金銀花、銀杏葉總黃酮協(xié)同清除DPPH自由基作用研究

石艷賓

（天津天獅學(xué)院，天津301700）

金銀花、銀杏葉總黃酮協(xié)同清除DPPH自由基作用研究

石艷賓

（天津天獅學(xué)院，天津301700）

采用超聲輔助法提取金銀花、銀杏葉總黃酮，以DPPH自由基清除能力為評價指標，分析兩種黃酮提取物的協(xié)同抗氧化性。試驗結(jié)果表明，金銀花、銀杏葉總黃酮對DPPH自由基具有明顯的清除作用，且半數(shù)清除率（IC50）分別為58.14μg/mL和61.32μg/mL。由Isobologram分析得到兩種物質(zhì)復(fù)配后的效應(yīng)點均在相加線和95%置信區(qū)的左側(cè)，試驗IC50mix與理論IC50add存在顯著性差異，相互作用指數(shù)（γ）均小于1，表明二者復(fù)配可以增強清除DPPH自由基效果。金銀花總黃酮與銀杏葉總黃酮復(fù)配比（以下所有復(fù)配比均指質(zhì)量比）為1∶9時，γ為0.71，協(xié)同清除DPPH自由基的相互作用效果最好。

金銀花；銀杏葉；總黃酮；DPPH；協(xié)同抗氧化

黃酮類化合物是一種天然抗氧化劑，金銀花總黃酮、銀杏葉總黃酮能有效消除自由基，保護機體不受損傷。大多數(shù)黃酮類化合物與糖結(jié)合形成苷類存在于植物體內(nèi)，少部分則以游離的苷元形式存在，具有抗炎癥、解熱、抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗氧化等生物活性[1]。金銀花甘寒清熱而不傷胃，臨床用于熱血毒痢、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等[2-3]。銀杏葉具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、抗炎、抗氧化等方面的作用[4-5]，與黃芪復(fù)方提取物具有明顯增強機體免疫和細胞免疫的作用[6]。目前，對金銀花總黃酮、銀杏葉總黃酮單獨的抗氧性研究較多，而對二者協(xié)同抗氧化性能研究的較少。本試驗采用超聲輔助法提取金銀花、銀杏葉總黃酮，采用DPPH試驗法測定金銀花、銀杏葉總黃酮的自由基清除能力，研究二者之間是否存在協(xié)同增效作用，為尋找高效復(fù)合型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

金銀花、銀杏葉：采購于藥店，粉碎過100目篩冷藏備用；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：sigma公司；蘆丁標準品：合肥博美生物技術(shù)有限公司；抗壞血酸、無水乙醇、無水甲醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（分析純）：天津江天化工技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SB-300DTD粉碎機：上海永久中藥機械制造有限公司；BSA 124S精密電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；UV1000紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司；TG16KR高速離心機：長沙東旺試驗儀器有限公司；SB3200DTDN超聲波清洗機：新芝生物科技股份有限公司；ME204分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.3方法

1.3.1總黃酮的提取

分別準確稱取5 g已處理好的金銀花和銀杏葉樣品，置于250 mL錐形瓶中，在錐形瓶中加入125mL 70%乙醇溶液。將樣品和乙醇溶液混合均勻，放置在超聲波處理器中，在60℃、功率450W條件下，超聲浸提30min，冷卻至室溫。在3500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，得總黃酮提取液，至棕色廣口瓶內(nèi)，并保存于4℃冰箱中貯藏待用[4]。

1.3.2總黃酮含量的測定

精密移取0.410mg/mL蘆丁標準溶液0、1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL棕色容量瓶中，加入1mL質(zhì)量濃度為5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置反應(yīng)6min；加入1mL濃度為10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置反應(yīng)6min；加入4mL濃度為1mol/L氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容至25mL，振蕩搖勻，并放置10min，待測[4]。以試劑空白為參比，在510 nm處測定蘆丁標準品溶液反應(yīng)后的吸光度值（A）。以蘆丁標準品濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，得到線性回歸方程，并以此為依據(jù)計算金銀花、銀杏葉總黃酮提取液的濃度。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

用移液管準確移取一定濃度金銀花、銀杏葉總黃酮提取物液0.2mL，分別置于10mL棕色比色管中，加入6mL濃度為0.06mmoL/LDPPH自由基甲醇溶液，加入甲醇定容至10mL，振蕩搖勻，室溫避光反應(yīng)30min后，在波長517nm處測定吸光度A[7]。依據(jù)公式1計算金銀花、銀杏葉總黃酮單獨作用及復(fù)配作用對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為未加總黃酮提取液的DPPH自由基溶液反應(yīng)的吸光度；Ar為加入總黃酮提取液的DPPH自由基溶液反應(yīng)的吸光度；Ax為待測總黃酮提取液本底吸光度。

1.3.4金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配清除DPPH能力的測定

以金銀花、銀杏葉總黃酮單獨作用的IC50為參考，確定兩種黃酮提取物的濃度。將黃酮提取液稀釋成122μg/mL，按金銀花與銀杏葉總黃酮復(fù)配比為1∶1、1∶3、1∶9、3∶1、9∶1進行混合[8-9]，按照1.3.3方法測定復(fù)配混合溶液對DPPH自由基的清除率，應(yīng)用Sigmaplot12繪制Isobologram分析圖，對復(fù)配混合物的協(xié)同清除DPPH自由基能力進行分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

由實驗得到復(fù)配溶液實際的半數(shù)清除率IC50mix，采用t檢驗法對復(fù)配溶液的IC50add和IC50mix進行比較分析，確定是否有顯著性差異。若IC50mix＜IC50add值，表示二者具有協(xié)同作用[10-11]。

式中：P1為金銀花總黃酮在復(fù)配組中占的比例；P2為銀杏葉總黃酮在復(fù)配組中占的比例，P2=1-P1；R為金銀花、銀杏葉總黃酮單獨作用時的效價比，即R= IC50A/IC50B。

為表示金銀花總黃酮與銀杏葉總黃酮相互作用程度的大小，計算相互作用指數(shù)（γ），分析二者協(xié)同或拮抗作用的大小[11]。

式中：IC50Amix、IC50Bmix分別為復(fù)配溶液中金銀花、銀杏葉總黃酮的半數(shù)清除率IC50；IC50A、IC50B分別為抗氧化劑金銀花總黃酮、銀杏葉總黃酮單獨作用時的IC50。若相互作用指數(shù)γ=1，表示金銀花、銀杏葉總黃酮間相互作用為相加；若γ＞1，表示兩者間相互作用為拮抗；若γ＜1，表示兩者間為協(xié)同作用。

2結(jié)果與分析

2.1黃酮提取液濃度的測定

根據(jù)蘆丁標準曲線，得線性回歸方程y=0.007 3x+ 0.007 8（R2=0.999 0），表明濃度在0～98.4μg/mL之間有良好的線性關(guān)系。準確移取稀釋后的黃酮提取液1 mL，按照上述方法測定吸光度值A(chǔ)，根據(jù)線性回歸方程計算金銀花、銀杏葉總黃酮提取液的濃度分別為4 626.7μg/mL和3 051.37μg/mL。

2.2金銀花、銀杏葉總黃酮清除DPPH自由基的能力

依據(jù)1.3.4所描述的方法，配制不同濃度VC、金銀花總黃酮、銀杏葉總黃酮樣品溶液，測定各個樣品溶液的DPPH反應(yīng)吸光度值，計算VC、金銀花總黃酮、銀杏葉總黃酮對DPPH自由基的清除率，DPPH清除率試驗結(jié)果見圖1。

圖1 3種樣液對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH scavenging capacity of differentantioxidants

由圖1可以看出，在一定濃度下，DPPH自由基清除率隨著有效濃度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢，但當(dāng)達到一定的濃度后，這種變化不明顯且逐漸趨于平緩。以IC50為衡量指標，比較金銀花、銀杏葉總黃酮提取物與VC單獨對DPPH自由基的清除率，則三者對DPPH自由基清除能力大小分別為VC（IC50=22.01μg/mL）＞金銀花總黃酮（IC50=58.14μg/mL）＞銀杏葉總黃酮（IC50= 61.32μg/mL）。半數(shù)清除率越低，表明該種物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力越強，反之越弱。

2.3金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配清除DPPH自由基的能力

以金銀花、銀杏葉總黃酮提取物單獨作用IC50為參考，將兩種黃酮提取物按照復(fù)配比為1∶1、1∶3、1∶9、3∶1、9∶1進行混合，分析混合后的復(fù)合總黃酮提取物對DPPH自由基清除能力，計算復(fù)合組的IC50，試驗結(jié)果見表1。

表1 金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配混合物清除DPPH自由基能力Table1 DPPH radicalscavenging capacity of com bination

續(xù)表1金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配混合物清除DPPH自由基能力Continue table1 DPPH radicalscavenging capacity of combination

由表1可知，隨著金銀花、銀杏葉混合物總黃酮濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸增大。采用DPPH自由基清除試驗比較銀杏葉總黃酮與金銀花總黃酮復(fù)配比例對協(xié)同抗氧化能力的影響，結(jié)果顯示這兩種黃酮提取物復(fù)配后存在協(xié)同作用，且按不同比例進行復(fù)配的協(xié)同抗氧化作用大小存在著一定差異。

為了比較直觀的分析金銀花、銀杏葉總黃酮間協(xié)同作用，應(yīng)用Isobologram分析得到兩種物質(zhì)復(fù)配后的效應(yīng)圖2。

由圖2可知，金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配組的效應(yīng)點均落在相加線和95%可信線的下方，表明兩者之間具有協(xié)同抗氧化作用。

圖2 金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配的Isobologram分析圖Fig.2 Isobolographic plotof flavonoids from honeysucklewith ginkgo leaves

2.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用t檢驗對IC50add和IC50mix進行統(tǒng)計比較，若IC50mix＜IC50add，表示金銀花、銀杏葉總黃酮之間具有協(xié)同作用。按照1.4進行分析，試驗結(jié)果見表2。

表2 復(fù)合黃酮提取物IC50mix和IC50addTable2 The IC50mixand IC50addof Combination

表2結(jié)果顯示各種組合的IC50mix均小于IC50add，經(jīng)過t檢驗證明兩者之間存在顯著性差異，且具有較好的協(xié)同作用。相互作用指數(shù)γ值均小于1，表明金銀花、銀杏葉總黃酮間有協(xié)同作用，協(xié)同相互作用的大小順序為1∶9＞1∶1＞1∶3＞3∶1＞9∶1。金銀花總黃酮與銀杏葉總黃酮復(fù)配比為1∶9時，γ值最小，協(xié)同清除DPPH自由基的相互作用最好。

3結(jié)論

采用DPPH自由基清除實驗，比較金銀花黃酮、銀杏葉黃酮對DPPH自由基活性的清除率，并分析將二者按照一定的比例進行復(fù)配的抗氧化性。結(jié)果顯示，金銀花、銀杏葉總黃酮復(fù)配后清除DPPH自由基的相互作用指數(shù)（γ）均小于1，二者復(fù)配可以增強清除DPPH自由基效果。金銀花總黃酮與銀杏葉總黃酮復(fù)配比為1∶9時，γ為0.71，協(xié)同清除DPPH自由基的相互作用效果最好。本試驗基于這兩種黃酮提取物進行的研究，存在一定的試驗誤差，兩者復(fù)配的最佳配比還需要大量的研究數(shù)據(jù)，以優(yōu)化復(fù)合配比的試驗方案，以便于更好的指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

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Synergistic Removing DPPH Radicals of Flavonoids from Honeysuck le and Ginkgo Leaves

SHIYan-bin
（TianshiCollege，Tianjin 301700，China）

Themethod of ultrasonic assisted extraction was used to extract flavonoids from honeysuckle and ginkgo leaves.The two kinds of flavonoids extraction wasmixed according to certain proportion.Then themixtureon vitroantioxidantactivity ofoxidation resistancewasanalysed by testing scavengingabilityofDPPH radical.The resultsshowed that the two kindsof flavonoids from honeysuckleand ginkgo leaveshad obvious removal effects on DPPH free radicals，and the half of clearance（IC50）were 58.14μg/mL and 61.32μg/mL.And Isobologram analysis demonstrated the response of factorof flavonoids from honeysuckle and ginkgo leaveswere both located in the leftof the addition line and 95%confidence interval.Therewasa significantdifference between experimental IC50mixand theoretical IC50add.The interaction index（γ）wereall less than 1，themixtureexhibited stronger removing capacity of DPPH radicals that the single one.When the proportion of honeysuckle flavonoidsand ginkgo flavonoids（allof the following compound ratio refered to themass ratio）was1∶9，γwas 0.71.The collaborative interaction effectof removing DPPH free radicalswas the best.

honeysuckle；ginkgo leaves；flavonoids；DPPH；synergistic antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.010

2016-11-17

石艷賓（1977—），女（漢），高級工程師，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)與質(zhì)量管理。