超聲波輔助提取蠶蛹多糖工藝的優(yōu)化

吳海燕，袁秋梅

（1.南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇南通226007；2.南通市農(nóng)副產(chǎn)品加工技術(shù)協(xié)會(huì)，江蘇南通226000）

超聲波輔助提取蠶蛹多糖工藝的優(yōu)化

吳海燕1，2，袁秋梅1

（1.南通科技職業(yè)學(xué)院，江蘇南通226007；2.南通市農(nóng)副產(chǎn)品加工技術(shù)協(xié)會(huì)，江蘇南通226000）

以脫脂蠶蛹粉為原料，通過(guò)超聲波輔助提取，對(duì)蠶蛹多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。以超聲波提取時(shí)間、料液比、超聲波功率為影響因素，考察對(duì)蠶蛹多糖的提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法對(duì)超聲波輔助提取蠶蛹多糖的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波輔助提取脫脂蠶蛹多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶30（g/mL），功率550W，提取時(shí)間65min。在此條件下，提取蠶蛹多糖率達(dá)到94.36%。

蠶蛹多糖；超聲波提??；多糖提取率；響應(yīng)面分析；優(yōu)化

蠶蛹是藥食同源的昆蟲(chóng)性資源，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，《本草綱目》、《齊民要術(shù)》對(duì)其藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均有記載。蠶蛹也是人類的一種新?tīng)I(yíng)養(yǎng)源，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“作為普通食品管理的食品新資源名單”中唯一的昆蟲(chóng)類食品。蠶蛹多糖是蠶蛹中的重要活性成分之一[1-3]，近年來(lái)研究的表明[4-7]，蠶蛹多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)特異性免疫和非特異性免疫功能的作用，具有較好的醫(yī)藥和食品開(kāi)發(fā)潛力。我國(guó)是蠶桑大國(guó)，蠶蛹資源豐富，但大部分是用作飼料和肥料，其資源利用率和附加值低，研究蠶蛹多糖的提取工藝，對(duì)蠶蛹的綜合利用，提高附加值；開(kāi)發(fā)具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的功能產(chǎn)品具有實(shí)現(xiàn)意義。

超聲波提取法利用超聲波的熱效應(yīng)、空化作用和機(jī)械效應(yīng)來(lái)加快胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解[8]。近年來(lái)，由于超聲波提取具有提取率高、操作方便、提取速度快、活性成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物等天然原料中有效成分的提取，其中采用超聲波輔助提取各種動(dòng)植物中多糖技術(shù)取得了較好成果[9-13]。利用超聲波輔助提取蠶蛹多糖，研究提取時(shí)間、超聲功率、料液比等因素對(duì)蠶蛹多糖提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)SAS（statistical analysis system）軟件中Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-15]，利用響應(yīng)面分析法（response surface analysis，RSA）對(duì)蠶蛹多糖超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為蠶蛹多糖的綜合開(kāi)發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

脫脂蠶蛹粉：南通福爾生物制品有限公司提供；葡萄糖、重蒸苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京通用普析儀器公司；DZF-6020真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VCX 750sonics超聲提取儀：美國(guó)SONICS& MATERIALS公司。

1.2方法

1.2.1蠶蛹多糖的提取

準(zhǔn)確稱取5 g脫脂蠶蛹粉至于錐形瓶中，加入一定量的蒸餾水，置于超聲波提取儀中，一定功率下提取多糖，過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至一定體積，加入4倍95%乙醇，低溫（4℃）靜置過(guò)夜；醇沉液離心分離（4 000 r/min）10min，沉淀干燥至恒重得蠶蛹粗多糖。

1.2.2蠶蛹多糖含量的測(cè)定

苯酚硫酸法是測(cè)定多糖的常用方法[17-18]，多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水生成糠醛衍生物隨后與苯酚結(jié)合生成有色化合物。

根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]，導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定多糖，能夠避免雜質(zhì)的干擾，可以不進(jìn)行脫色處理，直接對(duì)多糖含量進(jìn)行定量。采用苯酚-硫酸法導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定多糖，糖-硫酸-苯酚形成的有色物質(zhì)的一階導(dǎo)數(shù)光譜在425 nm～525nm間波峰與波谷間距值的定量效果最佳。

精密量取0.1 mg/mL葡萄糖溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80mL，分別置于10mL干燥比色管中，加蒸餾水至體積為1.00mL，加入一定濃度的精制苯酚溶液0.50mL，混勻，迅速加入濃H2SO4，放置水浴鍋中，一定溫度保持一定時(shí)間后，迅速冷卻至室溫。在425 nm～525 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，用TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描葡萄糖的零階吸收光譜，利用uvwin5.0軟件記錄葡萄糖一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜。以一階導(dǎo)數(shù)光譜中波峰與波谷間距對(duì)葡萄糖含量進(jìn)行直線回歸[21]。

將5 g待測(cè)樣品定容到250mL，取10mL提取液定容到100mL待測(cè)定，精密吸取待測(cè)液1.00mL置于干燥比色管中，按上述方法繪制零階和一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜。將一階導(dǎo)數(shù)光譜中波峰與波谷間距值代入直線回歸曲線，可以求得樣品的多糖含量。

1.2.3蠶蛹多糖提取率的測(cè)定

式中：M1為提取的多糖質(zhì)量，mg；M為原料中多糖質(zhì)量，mg。

2結(jié)果與分析

2.1多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜在425 nm～525 nm間的波峰一波谷間距為縱坐標(biāo)，以葡萄糖的量為橫坐標(biāo)求得標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）?；貧w方程為：y=0.582 1x+0.001 4，相關(guān)系數(shù)為0.998 2。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在1.81μg/mL～14.55μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。測(cè)得脫脂蠶蛹原料中多糖含量為2.98 g/100 g。

圖1 葡萄糖的一階導(dǎo)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Thestandard curveof first-order derivativeofglucose

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g脫脂蠶蛹粉于三角瓶中，加入100mL蒸餾水，于超聲波提取儀中，料液比1∶20（g/mL），功率500W，不同時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effectof timeon theextraction percentageof polysaccharide

由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蠶蛹多糖提取率不斷提高；但是提取時(shí)間到達(dá)60min后提取率的變化趨勢(shì)變小，多糖提取基本完成，從實(shí)際生產(chǎn)的角度，超聲波適宜的提取時(shí)間為60min。

2.2.2料液比因素對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5 g脫脂蠶蛹粉于三角瓶中，加入一定量的蒸餾水，于超聲波提取儀中，時(shí)間60min，功率500W，不同料液比對(duì)多糖提取率的影響如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effectof ratio ofwater to raw materialon theextraction percentageof polysaccharide

由圖3可知，料液比在1∶30（g/mL）之前，多糖的提取率隨著溶劑體積增大而增大，溶劑體積小時(shí)，物料的黏度大，擴(kuò)散速度慢，阻礙了多糖的提取；當(dāng)料液比達(dá)到1∶35（g/mL）時(shí)，提取率開(kāi)始下降，可能是由于提取體系中總體積的增大，增加處理量及能量吸收，在一定的超聲功率和時(shí)間下導(dǎo)致超聲波提取效果減弱，因此，料液比選擇1∶30（g/mL）為佳。

2.2.3超聲功率對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取5g脫脂蠶蛹粉于三角瓶中，加入150mL蒸餾水，于超聲波提取儀中，時(shí)間60 min，料液比1∶30（g/mL），不同超聲波功率對(duì)多糖提取率的影響如圖4所示。

圖4 功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effectof power on theextraction percentageof polysaccharide

由圖4顯示，隨著超聲波功率的增加，多糖提取率呈上升趨勢(shì)。增大輸出功率可加快水的循環(huán)速度，強(qiáng)化傳質(zhì)，同時(shí)使細(xì)胞的破碎程度增加，有利于多糖的提取。當(dāng)超聲功率達(dá)到500W時(shí)，多糖已基本從原料中溶出，進(jìn)一步提高功率，多糖提取率變化不明顯，因此，超聲波提取功率在500W為宜。

2.2.4超聲波提取蠶蛹多糖過(guò)程的優(yōu)化

利用響應(yīng)面分析[13-14]對(duì)三因素工藝優(yōu)化作進(jìn)一步的分析。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，在中心值重復(fù)3次試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

由表3可見(jiàn)，三因素對(duì)多糖提取率的影響并非簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系，而是呈二次拋物線關(guān)系。一次項(xiàng)X1、X3、交叉乘積項(xiàng)X2X3、X3X3對(duì)多糖的提取率有影響，交叉乘積項(xiàng)X1X1、X2X2對(duì)多糖提取率顯著影響。各因素經(jīng)回歸擬合后，得回歸方程：

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平Table1 Levels form ain factors in the Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)安排、結(jié)果Table2 Experimentaldesign and resultsof Box-Behnken designs

表3 多糖提取率的回歸分析表Table3 Resultsof regression analysis

模型可信度分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 模型的可信度分析的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果Table4 Fit statistics for Y

復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方為95.41%，說(shuō)明由這3個(gè)因素及其二次項(xiàng)能解釋Y變化的95.41%，模型誤差的平方根1.132，模型擬合程度較好。

對(duì)多糖提取率的響應(yīng)因子水平的優(yōu)化見(jiàn)圖5、圖6、圖7。

圖5 X1、X2的響應(yīng)面立體圖和等高圖Fig.5 Surfacep lotsand contour op tim izer of X1，X2

利用SAS分析可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)（X 1，X 2，X 3）為（0.5，0，0.5），提取率的最大值為94.30%。根據(jù)因素水平，考慮到實(shí)際操作，將時(shí)間取65min，料液比取1∶30（g/mL），功率取550W，得到5 g蠶蛹樣品中含糖量為140.6mg，提取率為94.36%，證實(shí)了回歸方程對(duì)蠶蛹多糖提取優(yōu)化過(guò)程提供了可靠的模型。

圖6 X1、X3的響應(yīng)面立體圖和等高圖Fig.6 Surface plotsand contour optim izer of X1，X3

圖7 X2、X3的響應(yīng)面立體圖和等高圖Fig.7 Surface plotsand contour optim izer of X2，X3

3結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲輔助提取蠶蛹多糖，利用二水平試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示超聲輔助提取蠶蛹多糖的最佳工藝條件為：料液比1∶30（g/mL），功率550W，提取時(shí)間65min，在此條件下，提取蠶蛹多糖率達(dá)到94.36%。該方法縮短提取時(shí)間、對(duì)環(huán)境無(wú)污染，是適合蠶蛹多糖提取的工藝。

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Optim ization of Ultrasonic Extraction of Polysaccharides in De-fatted Silkworm Pupa Powder

WUHai-yan1，2，YUANQiu-mei1
（1.Nantong CollegeofScienceand Technology，Nantong226007，Jiangsu，China2.Nantong Agricultural ProductProcessing Technology Association，Nantong226000，Jiangsu，China）

The extraction technology of polysaccharides from de-fatted silkworm pupa powderwas studied by ultrasonic extractionmethod.The effectsof the extraction percentage of polysaccharide such as time，materialliquid ratio，powerwere studied.The threeextracting factors（time，material-liquid ratio，power）were studied.The optimum conditionwassystematically studied with single factor experimentsand Box-Behnken designs. The resultsshowed that theoptimum conditionswere as follows：extracting time of65min，material-liquid ratio of1∶30 g/mL，extracting powerof550W.In this condition，the extraction percentage of polysaccharides from silkworm pupawas94.36%.This technology issuitable forextraction ofpolysaccharides from silkworm pupa.

polysaccharidesofsilkworm pupa；ultrasonicextraction；theextraction percentageofpolysaccharide；responsesurfaceanalysis；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.013

2016-06-23

南通市農(nóng)村科技創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（HL2012025）；江蘇省教育廳“青藍(lán)工程”項(xiàng)目（201423）

吳海燕（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品綜合利用及食品營(yíng)養(yǎng)安全檢測(cè)。