人類miR-425靶基因預測及生物信息學特征分析

許宇彪 楊建榮 李碧錦 何二松 林昌榮 莫凱迪

·論著·

人類miR-425靶基因預測及生物信息學特征分析

許宇彪 楊建榮 李碧錦 何二松 林昌榮 莫凱迪

目的 采用生物信息學工具分析人類miR-425(has-miR-425)的轉錄調控、靶基因功能和蛋白-蛋白互作，為研究其在細胞調控過程中的作用提供理論依據。方法 應用miRBase、UCSC Genome Browser等數據庫，分析has-miR-425在不同物種的序列情況，以及在基因組上下游10kb以內的CpG島分布情況、轉錄起始位置(TSS)、轉錄因子結合位置(TFBS)等；選擇TargetScan、PicTar、MiRanda三種計算方法預測has-miR-425的靶基因，取三個預測結果的交集靶基因分別進行注釋描述和富集分析。采用STRING軟件對交集靶基因進行蛋白與蛋白互作網絡分析。結果 has-miR-425序列在人、大鼠、獼猴、黑猩猩之間呈現(xiàn)高度保守性；has-miR-425可能具有獨立的啟動子。共預測到319個潛在的靶基因，這些靶基因主要參與蛋白去磷酸化、細胞氮化合物反應、氮化合物反應等生物學過程；主要分子功能為酶結合、轉移酶活性、金屬離子結合等；主要細胞組成為：膜結合細胞器、細胞內膜有界細胞器、細胞核等。蛋白-蛋白互作分析顯示靶基因中PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關聯(lián)度最高。結論 通過對has-miR-425轉錄調控元件、靶基因的分析，為has-miR-425在細胞調控中的功能與調控機制提供了重要的理論依據。

miR-425；轉錄調控；靶基因預測；生物信息學

miRNA是一類存在于真核生物體內長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過與靶基因的mRNA3’端非編碼區(qū)完全或不完全互補配對，進而降解靶基因mRNA或抑制mRNA翻譯，實現(xiàn)在轉錄后水平的基因調控作用[1,2]。miRNA參與調節(jié)細胞分化、增殖、凋亡、致癌、抑癌、激素分泌等多種生物學過程，具有廣泛的生物學活性[3]。人類miR-425(has-miR-425)定位于染色體上的1p13.3，廣泛表達于人體多個組織，在肝臟、肺、免疫系統(tǒng)、胃腸道、心臟等組織表達量相對較高，參與多種生物學過程并與多種疾病的發(fā)生密切相關[4]。has-miR-425部分靶基因已鑒定，但這些靶基因調控機制及生物學功能尚不完全清楚。本文應用生物信息學分析方法對has-miR-425的功能和靶基因進行系統(tǒng)分析整理，為后續(xù)深入研究提供理論指導和實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 miR-425轉錄情況分析 應用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等在線工具，分析miR-425在基因組上下游10 kb以內的CpG島分布情況；應用UCSC Genome Browser、Promoterscan等在線工具，分析miR-425在基因組上游10 kb以內可能的轉錄起始位置(TSS)及可能的polyA信號位置；應用PromoterScan、CBRC的TFSEARCH數據庫等在線工具，分析miR-425在基因組上游10 kb以內可能的轉錄因子結合位置(TFBS)；應用NCBI Mapviewer、miRbase等在線分析工具，分析miRNA所在區(qū)域的EST數據。

1.2 miR-425潛在靶基因預測 選擇miRbase(http://www.mirbase.org/)查找miRNA序列，選擇miRWalk (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/genepub.html)網址，該網站整合了TargetScan、PicTarl、miRanda等數據庫，選中TargetScan、PicTarl、miRanda三種數據庫分別預測miR-425的潛在靶基因，得出的結果即為3種數據庫得出的交集。

1.3 靶基因功能分析 將miR-425的交集靶基因提交Gene Ontology (http://geneontology.org/)數據庫進行基因功能富集分類和GO注釋描述，分別提取基因的GO生物學過程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和細胞組成(Cellular Component)。

1.4 蛋白-蛋白互作分析 將miR-425的交集靶基因提交輸入在線分析工具STRING 10.0 (http://www.string-db.org/)進行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI) 網絡分析，分析基因對應蛋白之間的相互作用關系，并計算蛋白間的連接系數(r)和繪制網絡圖。使用Cytoscape 3.2軟件進行交集靶基因的分析，采用BINGO插件進行GO注釋的顯著性分析，并繪制基因間作用圖。通過Fisher精確檢驗計算P值，以P<0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義。

2 結果

2.1miR-425在不同物種序列的保守性比較 經miRBase數據庫分別檢索人、大鼠、獼猴、黑猩猩和馬不同物種成熟microRNA序列，發(fā)現(xiàn)人、大鼠、獼猴、黑猩猩的保守序列相同，而馬的保守序列與上述物種不同，說明miR-425物種間有一定的差異。見表1。

表1 不同物種miR-425序列比較

2.2hsa-miR-425轉錄規(guī)律預測 利用NCBIMapviewer、UCSCGenomeBrowser等在線工具，分析hsa-miR-425上下游10kb內序列特征，結果顯示，其有可能的TSS及眾多TFBS，其上游存在約2 900bp的CpG島，因此推測hsa-miR-425有可能擁有獨立的轉錄單元。見表2。

表2 hsa-miR-425啟動子預測結果(-10 kb～+10 kb)

注： -無； +有

2.3 靶基因功能注釋TargetScan、PicTarl、miRanda三個數據庫預測hsa-miR-425的潛在靶基因，取這些靶基因的交集，共得到319個靶基因，將這些交集靶基因放入在GeneOntology網站進行功能注釋分析。GO功能注釋顯示這些潛在靶基因主要參與蛋白去磷酸化、細胞氮化合物反應、氮化合物反應、神經元分化信號轉導負調控等生物學過程；主要分子功能為酶結合、轉移酶活性、金屬離子結合等；細胞組成為：膜結合細胞器、細胞內膜有界細胞器、細胞核。見表3。

2.4 蛋白-蛋白互作分析 將319個hsa-miR-425交集靶基因放入STRING網站進行蛋白與蛋白互作網絡分析，共得到153個節(jié)點及77條相互關系連接線，其中PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關聯(lián)度最高。見圖1、2,表4。

3 討論

miRNA是近年來分子醫(yī)學領域中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，它在機體發(fā)育和疾病狀態(tài)下功能也越來越引人關注。研究已證實，miRNA調控著人類近1/3基因的功能，幾乎參與一切重要生命活動[5]。但由于miRNA種類和數量較多，且其表達具有顯著的時序性和組織特異性，即在發(fā)育疾病的不同階段或在不同組織細胞中具有特異性表達的特征，僅有少數miRNA的生物學功能得到闡明，因而通過生物信息學對miRNA進行分析快速準確地預測靶基因，正確認識靶基因之間的相互作用對研究miRNA的生物學功能有十分重要的意義。

miR-425已被報道與多種基因的轉錄后調控相關[6]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可以通過激活NF-κB誘導miR-425表達上調，負性調控PTEN進而促進胃癌細胞的增殖和抗凋亡作用，且miR-425啟動子上B結合位點是IL-1β誘導miR-425轉錄激活必需的[7]。在采用芯片技術比較4對高轉移肝細胞患者的癌組織樣本與其相對應的正常組織之間的差異miRNAs時，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，高轉移肝細胞癌中發(fā)現(xiàn)miR-425表達上調[8]。還有研究使用芯片技術篩選與喉鱗狀細胞癌生物學特征密切相關的差異表達miRNA，結果從喉癌的miRNA表達譜中篩選出的轉移相關差異表達miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-425是差異表達倍數較高的miRNA，提示miR-425有可能成為評估喉癌轉移風險的新型分子標志[9]。He等[10]在裸鼠肝癌細胞移植瘤模型中研究證實，CTNNA3能通過抑制Akt信號通路，進而降低細胞增殖核抗原(PCNA)和基質金屬蛋白酶MMP-9，增加細胞周期抑制劑p21(Cip1/Waf1)的表達而達到抑制肝癌細胞增殖、遷移與侵襲而起到抑癌作用，而miR-425z則可與CTNNA3 3'非翻譯區(qū)直接結合并抑制其表達而起到促癌作用，因而miR-425/CTNNA3軸對肝癌的病理機制的闡明和肝細胞癌的治療策略的制定具有潛在的價值。

表3 基因功能注釋和信號通路分析

表4 hsa-miR-425靶基因的蛋白-蛋白互作分析

圖1miR-425預測靶基因功能的層次網絡(節(jié)點大小代表基因數量多少，顏色深淺代表P值大小，顏色越深，P值越小)

圖2miR-425預測靶基因蛋白-蛋白互作網絡圖(每個點代表一個蛋白，連接線代表蛋白間有互作聯(lián)系，連接線越多，互作關系越強)

本研究發(fā)現(xiàn)人類miR-425序列在人、大鼠、獼猴、黑猩猩之間具有高度保守性，提示其可能具有較為強大的生物信息學功能。進一步分析hsa-miR-425上下游10kb內序列特征，結果顯示，其有可能的TSS及眾多TFBS，其上游存在約2 900bp的CpG島，這些結果有助于理解miR-425在調控細胞功能的可能機制。本研究采用TargetScan、PicTarl、miRanda三種計算方法預測miRNA作用的靶基因，并取靶基因的交集進行GO功能注釋，從多層次多角度對hsa-miR-425的預測基因進行描述，揭示了hsa-miR-425靶基因參與的細胞的主要生物學過程、分子功能和在細胞組成的作用，為了解這些靶基因的作用提供了參考依據。最后我們采用蛋白-蛋白互作分析探索hsa-miR-425靶基因對應蛋白的作用關系，發(fā)現(xiàn)PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關聯(lián)度最高，提示這些靶基因在hsa-miR-425的細胞調控過程中可能發(fā)揮較大的作用。

總之，本研究結果揭示hsa-miR-425的序列保守性，生物學功能和靶基因的功能，為全面了解hsa-miR-425的生物學作用提供了重要的生物信息學基礎。然而，由于各種在線工具、數據庫等具有一定的局限性，本研究結果還需要對這些生物學信息預測結果進行進一步的實驗設計和驗證，以期更準確的闡明hsa-miR-425的功能，為其在疾病的診斷、治療和預后提供理論依據和實驗基礎。

1BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell,2004,116:281-297.

2Alvarez-GarciaI,MiskaEA.MicroRNAfunctionsinanimaldevelopmentandhumandisease.JDevelopment2005,132:4653-4662.

3ChristodoulouF,RaibleF,TomerR,etal.AncientanimalmicroRNAsandtheevolutionoftissueidentity.Nature,2010,463:1084-1088.

4LiL,ChenHZ,ChenFF,etal.GlobalmicroRNAexpressionprofilingrevealsdifferentialexpressionoftargetgenesin6-hydroxydopamine-injuredMN9Dcells.NeuromolecularMed,2013,15:593-604.

5LiX,NieJ,MeiQ,etal.MicroRNAs:Novelimmunotherapeutictargetsincolorectalcarcinoma.WorldJGastroenterol,2016,22:5317-5331.

6AvciCB,HarmanE,DodurgaY,etal.Therapeuticpotentialofananti-diabeticdrug,metformin:alterationofmiRNAexpressioninprostatecancercells.AsianPacJCancerPrev,2013,14:765-768.

7 劉軍,厲天瑜,張寧,等.IL-1β誘導的miR-425表達上調對胃癌細胞生長的影響.中華醫(yī)學雜志,2014,99:1889-1893.

8 宋曉,蔡振旭.MicroRNAs的失調在高轉移肝細胞癌中的作用.中華臨床醫(yī)師雜志電子版,2013,7:130-133.

9 李琳,張宗敏,劉宇,等.應用基因芯片檢測喉鱗狀細胞癌甲醛固定石蠟包埋組織microRNA表達譜.中華病理學雜志,2010,39:391-395.

10HeB,LiT,GuanL,etal.CTNNA3isatumorsuppressorinhepatocellularcarcinomasandisinhibitedbymiR-425.Oncotarget,2016,7:8078-8089.

Target gene prediction and bioinformatics characteristics analysis of human miR-425

XUYubiao,YANGJianrong,LIBijin,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,JiangbinHospitalofGuangxiZhuangNationalityAutonomousRegion,Nanning530021,China

Objective To investigate the transcriptional regulation,target gene function and protein-protein interaction of the human miR-425 (has-miR-425) by bioinformatics tools in order to provide theoretical basis for researching its role in cell regulation and control.Methods The has-miR-425 sequences in different species,the distribution of CpG island within 10 KB upstream and downstream in genome,the transcription start sites (TSS) and transcription factor binding position (TFBS) were analyzed by using miRBase,UCSC Genome Browser database.The three calculation methods of targetscan,pictar and miRanda were adopted to predict the target gene of has-miR-425.The intersectional target genes of the three prediction results were analyzed by annotation description and enrichment analysis.The STRING software was used to analyze the intersectional target genes,protein-protein interaction.Results The has-miR-425 sequences were highly conserved among human,rat,rhesus monkey and chimpanzee,and has-miR-425 might have independent promoter.The 319 potential target genes were forecasted,and these target genes were mainly involved in the biological processes such as protein dephosphorylation,cellular response to nitrogen compound and response to nitrogen compound.The molecular functions mainly included enzyme binding,transferase activity,metal ion binding and so on,however, the main cell components were membrane-bounded organelle,intracellular membrane-bounded organelle and nucleus. The protein-protein interaction analysis showed that the correlation degree between PAFAH1B1 and DYNC1I2 and between MAP2K6 and ZAK was the highest.Conclusion The research resullts provide an important theoretical basis for the researches about function and regulation mechanism of has-miR-425 in cell regulation and control through the analysis of has-miR-425 transcriptional regulatory elements and target genes.

miR-425; transcriptional control; target gene prediction; bioinformatics

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.004

項目來源：廣西醫(yī)藥衛(wèi)生自籌經費計劃課題(編號：Z2015076)；廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(編號：桂科攻12239015)

530021 南寧市，廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院普通外科

楊建榮,530021 南寧市，廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院普通外科；

E-mail：1637340358@qq.com

R 349.83

A

1002-7386(2017)07-0977-04

2016-10-17)