1，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析以得到蘆丁提取的最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table1 Factor levelof responsesurface

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響

在固定料液比1∶30（g/mL）、超聲時間15min、提取溫度50℃、提取次數(shù)3次的條件下，不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響如表2。由表2可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～40%時，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蘆丁提取率增加，在40%時達(dá)到最大，能溶于乙醇中的蘆丁含量也達(dá)到最大。而40%之后提取率呈逐漸下降趨勢，當(dāng)濃度增大時，乙醇揮發(fā)增多，一些脂溶性物質(zhì)溶出影響了蘆丁的提取，致使蘆丁提取量出現(xiàn)了下降的趨勢。所以，選擇最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.1.2料液比對蘆丁提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時間15min、提取溫度50℃、提取次數(shù)3次的條件下，分別考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）對蘆丁提取率的影響，結(jié)果如表2所示。由表2中可以看出蘆丁得率隨溶劑的增加而增加，這是因為溶劑和蘆丁的接觸面積增大從而使蘆丁更易溶出；但當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）之后，隨料液比繼續(xù)增加而趨于穩(wěn)定。因此從節(jié)約成本的角度考慮，本試驗確定料液比1∶30（g/mL）。

表2 單因素試驗結(jié)果Table2 Resultsof the singer factor experiment

2.1.3超聲時間對蘆丁提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取溫度50℃、提取次數(shù)3次、料液比1∶30（g/mL）的條件下，不同超聲時間對蘆丁提取率的影響如表2。由表2可知，蘆丁提取率在15min前隨著時間的增加而增加，之后隨著時間的增加蘆丁得率反而下降。這可能是因為細(xì)胞遭到破壞而使蘆丁的溶出率增加，但隨著時間的增加，超聲波對細(xì)胞的破碎作用進(jìn)一步增大，原料中其它醇溶性物質(zhì)的被溶解提出，使蘆丁提取率下降。因此本試驗固定超聲時間15min。

2.1.4提取溫度對蘆丁提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時間15min、提取次數(shù)3次，料液比1∶30（g/mL）的條件下，不同提取溫度對蘆丁提取率的影響如表2。由表2可知，隨溫度的升高，蘆丁提取率也增加，當(dāng)達(dá)到50℃時蘆丁的得率達(dá)到最大，之后隨著溫度的增加，蘆丁提取率反而有所下降。這種現(xiàn)象是因為高溫使蘆丁的結(jié)構(gòu)遭到破壞，故提取溫度以50℃為宜。

2.1.5提取次數(shù)對蘆丁提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時間15min、提取溫度50℃、料液比1∶30（g/mL）的條件下，考察不同提取次數(shù)對蘆丁提取率的影響，結(jié)果如表2。由表2可知，隨著提取次數(shù)的增加，蘆丁的提取率有不斷增加的趨勢，提取次數(shù)為4次，得率有所下降，結(jié)合得率和效益，已選擇提取3次為宜。

2.2響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1回歸模型的建立與分析

用Design-Expert8.0軟件隨機(jī)產(chǎn)生BOX-Behnken Design試驗方案，對考察因素和其水平進(jìn)行設(shè)計，并測得17次的試驗結(jié)果，并進(jìn)行多元二次擬合，以蘆丁提取液濃度為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為：Y=-22.692 5+ 0.513 7A+0.939 0B+0.374 7C-1.223 5×10-3AB+ 8.205×10-4AC-2.356×10-3BC-0.014 45A2-7.482 9× 10-3B2-3.839 4×10-3C2式中的超聲時間A、提取溫度B和乙醇體積分?jǐn)?shù)C在設(shè)計中均經(jīng)量綱線性編碼處理，因此方程中各項系數(shù)絕對值的大小直接反映了各因素對指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。對回歸方程方差分析（表3），模型極顯著，失擬不顯著，R2=0.962 4，RAdj2=0.914 14擬合較好。其中一次項A顯著（P＜0.05），B和C極顯著（P＜0.01），二次項B2顯著（P＜0.05），A2C2極顯著（P＜0.01）說明超聲時間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取影響明顯。兩兩項AB和AC不顯著（P＞0.05），BC顯著（P＜0.05），說明三因素兩兩之間交互作用中只有提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響達(dá)到顯著水平。

表3 回歸方程模型方差分析Table3 Varianceanalysis for theestablished regressionmodel

2.2.2蘆丁提取工藝響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，作出響應(yīng)面圖和等高線圖，考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，從中分析超聲時間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響，如圖2～圖4所示。3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值存在極高值。3個圖中的等高線中心均位于編碼值區(qū)域內(nèi)，說明提取的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi)。等高線的形狀可直觀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用較強(qiáng)，而圓形則與之相反。從圖2可以看出提取溫度的曲面比超聲時間的曲面陡，等高線沿提取溫度比軸向比超聲時間密集，說明超聲時間對蘆丁提取率的影響比提取溫度大；等高線為橢圓形，說明提取溫度和超聲時間也有交互作用，但對蘆丁提取率的影響還沒有達(dá)到顯著水平。

圖2 超聲時間與提取溫度交互作用影響蘆丁提取率的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.2 Contour（A）and response surfacegraph（B）for theeffects of variableson the lutin yield versusultrasonic timeand extraction tem perature

圖3 超聲時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用影響蘆丁提取率的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.3 Contour（A）and response surfacegraph（B）for theeffects of variableson the lutin yield versusultrasonic timeand ethanol volume ratio

圖4 提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用影響蘆丁提取率的等高線圖（A）和響應(yīng)面圖（B）Fig.4 Contour（A）and response surfacegraph（B）theeffectsof variableson the lutin yield versusextraction tem peratureand ethanolvolume ratio

從圖3可以看出乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面較陡，超聲時間的曲面較平緩，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響顯著；等高線沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向較超聲時間軸向密集，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率的影響比提取時間大，等高線為圓形，說明兩因素的交互作用較弱，對蘆丁提取率的影響不顯著。

從圖4可以看出，提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面都較陡，說明提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)都對蘆丁提取率顯著；等高線沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向較提取溫度軸向密集，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對蘆丁提取率影響比提取溫度大，等高線為橢圓形，說明兩因素的交互作用較強(qiáng)，對蘆丁提取率的影響達(dá)到顯著水平。

2.3廢棄煙葉中蘆丁最佳提取條件的確定和驗證試驗

綜上所述，可以得出影響蘆丁提取率的因素由強(qiáng)到弱依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲時間。根據(jù)回歸模型通過Design－Expert軟件分析得出，廢棄煙葉中蘆丁最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)32.6%、提取溫度為57.5℃、超聲時間為20.3min。為了方便試驗操作取乙醇體積分?jǐn)?shù)33%、提取溫度為57℃、超聲時間為20min，進(jìn)行6次驗證試驗，得到蘆丁提取率為13.7mg/g（RSD=0.47%），與預(yù)測值13.8mg/g的相對誤差為1.0%，預(yù)測值與試驗值相吻合，說明該優(yōu)化方法可行。

3結(jié)論

近幾年，人們開始采用超聲波技術(shù)提取植物中有效成分，超聲波的空化效應(yīng)擊破植物細(xì)胞膜，增加溶劑向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散和有效成分溶出，從而提高提取效率、縮短提取時間，且對提取物質(zhì)不產(chǎn)生破壞作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。而傳統(tǒng)的提取方法提取含量低，時間長等缺點。因此，本試驗將超聲波法應(yīng)用到廢棄煙葉中提取蘆丁，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法研究幾種因素間交互作用，優(yōu)化廢棄煙葉中蘆丁超聲波提取工藝參數(shù)，得到精度高的的回歸方程，準(zhǔn)確找到提取因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值：乙醇體積分?jǐn)?shù)32.6%、提取溫度57.5℃、超聲時間為20.3min。優(yōu)化后的提取工藝，可以為煙草的綜合利用提供參考。

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Study on Optim ization of Ultrasound-assisted Extraction Technology of Rutin from W aste Tobacco Leaves by Response Surface M ethodology

LIHai-yang1，LIYing1，LIRong-hua1，LüYong-hua2，XIA Yan-shi1，LIZhong3，GUOPei-guo1，*
（1.College of Life Sciences，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.Guangdong TobaccoMonopoly Administration，Guangzhou 510610，Guangdong，China；3.Collegeof TraditionalChinese Medicine，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Based on single factor experiments for extraction temperature，ultrasonic time and volume ratio of ethanol，the optimum extraction techniquesof rutin from waste leaveswasperformed through the analysisof response surfacemethod（RSM）which was designed by Box-Behnken Design（BBD）.The experimental results showed that the optimum extraction parameterswere as follows：extraction temperature at 57.5℃，ultrasonic time for 20.3min and 32.6%ofethanol volume ratio.The average extraction yield of rutin was 13.7mg/gwith 1.0%of the relative error comparing with the theoretical value，demonstrating that response surfacemethod could effectively optimize the extraction processof rutin from waste tobacco leaves.This resultcould provide references for the comprehensiveutilization of tobaccowaste.

responsesurfacemethodology；waste tobacco leaves；rutin；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.018

2016-11-12

廣東省煙草專賣局（公司）科技計劃項目（201310）

李海洋（1992—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：煙草生物學(xué)。

*通信作者