女性人乳頭瘤病毒感染的基因型分布及臨床意義

陳靜 徐晶晶 何淑珍 秘相平 王文河

·論著·

女性人乳頭瘤病毒感染的基因型分布及臨床意義

陳靜 徐晶晶 何淑珍 秘相平 王文河

目的 探討人乳頭瘤病毒(HPV)感染的基因型分布情況及臨床意義。方法 采用基因芯片技術(shù)對(duì)134例患者宮頸上皮細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行23種基因型別的檢測(cè)，并對(duì)受檢者進(jìn)行相關(guān)資料分析。結(jié)果 134例患者進(jìn)行23種HPV基因分型檢測(cè)，HPV感染陽性患者60例，感染率44.78%(60/134)，其中單一型HPV感染率為30.60%(41/134)；多型HPV感染率為14.18%(19/134)；除HPV73型沒有感染外，其余22種型別均有感染。結(jié)論 單一型HPV16型和單一型HPV58型是HPV感染的主要基因型別?；驍U(kuò)增芯片技術(shù)一次可檢測(cè)23種基因型，特異性強(qiáng)，敏感性高，對(duì)女性HPV感染基因型分布的病因?qū)W研究具有重要意義。

人乳頭瘤病毒(HPV);基因分型;基因芯片技術(shù)

宮頸癌是目前人類所有癌癥中唯一病因明確的癌癥，也是第一個(gè)可防、可控、可干預(yù)治療的癌癥[1-3]。宮頸癌的發(fā)生與HPV感染的關(guān)系十分密切，HPV是一種專門感染人表皮和黏膜鱗狀上皮的病毒，傳播途徑以性行為為主，其次是唾液和皮膚接觸[4]。現(xiàn)研究已證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的主要因素[5-8]。現(xiàn)采用基因擴(kuò)增及基因芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)宮頸上皮細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行23種常見的HPV基因型檢測(cè)，以了解HPV感染和基因型分布的情況，以此分析HPV與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系，為宮頸癌的干預(yù)治療，HPV疫苗及試劑的研發(fā)提供數(shù)據(jù)資料和參考[9]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2012年9月30日至2015年9月30日，因陰道分泌物異常或接觸性出血在我院自愿進(jìn)行HPV基因分型篩查的患者134例，年齡21～64歲，平均年齡(40±4)歲。均已婚，72 h內(nèi)無陰道用藥及性生活，對(duì)其基因分型結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2 儀器與試劑 核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)Applied Biosystems Step One Plus 基因擴(kuò)增儀由杭州輝圖生物科技有限公司提供；分子雜交儀由杭州奧盛儀器有限公司提供；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；干式恒溫器由杭州奧盛儀器有限公司提供；試劑儲(chǔ)存冰箱購自青島海爾特種電器有限公司；微型混合器由海門市其林貝爾儀器制造有限公司提供；微型離心機(jī)由海門市其林貝爾儀器制造有限公司提供，移液器由賽默飛世爾(上海)儀器有限公司提供。HPV分型基因測(cè)試盒購自珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司。每次試驗(yàn)時(shí)需當(dāng)時(shí)配制洗脫液，所需要的濃度均使用蒸餾水調(diào)配。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集及保存:月經(jīng)正常女性，月經(jīng)來潮后10～18 d為最佳檢查時(shí)間；檢查前48 h內(nèi)不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物；檢查前48 h最好不應(yīng)有性生活；檢查前不進(jìn)行醋酸或碘液涂抹。由醫(yī)生以擴(kuò)陰器暴露宮頸口，用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去。將宮頸刷伸入宮頸口處，輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈。慢慢取出宮頸刷，將其放入裝有細(xì)胞保存液的樣本管中。在管口處將多余的刷柄折斷，將刷頭留在樣本管中。旋緊管蓋，并注明編號(hào)和日期。樣本保存后，如若不能馬上檢測(cè)，應(yīng)將樣本置于4℃存放，并在2周內(nèi)完成檢測(cè)。應(yīng)避免保存細(xì)胞樣本反復(fù)凍融。

1.3.2 DNA的提取:震蕩混勻臨床標(biāo)本，使宮頸刷上的宮頸脫落細(xì)胞盡量多的溶解在保存液中，取1 ml轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中(如果發(fā)現(xiàn)樣本有滲漏，要先用衛(wèi)生紙擦干)(轉(zhuǎn)管后換手套)；12 000 r/min，離心10 min，棄上清，留沉淀(宮頸脫落細(xì)胞比重大，獲取宮頸脫落細(xì)胞，HPVDNA存在于脫落細(xì)胞中。上清液使用1 ml移液槍移除；加50 μl樣本處理液(如果能固定樣本處理液，開一個(gè)加一個(gè)。如果不能固定，3個(gè)3個(gè)的加，不要一次性全部開蓋，然后一次性加完)震蕩混勻，在金屬浴中100℃加熱10 min(裂解脫落細(xì)胞的蛋白質(zhì)外殼，便于HPVDNA能游離出細(xì)胞；樣本處理液每次加樣時(shí)要充分混勻，保證取樣中含有均勻的樹脂顆粒)；加熱后12 000 r/min，離心10 min，目標(biāo)DNA片段在上清，備用；陽性對(duì)照、陰性對(duì)照融化后可直接使用。由于不同原因，有些臨床樣本中含有太多的血液，因?yàn)檠t蛋白的存在對(duì)PCR系統(tǒng)，特別是對(duì)Taq酶的催化效率有影響，所以如果不加以控制，可能對(duì)后面的診斷結(jié)果有影響，出現(xiàn)這種情況的處理方法是將細(xì)胞保存管在震蕩器上震蕩時(shí)間長(zhǎng)些，吸取1 ml臨床樣本，離心收集細(xì)胞后，再用滅菌的0.9%氯化鈉溶液漂洗1次。由于患者有不同程度的婦科炎癥，加上部分醫(yī)生取樣不規(guī)范，可能會(huì)導(dǎo)致提取前的臨床樣本黏度太大，影響操作。處理方法是將細(xì)胞保存管在震蕩器上震蕩時(shí)間長(zhǎng)些，不要取黏液，將取樣刷頭去除，吸取瓶底部液體，另要求醫(yī)生在取樣時(shí)盡量規(guī)范。

1.3.3 PCR擴(kuò)增:取出直用型PCR反應(yīng)液，在室溫下融化并2 000 r/min離心10 s備用。按順序放置，取上述制備的樣本上清液10 μl，按順序加入上述PCR管中；取10 μl模板之前，更換手套。取10 μl DNA模板，獲取有效的DNA，便于擴(kuò)增到有效的DNA產(chǎn)物。操作過程盡量迅速，能更有效的避免氣溶膠污染。將上述PCR擴(kuò)增管2 000 r/min離心10 s，避免管壁掛珠；按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50℃ 2 min，95℃ 15 min，94℃ 30 s，45℃ 1 min，72℃ 30 s，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后，4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 雜交、孵育和顯色:將雜交液，BW反應(yīng)液取出，融化；將100×洗滌液A和200×洗滌液B稀釋成1×工作液，全自動(dòng)基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)使用前調(diào)試。揭開芯片保護(hù)膜，取 20 μl PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入至芯片表面，然后取100 μl直用型雜交液(提前10 min左右從冰箱拿出，室溫融化)加入芯片表面，混勻；覆蓋芯片表面；加樣后的芯片在45℃雜交儀上雜交45 min，然后在室溫下放置5 min，使其冷卻至室溫(能確保HPVDNA分子能夠有效的與探針結(jié)合)；用預(yù)熱至(50±1.5)℃的1×洗滌液A在自動(dòng)洗脫儀內(nèi)進(jìn)行洗脫，浸泡洗脫2 min；用離心機(jī)將芯片表面液滴吹干。取直用型BW反應(yīng)液適量(100～110 μl)覆蓋于芯片表面，并在35℃下反應(yīng)15 min(BW反應(yīng)液中的親和素一端與結(jié)合好HPVDNA分子的探針上的生物素進(jìn)行有效的結(jié)合)；用預(yù)稀釋的1×洗滌液B(室溫)，洗滌芯片3次；用離心機(jī)吹干芯片表面；將直用型顯色液2～3滴(100～110 μl)滴加在干燥的芯片表面，并使其覆蓋全片，避光35℃下反應(yīng)10 min；用預(yù)稀釋的1×洗滌液B迅速?zèng)_洗芯片3次，離心機(jī)吹干芯片表面后即可觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 HPV基因分型檢測(cè)結(jié)果 134例患者進(jìn)行23種HPV基因分型檢測(cè)，陽性60例，陰性74例，HPV感染率44.78%(60/134)，其中單一型HPV感染41例，占總感染率的30.60%(41/134)；多型HPV感染19例，占總感染率的14.18%(19/134)，提示以單一型HPV感染為主。除HPV73型沒有感染外，其余22種型別均有感染。單一型感染中HPV16型和HPV58型均有5例，是主要的感染型別；其次是HPV51型4例；再次HPV33、HPV52、HPV53、HPV56各3例；HPV6、HPV11、HPV18、HPV68各2例；二型感染8例：HPV53、6，HPV6、43，HPV45、58，HPV52、59，HPV6、58，HPV16、81，HPV16、58，HPV16、6；三型感染7例：HPV52、11、42，HPV31、51、53，HPV33、52、56，HPV53、66、6，HPV35、52、53，HPV11、51、56，HPV6、16、35，四型感染1例：HPV31、33、59、83，五型感染2例：HPV33、51、52、6、43，HPV52、53、56、58、6；還出現(xiàn)了1例罕見的八型感染：16、31、33、35、59、68、82、83。其中HPV35、82、83型只出現(xiàn)在多型感染中。60例HPV陽性患者檢出不同型別數(shù)合計(jì)88次，對(duì)多重感染者，各型別的陽性率重復(fù)計(jì)算[5]。

2.2 不同年齡HPV型別感染情況 20～29歲、30～39歲、40～49歲和50～60歲4組HPV陽性患者數(shù)比較，40～49歲最多46例，20～29歲最少只有6例，由此可見40～49歲是HPV易感年齡段，60例患者不同年齡段HPV型別感染情況。見表1。

3 討論

有研究顯示，宮頸癌及其癌前病變主要是HPV感染引起的，宮頸癌患者中99.7%的人均能檢測(cè)到HPV DNA，全球超過2/3的宮頸癌病例是由高危型HPV感染引起[10-13]。另有報(bào)道表明約80%以上有性行為的女性在其一生的某個(gè)階段都曾感染過HPV，絕大數(shù)的感染者在感染后1～2年均能自行消退，只有極少數(shù)持續(xù)HPV感染，從而誘發(fā)宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[7,14]。

本研究表明：(1)134例患者進(jìn)行23種HPV基因分型檢測(cè)，HPV感染率為44.78%(60/134)，其中單一型HPV感染率的30.60%(41/134)；多型HPV感染率為14.18%(19/134)；提示以單一型HPV感染為主。單一型中HPV16型和HPV58型感染為主；其次是HPV51型，多型感染以二型感染為主，且除HPV73型沒有感染外，其余22種型別均有感染。所有88人次HPV感染的患者中有83例都伴有高危型HPV感染，感染率94.32%(83/88)。(2)女性生殖道存在著一條HPV感染通道，宮頸是其通道中HPV感染最高的部位，也是最易感部位[15]。(3)88次不同型別HPV感染的患者中，除一位感染HPV11型的患者是64歲以外其他患者均≤60歲。20～29歲占6.8%(6/88)、30～39歲占22.7%(20/88)、40～49歲占53.4%(47/88)、50～60歲占17.1%(15/88)。提示HPV感染主要集中在40～50年齡段[16]。此年齡段女性開始進(jìn)入圍絕經(jīng)期，是正常的生理變化時(shí)期，泌尿生殖系也發(fā)生改變，生殖器官開始萎縮，黏膜變薄，此時(shí)的宮頸比較容易被感染，處于這個(gè)年齡段的女性應(yīng)定期篩查HPV。(4)本研究為HPV感染的預(yù)防、治療，疫苗和診斷試劑的研發(fā)以及分子流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)。目前與宮頸癌相關(guān)的其它高危因素也比較明確，主要有過早或不潔的性行為，分娩因素及性傳播疾病導(dǎo)致的宮頸炎對(duì)宮頸的長(zhǎng)期刺激等，對(duì)于有上述高危因素的女性，應(yīng)盡量進(jìn)行HPV分型檢測(cè)[17]。

表1 60例患者不同年齡段HPV型別感染情況 例

注：1例64歲患者僅感染HPV11型

綜上所述，HPV檢測(cè)技術(shù)可了解患者是否存在與宮頸癌關(guān)系密切的HPV感染[18]。通過宮頸上皮細(xì)胞HPV基因型檢測(cè)，宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及宮頸活組織檢查等，已使很多國(guó)家的女性宮頸癌的發(fā)病率呈下降趨勢(shì)?？傊?，在宮頸癌及癌前病變的篩查中，HPV分型檢測(cè)發(fā)揮了重要的意義[19,20]。

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