納米熒光生物傳感器研究進(jìn)展及應(yīng)用

馮婷婷

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

納米熒光生物傳感器研究進(jìn)展及應(yīng)用

馮婷婷

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

傳統(tǒng)熒光生物傳感器存在檢測(cè)能力不強(qiáng)、穩(wěn)定性差的問(wèn)題，使得生物傳感器的推廣、使用受限。納米技術(shù)的出現(xiàn)促進(jìn)了熒光傳感器的發(fā)展，使納米熒光生物傳感器的檢測(cè)能力大大提升，具備高靈敏度、反應(yīng)靈敏、專一性強(qiáng)、檢測(cè)程序簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，因此近年來(lái)納米熒光生物傳感技術(shù)發(fā)展迅猛。本文分別概述了納米熒光生物傳感器的分類及特點(diǎn)，通過(guò)現(xiàn)有的科研成果展示了當(dāng)前納米熒光生物傳感器的技術(shù)發(fā)展水平，著重分析并比較了當(dāng)前生物傳感器存在的關(guān)鍵問(wèn)題。結(jié)合近年來(lái)納米技術(shù)科研水平的提升，基于納米技術(shù)設(shè)計(jì)的納米熒光生物傳感器體系在設(shè)計(jì)、制備、空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及實(shí)用性方面的綜合提升作用，為新型選擇性檢測(cè)、定向檢測(cè)提供了解決途徑并展望了未來(lái)納米熒光生物傳感器的發(fā)展方向及前景。

納米技術(shù)；熒光生物傳感器；生物探針

1 納米熒光生物傳感器發(fā)展歷程

生物傳感器的概念始于20世紀(jì)60年代，直到80年代，全面而深入的研究才得以開展，在初始階段的研究取得了豐碩成果，在生物酶、DNA、Hg+有毒重金屬離子等的檢測(cè)有著大量實(shí)踐。生物傳感器作為一種檢測(cè)手段，檢測(cè)對(duì)象一般為生物酶、DNA、抗原/抗體、細(xì)菌等活性物質(zhì)，以此作為識(shí)別對(duì)象的一類傳感器[1]。由于生物傳感器有著比傳統(tǒng)檢測(cè)手段更高的靈敏度、更短的響應(yīng)時(shí)間、更直觀的檢測(cè)結(jié)果，現(xiàn)已被深度開發(fā)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)科研工作、臨床醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)治理、司法鑒定等。但由于材料科學(xué)水平的限制、制備技術(shù)的不成熟、科研體系建立的不完善，導(dǎo)致了當(dāng)時(shí)生物傳感器的響應(yīng)檢出能力并不理想，不能完全滿足生物醫(yī)學(xué)等其他學(xué)科的需求。隨著掃描電鏡、透射電鏡技術(shù)的發(fā)展，納米技術(shù)在20世紀(jì)90年代呈現(xiàn)出爆發(fā)式增長(zhǎng)，也間接促進(jìn)納米生物傳感器的進(jìn)步。由于材料尺寸達(dá)到納米級(jí)別時(shí)，一般具備小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、介電限域效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)等特征，使得比表面積顯著增大、表面能增加，材料表面的物理化學(xué)性質(zhì)發(fā)生根本改變。促進(jìn)了各學(xué)科的進(jìn)步，延伸的研究領(lǐng)域十分廣泛，如納米光催化技術(shù)、鋰電池技術(shù)、傳統(tǒng)金屬加工技術(shù)等。其中生物傳感器輔予納米技術(shù)為傳感器的突破式發(fā)展提供了可行的方案，現(xiàn)有的研究成果中，各體系類型的納米生物傳感器已被深入研究。

2 納米熒光生物傳感器分類

納米熒光生物傳感器是在納米技術(shù)的手段下，以納米材料為主要載體，來(lái)作為新型生物傳感器傳輸介質(zhì)，檢測(cè)識(shí)別物質(zhì)一般為酶、抗原/抗體、核酸、脂質(zhì)體、細(xì)胞、微生物等生物敏感性物質(zhì)，并以釋放的熒光信號(hào)作為檢測(cè)對(duì)象的分析體系。針對(duì)納米熒光生物傳感器中納米材料的功能來(lái)劃分，可分為納米熒光生物傳感器、納米光纖熒光生物傳感器及納米光纖免疫生物傳感器等。

3 納米熒光生物傳感器

傳統(tǒng)熒光方法是采用有熒光效應(yīng)的染料標(biāo)記被檢物體，這種標(biāo)記方法操作復(fù)雜，操作者的技術(shù)水平直接影響著標(biāo)記的效果。標(biāo)記成功率低，熒光強(qiáng)度低以至于難于檢測(cè)發(fā)現(xiàn)；檢測(cè)背景復(fù)雜，對(duì)結(jié)果觀察造成干擾，會(huì)產(chǎn)生非相關(guān)顯示。采用納米技術(shù)制備的生物傳感器與目標(biāo)物質(zhì)有選擇性結(jié)合的效果，可以克服傳統(tǒng)熒光染料標(biāo)記技術(shù)的缺點(diǎn)，能夠保證標(biāo)記的成功率，獲得的檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)，便于檢測(cè)設(shè)備觀察，對(duì)靈敏度、可靠性上有著明顯的提升作用，為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中探究特定物質(zhì)提供可靠的技術(shù)手段，其應(yīng)用前景較好。目前，常見的納米熒光生物傳感器類型有量子點(diǎn)類、包封熒光分子類、稀土及稀土配合物類等。

3.1 量子點(diǎn)熒光生物傳感器

量子點(diǎn)納米顆粒一般由Ⅱ-Ⅵ（如CdSe，ZnS）、Ⅲ-Ⅴ族（如GaAs，InP）及Ⅳ-Ⅵ族（如PbS，PbSe）元素組成，目前研究最為深入的量子點(diǎn)體系為CdX（X=S、Se、Te）系列。量子點(diǎn)由于特殊的結(jié)構(gòu)尺寸（1～10nm），有著優(yōu)良的熒光特性，即高熒光量子產(chǎn)率、耐光漂白、相對(duì)狹窄而對(duì)稱的發(fā)射光譜和大范圍的連續(xù)激發(fā)光譜以及長(zhǎng)熒光壽命等，由于量子點(diǎn)的優(yōu)良熒光特性，使得量子點(diǎn)處理方式在生物傳感器中應(yīng)用較普遍。相較于熒光染料，量子點(diǎn)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性、發(fā)光壽命均有明顯優(yōu)勢(shì)，特別適用于長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)研究[2]。

針對(duì)體外游離物質(zhì)的檢測(cè)對(duì)象，Meng團(tuán)隊(duì)采用膽堿氧化酶、乙酰膽堿與量子點(diǎn)相結(jié)合的方式，使最終的符合體系在量子效應(yīng)的作用下，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)有較好的特異選擇性，檢測(cè)靈敏度更高、體系穩(wěn)定性好、對(duì)外部環(huán)境的耐受性大大增強(qiáng)，能夠線性響應(yīng)的濃度范圍明顯增強(qiáng)，上述特征使得膽堿類-量子點(diǎn)體系在有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)分析實(shí)用性上大大提升[3]。在水體氰離子監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，Noipa團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了高選擇性的納米熒光生物傳感器體系，利用CdS量子點(diǎn)自發(fā)熒光的特點(diǎn)，用半胱氨酸分子表面吸附處理，由于表面半胱氨酸與銅離子特異性的結(jié)合并發(fā)生明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，與氰離子發(fā)生熒光恢復(fù)現(xiàn)象[4]。半胱氨酸-量子點(diǎn)體系保證了觀察背景的高對(duì)比度；進(jìn)一步研究證實(shí)，熒光恢復(fù)程度與氰離子濃度成線性關(guān)系，可直接定量氰離子濃度。

以上述針對(duì)體外監(jiān)測(cè)對(duì)象現(xiàn)有的量子點(diǎn)熒光傳感器體系不同，體內(nèi)納米生物傳感器還應(yīng)具備良好的滲透能力、定向靶標(biāo)能力、可操作性及易分離等特性。為達(dá)到體內(nèi)物質(zhì)檢測(cè)的需求，具有磁特性的納米材料被引入生物傳感器領(lǐng)域，使其具備精準(zhǔn)的定向靶標(biāo)能力、可操作性及良好的分離效果，減少對(duì)生物體的影響及殘留，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。謝敏等將量子點(diǎn)基底材料與磁性納米三氧化二鐵作為核結(jié)構(gòu)，將苯乙烯、丙烯酰胺的共聚體吸附于量子點(diǎn)-磁性材料表面，改善表面理化性質(zhì)，增加該復(fù)合體系的生物相容性，也為后續(xù)表面改性提供修飾位點(diǎn)[5]。該團(tuán)隊(duì)將麥胚凝集素、花生凝集素、雙花扁豆凝集素嫁接于共聚體表面，制備了功能多樣的磁性納米熒光生物傳感器、該體系實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)細(xì)胞的糖蛋白組分有較好的檢測(cè)能力。

3.2 包封熒光分子類生物傳感器

包封熒光分子類生物傳感器將熒光染料、量子點(diǎn)等物質(zhì)封裝起來(lái)，保證了熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性，使其具備良好的穩(wěn)定性及強(qiáng)熒光效應(yīng)。Si團(tuán)隊(duì)鈣離子熒光染料與多孔惰性的聚丙烯酰胺納米粒子在超聲的環(huán)境下，組裝為包封熒光分子生物傳感器[6]?；诰郾０妨己玫姆€(wěn)定性及表面游離化學(xué)鍵的作用，該體系對(duì)熒光染料的保護(hù)作用明顯，染料熒光強(qiáng)度衰減緩慢，而且提升了生物傳感器與胞內(nèi)蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的概率，對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離的低濃度金屬離子檢出作用明顯。包封熒光分子類的生物傳感器在生理毒性上較量子點(diǎn)小，對(duì)人體健康影響微弱，故包封類生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域有明顯優(yōu)勢(shì)，是生物醫(yī)學(xué)研究的常用手段。

3.3 稀土及稀土配合物類生物傳感器

無(wú)機(jī)納米稀土離子存在著吸收能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)換效率高、發(fā)射能力強(qiáng)、激發(fā)范圍廣、性質(zhì)穩(wěn)定、易觀察等特點(diǎn)，有利于在生物分析的發(fā)光無(wú)標(biāo)記。陳團(tuán)隊(duì)制備了氨基功能化的KGdF4：（Eu3+、Tb3+、Dy3+）磁性-熒光雙功能多色納米粒子，在免疫分析中應(yīng)用廣泛；但稀土配合物的理化性質(zhì)變化較大，發(fā)射的能量范圍窄、斯托克斯位移大、熒光強(qiáng)度穩(wěn)定、壽命長(zhǎng)等性質(zhì)，相較于納米稀土離子體系，經(jīng)配合物修飾后，制成的熒光生物傳感器檢出能力更強(qiáng)、更易于觀察及判定[7]。Pihlasalo巧妙運(yùn)用Eu離子、Eu離子納米化螯合物在pH調(diào)節(jié)過(guò)程中，熒光強(qiáng)度的改變曲線，可準(zhǔn)確測(cè)量樣品中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其檢測(cè)限相較于傳統(tǒng)的電場(chǎng)法所需濃度更低、響應(yīng)更靈敏。Harma團(tuán)隊(duì)在采用均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移法時(shí)，將Eu3+螯合物修飾的納米粒子負(fù)載于聚苯乙烯表面，進(jìn)攻蛋白質(zhì)、量子點(diǎn)核殼結(jié)構(gòu)，能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出牛血清蛋白，最低檢測(cè)限下探至10ng，這種方法于生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)蛋白質(zhì)的定量分析的應(yīng)用潛力較大。

4 納米光纖熒光生物傳感器

納米光纖熒光生物傳感器發(fā)展較為迅速，它具有體積小、熒光分析特異性強(qiáng)、靈敏度高、抗電磁干擾能力強(qiáng)、信息容量大等諸多特點(diǎn)。Kopelman于20世紀(jì)90年代設(shè)計(jì)了應(yīng)用于熒光標(biāo)記檢測(cè)的納米光纖傳感器體系，在微環(huán)境pH值的檢測(cè)領(lǐng)域最早應(yīng)用。在提高靈敏度、小型化的探究上做了進(jìn)一步研究：在做DNA分子探究實(shí)驗(yàn)時(shí)引入納米金顆粒子，靈敏度高、選擇性好、成本低、易用性和快捷的便攜式傳感器比其他DNA檢測(cè)手段的優(yōu)勢(shì)明顯。采用表面等離子效應(yīng)帶來(lái)的影響，開發(fā)出適用于Cd離子定量檢測(cè)的納米光纖傳感器，金納米顆粒與植物絡(luò)合素及肽鏈交聯(lián)而成，檢測(cè)限達(dá)到了0.16 ppb級(jí)別。納米光纖熒光生物傳感器具有無(wú)需參比電極，使用簡(jiǎn)便、體積微小、速度快、可進(jìn)行遠(yuǎn)距離實(shí)時(shí)分析等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

5 納米光纖免疫生物傳感器

為提高生物傳感器與目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合特異性，將光學(xué)、光子學(xué)理論引入免疫學(xué)領(lǐng)域，利用抗原-抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原、抗體結(jié)合的光學(xué)變化量檢測(cè)、記錄下來(lái)，并采用納米處理技術(shù)設(shè)計(jì)的一類生物傳感器。兼具傳統(tǒng)免疫反應(yīng)特異性及傳感器熒光標(biāo)記的能力，廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞內(nèi)部檢測(cè)、監(jiān)測(cè)試驗(yàn)。將20nm的蛋白與金納米顆粒結(jié)合，在局部表面等離子效益的作用下，來(lái)探究體內(nèi)抗原-抗體的作用機(jī)理，對(duì)血清中前列腺特異性抗原有較強(qiáng)的特異選擇性。

6 展望

結(jié)合納米技術(shù)帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)，使得傳統(tǒng)生物傳感器能夠保持/獲得熒光特性，大大提升了檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度及持久性；由于納米化處理使得生物傳感器比表面積顯著提升，為化學(xué)基團(tuán)表面改性提供結(jié)合位點(diǎn)，為選擇性檢測(cè)有毒金屬離子、細(xì)胞內(nèi)酶/蛋白質(zhì)、抗原/抗體提供解決方案，前期研究已取得豐碩成果。但進(jìn)一步提升納米熒光生物傳感器的靈敏度、選擇性、生物相容性及檢測(cè)范圍仍是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。特別對(duì)于細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)檢測(cè)的生物傳感器的研究中，如何快速滲入、靶向結(jié)合、可控分離是限制細(xì)胞內(nèi)生物傳感器廣泛使用的重要因數(shù)。因此開發(fā)新型納米熒光生物傳感器，在檢出能力、檢測(cè)種類、細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)上有明顯提升是未來(lái)研究的主要方向。

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Research Progress and Application of Nanometer Fluorescence Biosensor

Feng Ting-ting
(Shanxi University of Traditional Chinese medicine,Shanxi Jinzhong 030619)

Traditional fluorescent biosensor has the problem of low detection ability and poor stability which makes the promotion and use of biosensor limited.The emergence of nano-technology has promoted the development of fluorescence sensor,greatly enhanced the detection ability of nano-fluorescent biosensor and has high sensitivity,responsive,specificity and simple detection procedure.Therefore,nanometer fluorescence biosensor technology has developed swiftly in recent years.In this paper,the general classification and characteristics of nano-fluorescence biosensors are summarized and the current development of nano-fluorescent biosensors is demonstrated by the existing research results.The key issues of the current biosensor are analyzed and compared.The nano-fluorescence biosensor system based on nano-technology is designed to improve the level of nanotechnology research in the design,preparation,spatial structure,nature and practicability.It provides a solution for the new selective detection and orientation detection.And the future development direction and prospect of nanometer fluorescence biosensor are prospected.

Nanotechnology;Fluorescence biosensor;Biological probe

TP212.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

2096-0387（2017）06-0078-04

馮婷婷（1985—），女，山西長(zhǎng)治人，博士，講師，研究方向：納米材料的制備用于生物傳感分析、熒光探針的合成及其生物應(yīng)用、用于細(xì)胞中酶的檢測(cè)等。