超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)食品中的牛奶過敏原酪蛋白

詹麗娜, 陳 沁, 古淑青, 鄧曉軍

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436; 2. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135)

研究論文

超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)食品中的牛奶過敏原酪蛋白

詹麗娜1, 陳 沁1, 古淑青2*, 鄧曉軍2

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436; 2. 上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 上海 200135)

基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng),建立了食品中牛奶過敏原酪蛋白的快速篩查和定量檢測(cè)方法。樣品經(jīng)緩沖液提取后,采用5 kD超濾膜去除小分子雜質(zhì),得到蛋白質(zhì)提取液。以數(shù)據(jù)依賴采集(data-dependent acquisition, DDA)方式獲得全掃描質(zhì)譜圖,進(jìn)行蛋白質(zhì)定性確證,以平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(parallel reaction monitoring, PRM)技術(shù)對(duì)目標(biāo)特征肽段進(jìn)行定量分析。針對(duì)特征肽段,設(shè)計(jì)并合成了內(nèi)標(biāo)肽和內(nèi)標(biāo)物質(zhì),以降低基質(zhì)效應(yīng)和抵消處理過程中的損失。該方法應(yīng)用于食品中的α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的快速篩查和定量檢測(cè)。結(jié)果表明,該方法在5～250 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量限為0.2～5.5 μg/kg,平均回收率在68.8%～104.4%之間,RSD<6%。該方法可用于果汁飲料、果醬、面包、早餐谷物中牛奶過敏原酪蛋白的快速篩查和定量分析。

超高效液相色譜;四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜;酪蛋白;食品

食物過敏是過敏患者對(duì)某些食物產(chǎn)生的一種變態(tài)免疫反應(yīng)。食物過敏原是引起過敏反應(yīng)的抗原性物質(zhì),多數(shù)為食品中的蛋白質(zhì)[1]。隨著食物過敏人群在全世界范圍內(nèi)的增加,食物過敏已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)一個(gè)主要的健康問題。目前發(fā)現(xiàn)大約有160種以上的食物含有過敏原,而90%以上的過敏反應(yīng)都是由8大類過敏原引起的,包括:大豆、花生、堅(jiān)果、奶類、蛋類、小麥、貝類和魚類[2],其中牛奶是最常見的能夠引起普遍過敏反應(yīng)的食物之一。牛乳中蛋白質(zhì)含量為3.0%～3.7%,其中酪蛋白約占牛奶蛋白質(zhì)的80%～82%[3]。牛奶中的酪蛋白是氨基酸、鈣和磷等多種有益物質(zhì)的來源,但同時(shí)也是極容易引起過敏的食物過敏原。

目前過敏原檢測(cè)方法主要有免疫分析法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法和質(zhì)譜法。免疫分析法主要是通過特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì),包括免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。ELISA方法已經(jīng)發(fā)展成商業(yè)試劑盒的形式,但由于食品熱加工以及工藝過程會(huì)破壞目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)不能被特異性抗體識(shí)別,導(dǎo)致假陰性反應(yīng)[4]。并且大多數(shù)ELISA試劑盒只能檢測(cè)單一過敏原,不能同時(shí)對(duì)復(fù)雜食物基質(zhì)中的多種過敏原進(jìn)行檢測(cè),而且容易發(fā)生交叉反應(yīng)[5]。PCR法對(duì)致敏食品中特異的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增,目標(biāo)物質(zhì)明確,假陽性率降低,但是檢測(cè)物是DNA而非致敏蛋白質(zhì)[6]。質(zhì)譜方法既克服了免疫學(xué)方法存在的通量低和交叉反應(yīng)的弊端,也克服了PCR技術(shù)不能直接檢測(cè)致敏蛋白質(zhì)的缺點(diǎn),能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和多肽進(jìn)行明確鑒定,并且可以同時(shí)直接檢測(cè)多種過敏原[7]。已有多種類型的質(zhì)量分析器包括三重四極桿質(zhì)譜(QqQ)、四極桿-線性離子阱質(zhì)譜(Q/LIT)、四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q/TOF)等[8]被應(yīng)用于食品過敏原的檢測(cè)。

四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q/Orbitrap MS)將四極桿質(zhì)譜和靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜串聯(lián),具有高質(zhì)量分辨率和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)[9-11],廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、藥物、活性物質(zhì)、致癌物質(zhì)等的分析[10,12-14]。但將Orbitrap高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于過敏原蛋白質(zhì)的篩查和定量檢測(cè)尚未見報(bào)道。本文建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q/Orbitrap MS)同時(shí)檢測(cè)食品中的4種酪蛋白過敏原的方法,并應(yīng)用于實(shí)際樣品中酪蛋白過敏原的篩查和定量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

UltiMate液相色譜-3000四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(Q Exactive)聯(lián)用儀(Thermo Fisher, USA);水浴鍋(SW22, Julabo,德國(guó));離心機(jī)(Allegra X-22R Centrifuge, Beckman Coulter, USA);所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore, USA)制得。碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(DDT)、碘代乙酰胺(IAA)、氯化鈣、牛胰蛋白酶、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白均購(gòu)自Sigma公司(USA); 40 mmol/L Tris-HCl(Fluka, USA);甲酸(≥98%, Fluka, USA);乙腈(Thermo Fisher, USA)。超濾離心管(1.5 mL, Sartorius,德國(guó))、低蛋白吸附離心管(1.5 mL, Eppendorf,德國(guó))、低蛋白吸附移液器吸頭(0.1 mL/1 mL, Brand,德國(guó))、低蛋白吸附濾膜(0.22 μm, Agela, USA)。用水將各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,其中α-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液300 μg/mL(α-S1酪蛋白和α-S2酪蛋白的質(zhì)量比為79∶21),β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液250 μg/mL,κ-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液240 μg/mL。實(shí)驗(yàn)中使用的特征肽、內(nèi)標(biāo)肽及內(nèi)標(biāo)物由上海波泰生物科技有限公司合成。取濃度為10 μg/mL的各內(nèi)標(biāo)肽段及內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL,加入0.1%(v/v)甲酸溶液定容至1 mL,配制成質(zhì)量濃度均為0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。面包、早餐谷物、果汁、果醬等樣品為市售。

1.2 樣品前處理

取1 g固體樣品,加入25 mL 40 mmol/L Tris-HCl;或取5 g液體樣品加入20 mL 40 mmol/L Tris-HCl。放入水浴鍋中,于65 ℃振蕩提取2 h。取出后4 000 g下離心5 min,取上清液500 μL,加入100 μL內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,混合后轉(zhuǎn)移至5 kD超濾離心管中。于10 000 g下高速離心15 min,超濾濃縮除去小分子雜質(zhì)得到蛋白質(zhì)提取液。吸取200 μL蛋白質(zhì)提取液加入1.5 mL低蛋白吸附離心管中,隨后加入150 μL 500 mmol/L的碳酸氫銨,混勻后加入10 μL 500 mmol/L的DDT溶液,混勻,于75 ℃下恒溫反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后加入30 μL 500 mmol/L的IAA溶液,暗處靜止30 min。隨后加入10 μL 100 mmol/L的氯化鈣溶液和50 μL 500 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴中酶解2 h。最后加10 μL甲酸終止反應(yīng),靜置15 min,用水定容至1 mL,過0.22 μm低蛋白吸附濾膜,采用UPLC-Q/Orbitrap MS進(jìn)行分析。

采用果汁、果醬、面包和麥片作為空白基質(zhì),按照5.0、2.0和0.5 mg/L 3個(gè)水平進(jìn)行蛋白質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)。

1.3 UPLC-Q/Orbitrap MS條件

1.3.1 色譜條件

反相色譜柱:Kinetex XB-C18 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex, USA)。進(jìn)樣體積:10 μL;柱溫:35 ℃。流動(dòng)相A為0.05%(v/v)甲酸溶液,流動(dòng)相B為0.05%(v/v)甲酸乙腈溶液。采用梯度洗脫:0～4 min, 97%A; 4～19 min, 97%A～30%A; 19～20 min, 30%A～10%A; 20～24 min, 10%A; 24～25 min, 10%A～97%A; 25～30 min, 97%A。流速:0.2 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源采用正離子模式;保護(hù)氣壓力:206.85 kPa(30 psi);輔助氣壓力:68.95 kPa(10 psi);噴嘴電壓:3.5 kV;毛細(xì)管溫度:320 ℃;輔助氣溫度:250 ℃;全掃描模式,掃描范圍m/z300～2 000;分辨率:35 000。根據(jù)參考文獻(xiàn)[15-19],每種酪蛋白選擇兩個(gè)特征肽段,并通過MS對(duì)酪蛋白酶解肽段的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化(見表1)。

表 1 牛奶過敏原酪蛋白酶解肽段MS參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了檢測(cè)胰蛋白酶酶解后食物樣品中的肽段濃度,用含有以上8個(gè)合成肽段的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,在每個(gè)濃度的溶液中均加入100 μL內(nèi)標(biāo)肽段混合工作溶液。由于不同的食物基質(zhì)對(duì)肽段信號(hào)具有增強(qiáng)或抑制的作用,為降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)酪蛋白定量的影響,采用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

2 結(jié)果和討論

2.1 特征肽段的選擇

特征肽段的選擇對(duì)基于胰蛋白酶酶解方法進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)來說非常重要,一段合適的特征肽段序列對(duì)于被分析蛋白質(zhì)來說必須具有特異性,不易發(fā)生蛋白質(zhì)修飾;易被質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè);非常穩(wěn)定;酶解具有較高的重現(xiàn)性,不會(huì)發(fā)生錯(cuò)切或漏切;6～12個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽為優(yōu)先選擇,肽段過短會(huì)降低其特異性,肽段過長(zhǎng)定量不準(zhǔn)確[20]。MRM方法的建立可以基于一個(gè)單一的特征肽,但最好每個(gè)蛋白質(zhì)選2～3個(gè)肽,以獲得更好的特異性。

圖 1 果汁基質(zhì)中8種特征肽段的UPLC-MS/MS色譜圖Fig. 1 UPLC-MS/MS chromatograms of the eight targeted peptides of casein in juice a. total ion chromatogram(TIC)of the eight targeted peptides; b. extracted chromatograms of the eight targeted peptides.

隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中可以獲得4種酪蛋白完整的氨基酸序列。利用Proteinpilot軟件將4種酪蛋白的全掃描數(shù)據(jù)與其氨基酸序列進(jìn)行匹配驗(yàn)證,每個(gè)蛋白質(zhì)篩選出2個(gè)肽段,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-19],并經(jīng)BLAST搜索確認(rèn)其為該蛋白質(zhì)的特征肽段(BLAST search, www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。空白果汁中添加質(zhì)量濃度為250 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)肽段混合溶液,通過UPLC-MS/MS分析,結(jié)果如圖1所示。8個(gè)特征肽段的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時(shí)間均不相同,各肽段在本實(shí)驗(yàn)各儀器參數(shù)條件下能很好地分開。為了給每種蛋白質(zhì)選擇一個(gè)最合適的肽段,對(duì)果汁基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo),4種酪蛋白的加標(biāo)水平均為10 mg/L,通過酶解后進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,肽段S1-H、S2-F、κ-S和β-V在酶解后的加標(biāo)樣品中測(cè)得的濃度最高,說明這4個(gè)肽段較其他肽段性質(zhì)穩(wěn)定且在該實(shí)驗(yàn)條件下離子化效率較高。綜合考慮,選擇以上4種肽段分別作為α-S1、α-S2、κ-和β-酪蛋白的特征肽段。

2.2 內(nèi)標(biāo)的設(shè)計(jì)和選擇

對(duì)MS檢測(cè)影響最大的是基質(zhì)效應(yīng)。樣品中目標(biāo)物的共流出組分會(huì)影響樣品的離子化效率,使目標(biāo)物在基質(zhì)和溶劑中的響應(yīng)各不相同,從而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此需要引入內(nèi)標(biāo)來消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響[21,22]。根據(jù)內(nèi)標(biāo)的選擇原則,本文選擇與特征肽段相似的氨基酸序列作為內(nèi)標(biāo)。采用在特征肽段氨基酸序列中增加或者替代一個(gè)氨基酸作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),增加或替代的氨基酸應(yīng)滿足如下要求:取代氨基酸與原氨基酸應(yīng)具有相近的極性和化學(xué)結(jié)構(gòu),保證其與特征肽具有相似的色譜行為;兩個(gè)氨基酸間的相對(duì)分子質(zhì)量相差20 Da以上,以降低與特征肽段間的相互干擾;避免取代或替換氨基酸序列中胰蛋白酶的位點(diǎn)R和K,以免影響酶切效率;避免取代碎片離子兩端的氨基酸,以免影響碎片離子的離子化效率?；诖嗽瓌t合成了8種內(nèi)標(biāo)肽段(見表2)。

為考察合成的8種內(nèi)標(biāo)肽段和特征肽段之間是否存在干擾,根據(jù)肽段的色譜檢測(cè)條件,將相同濃度的合成內(nèi)標(biāo)肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液與特征肽段標(biāo)準(zhǔn)溶液混合后進(jìn)樣。

內(nèi)標(biāo)肽段的主要作用是用來消除因基質(zhì)效應(yīng)影響造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差,要求內(nèi)標(biāo)肽段與特征肽段的性質(zhì)較為相近。鑒于此,需要對(duì)合成的8個(gè)內(nèi)標(biāo)肽段的色譜行為以及質(zhì)譜行為進(jìn)行比較。色譜行為主要由保留時(shí)間體現(xiàn),由圖2可知,各內(nèi)標(biāo)肽段與各蛋白質(zhì)特征肽段保留時(shí)間均不相同,其中S1-2、S2-2、κ-1和β-1的保留時(shí)間與各酪蛋白特征肽段保留時(shí)間最為接近,表明其在反相色譜柱上的行為與各蛋白質(zhì)特征肽段最為相近。

接下來進(jìn)行質(zhì)譜行為的比較。質(zhì)譜行為主要體現(xiàn)在離子化效率上,離子化行為相近則其質(zhì)譜行為亦相近,而離子化效率由靈敏度體現(xiàn)出來。為研究各物質(zhì)的離子化效率,將各內(nèi)標(biāo)肽段及酪蛋白特征肽段配制成濃度為5、25、50、100、150 nmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)進(jìn)樣分析后,以濃度為橫坐標(biāo)、面積為縱坐標(biāo)做線性擬合,得各內(nèi)標(biāo)肽段和各酪蛋白特征肽段的線性方程和曲線(見圖3)。內(nèi)標(biāo)肽段S1-2、S2-2、κ-1和β-1的斜率和各自酪蛋白特征肽段斜率最為接近,即在相同濃度范圍內(nèi),內(nèi)標(biāo)肽段與對(duì)應(yīng)的酪蛋白特征肽段的響應(yīng)值較為接近,也說明其離子化效率較為相近。綜合上述兩者的比較,選擇內(nèi)標(biāo)肽段S1-2、S2-2、κ-1和β-1作為各酪蛋白的內(nèi)標(biāo)肽段。

選定內(nèi)標(biāo)肽段后,根據(jù)這4個(gè)酪蛋白的氨基酸序列,在內(nèi)標(biāo)肽段兩端加上與特征肽段相同的10個(gè)氨基酸,以保證在酶解過程中內(nèi)標(biāo)物與蛋白質(zhì)具有相同的酶解位點(diǎn)?？疾焖铣傻膬?nèi)標(biāo)物是否合適,主要看其是否和蛋白質(zhì)具有相同的酶解效率。取濃度為50 nmol/L的蛋白質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物混合后,按1.2節(jié)步驟酶解、進(jìn)樣;另外,將內(nèi)標(biāo)肽段和特征肽段配制成與上步相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)樣。以酪蛋白特征肽段的峰面積為分母、酪蛋白酶解所得肽段的峰面積為分子,計(jì)算蛋白質(zhì)的酶解效率;以內(nèi)標(biāo)肽段峰面積為分母、內(nèi)標(biāo)物酶解所得肽段的峰面積為分子,計(jì)算內(nèi)標(biāo)物的酶解效率;并計(jì)算二者百分比。α-S1、α-S2、κ-和β-酪蛋白由內(nèi)標(biāo)物計(jì)算所得的酶解效率分別為90%、78%、94%和96%;由蛋白質(zhì)計(jì)算所得的酶解效率分別為88%、80%、90%和95%。兩者相近,說明本實(shí)驗(yàn)中所合成的內(nèi)標(biāo)物與各自酪蛋白之間有相同的酶解效率和色譜行為,可以消除酶解效率對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。

圖 2 果汁中酪蛋白特征肽段與合成內(nèi)標(biāo)肽段的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the casein signature peptides and synthetic internal standard peptides in juice

MilkproteinInternalstandardpeptideParention(m/z)(chargestate)Daughterion(m/z)(fragment)α-S1caseinHQGGLPQEVLNENLLR(S1-1)606.32699(+3)493.25173(b5)HQGILPQEVLNENLLR(S1-2)625.01452(+3)549.31397(b5)α-S2caseinFVALPQYLK(S2-1)539.81841(+2)648.37065(y5)FIALPQYLK(S2-2)546.82624(+2)648.37221(y5)κ-CaseinSPAQILQWQVVLSNTVPAK(κ-1)693.72475(+3)315.20223(y62+)SPAQILQWQALSNTVPAK(κ-2)651.35818(+3)368.25401(b72+)β-CaseinVALPVPQK(β-1)426.27110(+2)372.22341(y3)VILPVPQK(β-2)447.29457(+2)372.22364(y3)

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

最佳酶解時(shí)間:在果汁中加入酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為10 mg/L。按照1.2節(jié)樣品前處理步驟進(jìn)行酶解,酶解時(shí)間分別設(shè)定為1、2、3、4、5 h和過夜(約16 h),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣3次,結(jié)果見圖4。根據(jù)蛋白質(zhì)和肽段的等物質(zhì)的量的關(guān)系,可以計(jì)算出各酪蛋白的含量。當(dāng)酶解時(shí)間為2 h時(shí),各酪蛋白特征肽的檢測(cè)濃度達(dá)到最高值,由此推算出酶解的酪蛋白的濃度也達(dá)到最高值,因此本實(shí)驗(yàn)中酶解時(shí)間定為2 h。

表 3 空白基質(zhì)中過敏原酪蛋白特征肽段的LOD、LOQ和線性關(guān)系(n=5)

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

圖 3 4種酪蛋白特征肽段與合成內(nèi)標(biāo)肽段的線性響應(yīng)Fig. 3 Linear response of four casein signature peptides and internal standard peptides

圖 4 4種酪蛋白的酶解濃度隨酶解時(shí)間的變化Fig. 4 Enzymatic concentrations of four types of caseins along with the enzymatic hydrolysis times

2.4 方法的線性關(guān)系、LOD和LOQ

在4種樣品中分別找出一個(gè)不含有牛奶的樣品作為空白,采用空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,每個(gè)濃度點(diǎn)均加入100 μL對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)肽段標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。最終肽段S1-H和к-S的質(zhì)量濃度為10、25、50、100和250 μg/L;肽段S2-F和β-V的質(zhì)量濃度為5、25、50、100和250 μg/L。在空白基質(zhì)提取液中,添加低濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,獲得每個(gè)肽段信噪比(S/N)為3時(shí)的質(zhì)量濃度,作為該特征肽段的LOD,S/N=10時(shí)的質(zhì)量濃度為L(zhǎng)OQ,結(jié)果見表3。

2.5 加標(biāo)回收率

在4種樣品的提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物,根據(jù)蛋白質(zhì)和特征肽段的等物質(zhì)的量的關(guān)系計(jì)算加標(biāo)回收率。蛋白質(zhì)的添加水平分別為5.0、2.0和0.5 mg/L(n=6)。如表4所示,α-S1酪蛋白回收率在68.8%～95.5%之間,RSD≤5.7%;α-S2酪蛋白回收率在86.0%～99.5%之間,RSD≤4.6%;κ-酪蛋白回收率在79.5%～104%之間,RSD≤5.5%;β-酪蛋白回收率在70.8%～92.4%之間,RSD≤5.6%。

2.6 精密度

精密度通過所測(cè)加標(biāo)基質(zhì)的RSD反映。因此,在空白面包基質(zhì)中分別添加3個(gè)水平的酪蛋白進(jìn)行精密度計(jì)算。按1.2節(jié)樣品前處理步驟進(jìn)行酶解。日內(nèi)精密度:每個(gè)空白基質(zhì)取9份,每個(gè)水平單獨(dú)加標(biāo)3次,按照樣品前處理步驟進(jìn)行酶解后,每份樣品進(jìn)樣檢測(cè)3次;日間精密度:連續(xù)3天中,樣品每個(gè)水平加標(biāo)一次,酶解后,每個(gè)樣品平行檢測(cè)3次。添加水平及檢測(cè)結(jié)果見表5。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證所建立分析方法的實(shí)用性,在市場(chǎng)上找了28種果汁、果醬、面包和麥片樣品,所有樣品都按1.2節(jié)樣品前處理步驟進(jìn)行酶解,最后采用UPLC-MS/MS檢測(cè)其中的4種酪蛋白過敏原含量,結(jié)果見表6。雖然所選樣品的標(biāo)簽上都沒有標(biāo)明產(chǎn)品中含有牛奶過敏原,但是仍在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了酪蛋白。面包樣品中的酪蛋白含量最高,因?yàn)槊姘庸み^程中加入牛奶可以改善面包的風(fēng)味,保持面包表面光滑并具有較好的保水性。

表 4 4種基質(zhì)中酪蛋白的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

表 6 (續(xù))

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3 結(jié)論

本方法采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)食品中的牛奶過敏原酪蛋白,樣品前處理步驟簡(jiǎn)單,酶解時(shí)間短,且有較高的靈敏度和回收率。設(shè)計(jì)的內(nèi)標(biāo)物降低了復(fù)雜樣品中的基質(zhì)干擾,顯著提高了定性和定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,能滿足面包、餅干、果汁、果醬等食品中酪蛋白過敏原的快速篩查和定量分析。

[1] Heick J, Fischer B, Kerbach S, et al. J AOAC Int, 2011, 94(4): 1060

[2] Monaci L, Visconti A. TrAC-Trends Anal Chem, 2009, 28(5): 581

[3] Zhang Y, Hu Z H, Lai Y P. Chinese Journal of Food Science, 2009, 30(14): 31

張艷, 胡志和, 賴宜萍. 食品科學(xué), 2009, 30(14): 31

[4] Ansari P, Stoppacher N, Rudolf J, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 399: 1105

[5] Feng X Y, Zhang J, Lü M L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(6): 510

馮小燕, 張津, 呂美玲, 等. 色譜, 2013, 31(6): 510

[6] Heick J, Ficher M, Popping B. J Chromatogr A, 2011, 2(18): 938

[7] Gu S Q, Zhao C M, Cheng J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 43(7): 639

古淑青, 趙超敏, 程甲, 等. 色譜, 2016, 43(7): 639

[8] Wang X, Wang S, Cai Z. TrAC-Trends Anal Chem, 2013, 52: 170

[9] Mamone G, Picariello G, Caira S, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216: 7130

[10] Ye X W, Peng Y, Niu Z Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(4): 377

葉曦雯, 彭燕, 牛增元, 等. 色譜, 2015, 33(4): 377

[11] Stefano V D, Avellone G, Bongiorno D, et al. J Chromatogr A, 2012, 1259: 74

[12] Zhao S Z, Yi X H, Shi Y J, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(4): 397

趙善貞, 伊雄海, 時(shí)逸吟, 等. 色譜, 2016, 34(4): 397

[13] Du Y S, Li Q, Wu C M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(4): 371

杜彥山, 李強(qiáng), 吳春敏, 等. 色譜, 2015, 33(4): 371

[14] Zhang X G, Zheng Y J, Cao Y T, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 583

張協(xié)光, 鄭彥捷, 曹泳艇, 等. 色譜, 2015, 33(6): 583

[15] Mattarozzi M, Milioli M, Bignardi C, et al. Food Control, 2014, 38: 82

[16] Newsome G A, Scholl P F. J Agric Food Chem, 2013, 61(24): 5659

[17] Zhang W, He Y, Liu W, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(10): 1493

張偉, 賀艷, 劉偉, 等. 分析化學(xué), 2013, 41(10): 1493

[18] Monacia L, Lositob I, Palmisanob F, et al. J Chromatogr A, 2010, 1217(26): 4300

[19] Lutter P, Parisod V, Weymuth H. J AOAC Int, 2011, 94(4): 1043

[20] Koeberl M, Clarke D, Lopata A L. J Proteome Res, 2014, 13(8): 3499

[21] Zhang J S. [PhD Dissertation]. Hangzhou: Zhejiang University, 2012

張京順. [博士學(xué)位論文]. 杭州: 浙江大學(xué), 2012

[22] Zhang J S, Lai S Y, Zhang Y, et al. Anal Chim Acta, 2012, 727: 47

Determination of milk allergen caseins in foods by ultra performance liquid chromatography-quadrupole/ electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry

ZHAN Lina1, CHEN Qin1, GU Shuqing2*, DENG Xiaojun2

(1.DepartmentofFoodEngineering,SchoolofLifeScience,ShanghaiUniversity,Shanghai200436,China;2.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China)

Based on ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (UPLC-Q/Orbitrap MS) system, a rapid screening and quantitative detection method for milk allergen caseins was developed. After the sample was extracted with protein extraction buffer, a 5 kD ultrafiltration membrane was used to remove small molecule impurities. The extracted protein was then digested by trypsin. The full-scan mass spectra obtained by the data-dependent acquisition (DDA) mode were used for protein identification, and parallel reaction monitoring (PRM) technique was used for quantitative analysis of the target signature peptide. The internal standard peptide and the internal standard substances for every signature peptide were designed and synthesized to reduce the matrix effect and eliminate the loss in sample pretreatment. The proposed method showed a good linear relationship in the range of 5-250 μg/L. The limits of quantitation were in the range of 0.2-5.5 μg/kg. The observed recoveries ranged from 68.8% to 104.4%, and the RSDs were lower than 6%. This method can be used for rapid screening and quantitative analysis of milk allergen casein in juice, jam, bread and breakfast cereals.

ultra performance liquid chromatography (UPLC); quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (Q/Orbitrap MS); casein; foods

10.3724/SP.J.1123.2016.10034

2016-10-11

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(14ZR1450000);長(zhǎng)三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目(15395810101,16395810101);國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目(2016IK222).

Foundation item: Shanghai Natural Science Foundation (No. 14ZR1450000); Science and Technology Joint Project of the Yangtze River Delta (Nos. 15395810101, 16395810101); Scientific and Technological Project of the General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China (No. 2016IK222).

O658

A

1000-8713(2017)04-0405-08

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:gushuqing@sina.cn.