沉默KLF4表達(dá)對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2生物學(xué)行為的影響

李濤 牛麗娟 劉文宣 楊磊 李曼 曹丹丹 彭亂順

·論著·

沉默KLF4表達(dá)對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2生物學(xué)行為的影響

李濤 牛麗娟 劉文宣 楊磊 李曼 曹丹丹 彭亂順

目的 篩選有效沉默KLF4基因表達(dá)的siRNA，觀察KLF4基因沉默對(duì)人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2生物學(xué)行為的影響。方法 設(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對(duì)人KLF4基因的3對(duì)siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)，轉(zhuǎn)染人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2，以轉(zhuǎn)染非特異siRNA作為陰性對(duì)照。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT- PCR(Real-time RT-PCR )和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，篩選出沉默KLF4效果最好的1個(gè)siRNA,將其轉(zhuǎn)染入HSC-LX2后，用MTT法檢測KLF4沉默對(duì)HSC-LX2增殖的影響。采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的轉(zhuǎn)化生長因子1 (transforming growth factor，TGF-1)、白介素1(interleukin-1，IL-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達(dá)情況。結(jié)果 Real-time RT- PCR和western blot均顯示siRNA3沉默效果最好。故后續(xù)試驗(yàn)均采用siRNA3沉默KLF4的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染siRNA3，12 h、24 h和48 h后，細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯下降。ELISA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA3，48 h以后，TGF-β1、TNF-α、IL-1β表達(dá)量也明顯降低。結(jié)論 siRNA3可有效沉默KLF4基因表達(dá)，KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖，影響其生物學(xué)行為，使細(xì)胞中的促進(jìn)膠原表達(dá)的三種細(xì)胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表達(dá)量下降。

人肝星狀細(xì)胞；KLF4；轉(zhuǎn)化生長因子β1；腫瘤壞死因子α；白介素1

肝纖維化過程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是其核心環(huán)節(jié)。各種因素通過不同方式和途徑作用于肝臟中的HSCs，導(dǎo)致其生物學(xué)行為及功能變化，引起肝纖維化[1]。因此，如果能夠抑制HSCs的行為和功能變化，就可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。KLF4是Krüppel樣因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族的重要成員，具有調(diào)節(jié)某些細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等重要功能[2]。KLF4是否會(huì)對(duì)HSCs的細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，目前還缺乏此方面的研究。本研究觀察沉默KLF4表達(dá)是否可以抑制HSCs的行為和功能變化，減少其致纖維化的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素1(interleukin-1，IL-1)的分泌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人肝星狀細(xì)胞HSC-LX2購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院細(xì)胞中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購自美國GIBCO公司；Liprofectamine 2000、Trizol reagent購自美國Invitrogen公司；SYBR Green Real-Time試劑盒購自北京百泰克公司；M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；TGF-β1,IL-1β，TNF-α ELISA試劑盒購自上海ExCellBio 公司；兔抗人KLF4、兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG購自美國Rockland公司。

1.2 方法

1.2.1 沉默人KLF4基因siRNA序列的設(shè)計(jì):參考Genebank中人KLF4基因序列，依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則選取三條可能的序列作為目標(biāo)序列。同時(shí)設(shè)計(jì)一條與人KLF4 mRNA無同源性的siRNA作為陰性對(duì)照。交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。見表1。

表1 siRNA序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HSC-LX2細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至合適匯合度時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞:采用細(xì)胞懸液法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染當(dāng)日，將對(duì)數(shù)生長期HSC-LX2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。根據(jù)lipofectamine 2000的Protocol分別配置A、B液。A: 250 μl Opti-MEM+5 μl siRNA，室溫靜置5 min,B: 250 μl Opti-MEM+5 μl Lipfectamine 2 000混合，室溫靜置20 min。將6×105個(gè)細(xì)胞/孔細(xì)胞懸液與轉(zhuǎn)染混合物分別加入35 mm的小皿中，培養(yǎng)液補(bǔ)齊體積至1.5 ml。 5% CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12 h后換液。分別于轉(zhuǎn)染后24 h和48 h提取細(xì)胞RNA和蛋白檢測KLF4沉默效果以及細(xì)胞生物學(xué)行為檢測。

1.2.4 Real time RT-PCR檢測HSC-LX2中KLF4 mRNA表達(dá):轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后用PBS清洗細(xì)胞，每孔加入1 ml Trizol，充分裂解，將裂解液轉(zhuǎn)至EP管中，加入200 μl氯仿；4℃，12 000 r/min離心15 min，把上層無色液相移入新的EP管，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置30 min；4℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，洗滌沉淀；4℃，5 000 r/min離心3 min，倒出液體；室溫晾干，加入DEPC 水20 μl溶解。將細(xì)胞總RNA 2 μg，采用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green Real-Time試劑盒，對(duì)反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA進(jìn)行Real time RT-PCR檢測，選取2 μl cDNA于20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)在Rotor-GeneTM 6000(Corbett)中進(jìn)行，循環(huán)條件為94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s 共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用Primer 3.0軟件，設(shè)計(jì)所需片段的擴(kuò)增引物，由華大基因公司合成與純化，序列如下:人KLF4上游引物序列：5’-ATCTTTCTCCACGTTCGCGT-3’下游引物序列：5’-GGAAGTCGCTTCATGTGGGA-3’；人GAPDH上游引物序列：5’-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’下游引物序列：5’-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT -3’。每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值為Ct值，用儀器自帶軟件進(jìn)行熒光定量分析，計(jì)算出△Ct值，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法比較目的基因mRNA的表達(dá)變化。

1.2.5 Western blot法檢測HSC-LX2中KLF4蛋白表達(dá):轉(zhuǎn)染siRNA 48 h后用PBS清洗細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞裂解物，移入EP管；離心，12 000 g,15 min，取上清液加入2×loading buffer，100℃煮沸5 min，取上清待用。取細(xì)胞總蛋白80 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠120 V電壓進(jìn)行電泳分離，之后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜置于5%脫脂奶粉(0.05%TBST配制)中封閉1 h，分別加入兔抗人KLF4 (1∶500稀釋)，兔抗人β-actin(1∶3 000稀釋)孵育PVDF膜，4℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。利用TBS配制的紅外染料標(biāo)記的二抗 IRDye800 Anti-Rabbit IgG(1∶15 000稀釋)孵育PVDF膜，室溫1 h。TBS洗膜3次，每次10 min。利用Odyssey掃描儀對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描顯影并保存圖像。

1.2.6 MTT法測定細(xì)胞活力變化:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度104/ml，加入96孔板，每孔加入100 μl，邊緣孔用無菌PBS填充，5% CO2，37℃孵育，過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染干預(yù)結(jié)束后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5% MTT)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。之后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對(duì)照孔(細(xì)胞、轉(zhuǎn)染試劑、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490)×100%。

1.2.7 ELISA法檢測HSC-LX2培養(yǎng)液中TGF-β1、TNF-a和IL-1β的表達(dá):按照試劑盒要求，將細(xì)胞培養(yǎng)液1 000 g離心10 min，收集上清用于檢測。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μl，37℃溫育2 h。 棄去液體，每孔加檢測溶液A工作液100 μl，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，洗板3次， 每孔加檢測溶液B工作液100 μl，37℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，37℃，避光顯色，每孔加終止溶液50 μl，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度值。根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

2 結(jié)果

2.1siRNA對(duì)HSC-LX2細(xì)胞KLF4的沉默效果 三條siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)以及陰性對(duì)照NcsiRNA分別轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞24h后，應(yīng)用Real-timeRT-PCR檢測HSC-LX2中KLF4的mRNA表達(dá)情況。應(yīng)用2-ΔΔCt法比較KLF4mRNA在各組HSC-LX2中的表達(dá)情況。以NcsiRNA組為對(duì)照組，則siRNA1組、siRNA2組和siRNA3組相對(duì)于對(duì)照組的KLF4mRNA的表達(dá)分別是(0.695±0.034)、(0.602±0.046)和(0.313±0.033)(P<0.05)?？梢姡瑂iRNA3組對(duì)KLF4mRNA的沉默效果最好。采用相同方法轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞后48h，應(yīng)用westernblot法檢測HSC-

LX2中KLF4的蛋白表達(dá)情況。與內(nèi)參蛋白β-actin相比，3對(duì)siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)組KLF4 蛋白表達(dá)分別是(0.614±0.046)、(0.586±0.043)和(0.322±0.031)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mRNA的結(jié)果類似，siRNA3組對(duì)KLF4 蛋白的沉默效果最好。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用siRNA3沉默KLF4的表達(dá)。見表2，圖1。

組別KLF4mRNA(2-ΔΔCt)KLF4蛋白(protein/β?actin)對(duì)照組1．006±0．0120．912±0．032siRNA1組0．659±0．034?0．614±0．046?siRNA2組0．602±0．046?0．586±0．043?siRNA3組0．313±0．033?0．322±0．031?

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1westernblot檢測轉(zhuǎn)染三種siRNA48h后HSC-LX2中KLF4的蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2KLF4沉默對(duì)HSC-LX2細(xì)胞活力的影響siRNA3轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞后，同對(duì)照組(細(xì)胞活力定義為100%)比較，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在12h、24h和48h，siRNA3組細(xì)胞活力分別降為(75.56±3.56)%,(52.35±2.34)%和(50.14±2.41)%(P<0.05)。見表3。

組別12h24h48h對(duì)照組100100100NcsiRNA組101．25±1．35100．69±1．22101．56±2．31siRNA3組75．56±3．56?52．35±2．34?50．14±2．41?

注：與NcsiRNA組比較，*P<0.05

2.3KLF4沉默對(duì)HSC-LX2細(xì)胞上清液細(xì)胞因子分泌的影響siRNA3轉(zhuǎn)染HSC-LX2細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，TGF-β1表達(dá)量降到(52.42±8.14)pg/ml,TNF-α表達(dá)量下降到(35.16±4.11)pg/ml，IL-1β表達(dá)量下降到(41.34±5.73)pg/ml，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別TGF?β1TNF?αIL?1β對(duì)照組178．28±20．3148．41±5．4380．15±6．24siRNA3組52．42±8．14?35．16±4．11?41．34±5．73?

注：與NcsiRNA組比較，*P<0.05

3 討論

RNA干擾現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程[3]。細(xì)胞中的雙鏈RNA特異性的核酸酶Dicer將雙鏈RNA裂解成大約21個(gè)核苷酸組成的siRNA，然后siRNA作為媒介引起特異性地降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，啟動(dòng)基因沉默機(jī)制。RNA干擾是目前相對(duì)成熟的靶基因沉默技術(shù)，可以高效、特異和持續(xù)的沉默細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá)。雖然理論上任何21個(gè)核苷酸的mRNA序列都可以設(shè)計(jì)作為siRNA序列，但是他們的沉默效率相差很大。造成這樣差異的原因很多，包括mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾，結(jié)合能的大小等[4]。如果mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，則siRNA很難與其結(jié)合，則會(huì)嚴(yán)重影響siRNA的干擾效率。因此，針對(duì)靶基因的有效、特異的siRNA序列的選擇是決定沉默效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。本研究中我們依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了針對(duì)人KLF4mRNA序列從909到1 702位點(diǎn)的3個(gè)可能的序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)作為目標(biāo)序列。同時(shí)設(shè)計(jì)一條與人KLF4mRNA無同源性的siRNA作為陰性對(duì)照。Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示siRNA1組、siRNA2組和siRNA3組相對(duì)于對(duì)照組的KLF4mRNA的表達(dá)都有明顯下降，其中siRNA3組對(duì)KLF4mRNA的沉默效果最好。同樣，westernblot的結(jié)果與Real-timeRT-PCR結(jié)果類似。所以，篩選出沉默KLF4效果最好的siRNA3。

KLF4在細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。根據(jù)細(xì)胞組織學(xué)類型的不同，KLF4起到促進(jìn)或者抑制增殖的作用[7]。例如在結(jié)直腸癌，子宮頸癌，卵巢癌，胰腺導(dǎo)管癌，肺癌，膀胱癌，胃癌等的表達(dá)是降低的。而在乳腺癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌等的表達(dá)卻是增加的。并且，在肝細(xì)胞癌中的報(bào)道目前還存在爭議[8]。所以，本部分研究沉默HSC-LX2中的KLF4表達(dá)，觀察其對(duì)HSC-LX2增殖的作用。結(jié)果顯示KLF4沉默可以抑制HSC-LX2的增殖活化，故可能減輕肝纖維化。HSC-LX2在肝纖維化過程中可以表達(dá)很多細(xì)胞因子，促進(jìn)纖維化的進(jìn)展。例如TGF-β1、TNF-α、IL-1β等，這些細(xì)胞因子在纖維化的發(fā)生以及炎性反應(yīng)的持續(xù)方面發(fā)揮了重要的作用。TGF-β1是目前公認(rèn)的最重要的致纖維化因子[9]。研究顯示抑制TGF-β1的表達(dá)，可以明顯改善纖維化動(dòng)物模型的纖維化程度。TGF-β1基因敲除鼠與正常對(duì)照鼠比較，在慢性肝損傷中ECM的合成明顯減少[10]。雖然在肝臟中kupffer細(xì)胞，膽管細(xì)胞等都能分泌TGF-β1，但是HSC-LX2自分泌的TGF-β1在肝纖維化中的作用更加明顯[11]。本研究顯示KLF4基因沉默可以明顯減少HSC的TGF-β1分泌。TNF-α和IL-1β是重要的促炎因子，研究顯示減少TNF-α的表達(dá)，可以顯著改善各種原因?qū)е碌膭?dòng)物模型的肝損傷程度[12]。此外，IL-1β可以保護(hù)TGF-β1 和TNF-α不被蛋白酶水解，調(diào)節(jié)其生物活性和生物利用度，增加局部的炎性反應(yīng)，因此促進(jìn)慢性肝纖維化[13]。本部分研究也顯示TNF-α和IL-1β的表達(dá)也有明顯的減少，說明KLF4基因沉默可以減少HSC的TNF-α和IL-1β分泌，減少炎性反應(yīng)，從而減輕肝臟的纖維化程度。

綜上所述，通過沉默KLF4表達(dá)，可以抑制HSC-LX2的增殖，影響其生物學(xué)行為，使細(xì)胞中的促進(jìn)膠原表達(dá)的三種細(xì)胞因子TGF-β1、TNF-α及IL-1表達(dá)量下降，減輕肝纖維化程度，為肝纖維化的防治提供了新的靶點(diǎn)。

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Effects of silencing KLF4 expression on biological behaviors of HSC-LX2 in vitro

LITao*,NIULijuan,LIUWenxuan*,etal.

*DepartmentofEpidemiologyandHealthStatistics,PublicHealthCollege,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China

Objective To screen the siRNA which can effectively silence KLF4 expressions, and to observe the effects of KLF4 gene silence on biological behaviors of LX2 in human hepatic stellate cells (HSC-LX2).Methods The three pairs of siRNAs (siRNA1,siRNA2,siRNA3)targeting at human KLF4 mRNA were designed and chemically synthesized, then which were transfected into HSC-LX2. The expression levels of KLF4 mRNA and protein were detected by Real-time fluorescent quantitative PCR (Real-time RT-PCR) and Western Blot,respectively,with the nonspecific siRNA transfected into HSC-LX2 being regarded as negative control group. One of the siRNAs with the best effects of silencing KLF4 expression was selected,then which was transfected into HSC-LX2, the effects of KLF4 silence on cell proliferation of HSCs were measured by MTT.Moreover the expression levels of transforming growth factor (TGF-1),interleukin-1 (IL-1),tumor necrosis factor-α (TNF-α) in supernatant of cell culture were detected by ELISA.Results The examination results by Real-time RT-PCR and Western Blot showed that the silencing effect of siRNA3 was the best,thus,which was used in the subsequent experiments.MTT assay suggested that the cell vitalities were significantly decreased at 12h, 24h,48h after siRNA3 transfection, as compared with those in negative control group. ELISA assay showed the expression levels of TGF-1, TNF-α,IL-1 were obviously decreased at 48h after transfection, as compared with those in negative control group.Conclusion The siRNA3 can effectively silence KLF4 expression,and KLF4 gene silence can inhibit the cell proliferation of HSC-LX2 and can affect its biological behaviors to decrease the expression levels of TGF-1, TNF-α and IL-1.

human hepatic stellate cells; KLF4; TGF-β1；TNF-α；interleukin-1

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.005

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150627)

050017 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室(李濤、劉文宣、楊磊、李曼、曹丹丹)；河北省石家莊市第三醫(yī)院腫瘤科(牛麗娟)，老年病科(彭亂順)

彭亂順，050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院老年病科；

E-mail：litao771018@163.com

R 329.447

A

1002-7386(2017)07-0981-04

2016-01-19)