系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞PD-L2分子的表達(dá)及其臨床意義①

吳萍萍 沈 冬 郭云娣 張雅琴 傅豐慶 劉翠平 孫 靜

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州市檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州215009)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞PD-L2分子的表達(dá)及其臨床意義①

吳萍萍 沈 冬②郭云娣 張雅琴 傅豐慶③劉翠平③孫 靜

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，蘇州市檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州215009)

目的：分析系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞PD-L2分子的表達(dá)及其與疾病活動(dòng)程度的相關(guān)性。方法：收集26例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及38例健康對(duì)照組外周血，F(xiàn)icoll分離單個(gè)核細(xì)胞后，TRIZOL抽提總RNA，定量PCR分析PD-L2 基因的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD14、PD-L2分子的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其相關(guān)性及與疾病活動(dòng)程度之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果：定量PCR結(jié)果提示系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞PD-L2基因表達(dá)高于健康對(duì)照組(P<0.05)，流式發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞上PD-L2高表達(dá)(P<0.05)，且活動(dòng)期患者表達(dá)高于穩(wěn)定期，并且與疾病的評(píng)分(SLEDAI)呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：免疫分子PD-L2可能參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的進(jìn)程并可能成為疾病預(yù)防及治療的潛在分子。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；PD-L2；SLEDAI

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以自身抗體和免疫復(fù)合物產(chǎn)生為特征的自身免疫性疾病，其主要表現(xiàn)為免疫系統(tǒng)活性增強(qiáng)，臨床以高γ球蛋白血癥、免疫復(fù)合物形成和補(bǔ)體系統(tǒng)激活為主要特征，其產(chǎn)生的自身抗體對(duì)自身抗原有著高度的特異性反應(yīng)?；颊呙庖呦到y(tǒng)中免疫活性細(xì)胞包括T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞的異?；罨菍?dǎo)致免疫紊亂的基礎(chǔ)[1]。

免疫活性細(xì)胞之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過細(xì)胞間的共刺激分子完成。研究已證明淋巴細(xì)胞的活化需要識(shí)別雙信號(hào)系統(tǒng)，第一信號(hào)由TCR與抗原肽-MHC分子復(fù)合物特異性結(jié)合提供，第二信號(hào)由APC與T細(xì)胞表面的共刺激分子相互作用提供。正性共刺激分子(CD28、ICOS、ICAM-1、LFA-3等)和負(fù)性共刺激分子(CTLA4、BTLA、PD-1等)形成了一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，綜合調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在免疫活化和耐受中起關(guān)鍵作用[2-5]。

PD-L2是B7家族第5個(gè)被發(fā)現(xiàn)的新成員,于2001年Tseng[6]和Mueller[7]在研究PD-L1的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。PD-1(Programmed death-1)是PD-L1和PD-L2的共同受體[2]，正如B7-CD28信號(hào)通路一樣,PD-L1/PD-L2-PD-1信號(hào)通路在外周耐受和自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中同樣起著重要的作用。有關(guān)PD-L1在自身免疫性疾病中的作用機(jī)制已有眾多研究報(bào)道，但尚未見有關(guān)PD-L2分子與自身免疫性疾病特別是SLE間的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過Real-time PCR及流式細(xì)胞術(shù)分析PD-L2分子在SLE外周血單核細(xì)胞的分布，并與健康對(duì)照組相比較，為研究該發(fā)分子的生物學(xué)功能及探討其在SLE發(fā)病中的機(jī)制奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 26例SLE患者的外周血來自2014年10月至2015年7月蘇州市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科。所有病人至少符合4個(gè)美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)對(duì)SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且病人在半年內(nèi)均未接受過任何的激素或者免疫治療。在研究開展前，標(biāo)本收集得到了單位倫理委員會(huì)的同意。32例健康對(duì)照組的外周血來自2015年5月參加健康體檢的正常者。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR檢測(cè)PD-L2的表達(dá) Ficoll梯度分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)， TRIZOL抽提其總RNA(TaKaRa，大連)，Oligo-dT反轉(zhuǎn)錄成cDNA后凍存在-20℃以備用。內(nèi)參引物為β-actin，序列為：上游5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC C-3′；下游5′-GAT AGC ACA GCC TGG ATA GCA A3′ 。PD-L2引物序列為：上游5′-GTC AGA TGG AAC CCA GGA CC-3′；下游5′-TAG GCT CCA GAG GTG AGT CC-3′。Real-time PCR中所用的SYBR購自QIGEN公司(德國)，使用PCR兩步法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體為95℃10 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，結(jié)果用Cycel threshold(CT,單個(gè)PCR反應(yīng)達(dá)到的對(duì)數(shù)擴(kuò)增期的循環(huán)數(shù))來表示。將目的基因PD-L2的CT值減去內(nèi)參的CT值得到ΔCT來反映基因的表達(dá)量。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-L2的表達(dá) 利用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞上PD-L2的表達(dá)。1.2.1中利用Ficoll分離的PBMC經(jīng)PBS洗滌后配置成1×106單細(xì)胞懸液，取50 μl分別與3 μl FITC標(biāo)記CD14抗體(美天旎公司，德國)以及APC標(biāo)記的PD-L2(BD公司，美國)抗體共孕30 min，PBS洗滌后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)前注意避光保存，檢測(cè)儀器為BD公司Accuri C6型號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 PD-L2在SLE患者外周血PBMC中高表達(dá) TRIZOL抽提SLE患者及健康對(duì)照組的總RNA反轉(zhuǎn)錄后，PCR可從中擴(kuò)增出PD-L2基因，所用引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約為130 bp(見圖1B)。為檢測(cè)患者與健康人群中PD-L2的表達(dá)差異，我們通過熒光定量PCR擴(kuò)增PD-L2基因。SLE患者組中PD-L2基因CT均值為29.79，相對(duì)內(nèi)參β-actin基因ΔCT值為-0.98；健康人群組中PD-L2基因CT均值為32.04，相對(duì)內(nèi)參β-actin基因ΔCT值為-4.42。SLE患者組中PD-L2基因表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組。(圖2，P=0.0337)。

2.2 PD-L2在SLE患者外周血單核細(xì)胞上高表達(dá) 已有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)PD-L2在靜息的淋巴細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞等上均不表達(dá)，而在活化的單核細(xì)胞上有表達(dá)，為分析SLE患者單核細(xì)胞上PD-L2的表達(dá)情況，我們用FITC標(biāo)記的CD14抗體標(biāo)記單核細(xì)胞同時(shí)用PE標(biāo)記的PD-L2進(jìn)行雙染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE患者單核細(xì)胞上PD-L2表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組。SLE患者單核細(xì)胞上PD-L2的表達(dá)為10.3%，健康對(duì)照組上表達(dá)率為6.76%。兩者具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖3。

2.3 PD-L2的表達(dá)與SLE疾病活動(dòng)程度密切相關(guān) 為分析PD-L2的表達(dá)與SLE疾病活動(dòng)度是否存在相關(guān)性。我們分析了PD-L2的表達(dá)與疾病活動(dòng)程度之間的相關(guān)性。疾病活動(dòng)程度根據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度評(píng)分(SLEDAI)，SLEDAI<6 者判定為穩(wěn)定期病例，SLEDAI>6者判定為活動(dòng)期病例?；顒?dòng)期SLE患者外周血PD-L2表達(dá)明顯高于穩(wěn)定期，且其表達(dá)水平與SLEDAI評(píng)分間有一定相關(guān)性(圖4)。

圖1 SLE患者外周血中β-actin 基因 及PD-L2基因的表達(dá)Fig.1 Expression of PD-L2 and β-actin in peripheral blood of SLE patientsNote: A.The expression of β-actin in PBMC of SLE patients；B.The expression of SLE PD-L2 in PBMC of SLE patients.

圖2 定量PCR檢測(cè)SLE患者與健康對(duì)照組外周血中PD-L2的表達(dá)Fig.2 Expression of PD-L2 through Real-time PCR analysis in PBMC of SLE and healthy controls

圖3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單核細(xì)胞上PD-L2表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組Fig.3 Increased PD-L2 expression on monocytes in peripheral blood of SLE patientsNote: A.Representative flow cytometry of PD-L2 expression on monocytes in the PBMC of healthy controls;B.Representative flow cytometry of PD-L2 expression on monocytes in the PBMC of SLE grougp;C.The average percent of PD-L2 expression on monocytes.

圖4 系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑魏思?xì)胞上PD-L2的表達(dá)與疾病活動(dòng)相關(guān)Fig.4 Correlation of PD-L2 expression on monocytes in SLE and degree of disease activity Note: A.The percentage of PD-L2 positive cells is plotted for RA patients with active disease(n=16) and patients in catabasis(n=10).PD-L2 expression was statistically higher in the active stage than in catabasis(P=0.011 2);B.The percentage of PD-L2 positive cells in SLE patients correlates with their disease activity score(SLEDAI)(P=0.046 1).

3 討論

共刺激分子在免疫應(yīng)答中具有重要作用，其決定了T細(xì)胞活化后的去向：增殖、無能或凋亡[8]。正負(fù)信號(hào)形成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫效應(yīng)或是維持免疫耐受。在這其中PD-L1和PD-L2及其受體PD-1的信號(hào)途徑被認(rèn)為與移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、慢性病毒感染、腫瘤等疾病密切相關(guān)，因此探討該途徑在疾病中的功能是目前研究的熱點(diǎn)[9-11]。

SLE是一類以全身免疫異常而導(dǎo)致多器官受累為特征的疾病，病理表現(xiàn)為大量自身抗體產(chǎn)生和免疫復(fù)合物的沉積。機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)核成分的自身抗體，能與許多自身成分形成免疫復(fù)合物，并在局部激活補(bǔ)體系統(tǒng)，吸引中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，造成局部組織的炎癥損傷。已有部分研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中PBMC存在表達(dá)PD-1及PD-L1異常[12，13]，發(fā)現(xiàn)PD-1受體在患者體內(nèi)表達(dá)下降導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受功能受到影響產(chǎn)生大量自身抗體，而有關(guān)PD-1另一配體PD-L2在SLE患者體內(nèi)的表達(dá)及生物學(xué)功能機(jī)制至今尚未清楚。

為探討PD-L2分子在SLE患者中的中的表達(dá)情況，我們通過熒光定量PCR方法及流式細(xì)胞術(shù)分析該基因在SLE患者外周血PBMC中的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L2在SLE患者體內(nèi)相對(duì)于健康人群明顯高表達(dá)，且活動(dòng)期患者表達(dá)水平明顯高于穩(wěn)定期。PD-1/PD-L信號(hào)通路作為經(jīng)典的T細(xì)胞抑制性信號(hào)，近年來也發(fā)現(xiàn)其對(duì)T細(xì)胞的活化具有一定作用，因此PD-L2在自身免疫病SLE患者外周血中高表達(dá)也具備可能性，若條件允許后期工作應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此工作可能為進(jìn)一步探討PD-L2分子的生物學(xué)功能，為研究SLE 發(fā)病機(jī)制以及尋找分子診斷標(biāo)志和藥物靶標(biāo)提供線索。

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[收稿2016-10-20 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

Expression and clinical significance of PD-L2 molecule on monocytes of peripheral blood in systemic lupus erythematosus

WUPing-Ping,SHENDong,GUOYun-Di,ZHANGYa-Qin,FUFeng-Qing,LIUCui-Ping,SUNJing.

SuzhouVocationalHealthTechnology,SuzhouKeyLaboratoryofLaboratoryMedicine,Suzhou215009,China

Objective:To analyze PD-L2 expression on monocytes of peripheral blood cells in systemic lupus erythematosus(SLE) and it′s correlation with the degree of disease activity.Methods: Peripheral blood of 26 cases of SLE patiens and 38 cases of healthy controls were collected.Peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were isolated and realtime PCR was carried on to analyze the PD-L2 gene expression.At the same time flow cytometry was performed to analyze the CD14 and PD-L2 expression.Results: PD-L2 was significantly up-regulated on monocytes in RA patients than in healthy controls and had correlation with the disease activity and the SLEAI score.Conclusion: These findings help to clarify the function of PD-L2,including its potential role as a biomarker for SLE.

Systemic lupus erythematosus;PD-L2;SLEDAI

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.020

①本文受國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170836)和江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(自身免疫病抗體的挖掘和應(yīng)用)的資助。

吳萍萍(1987年-)，女，實(shí)驗(yàn)員，主要從事分子免疫和臨床免疫學(xué)方面的研究。

及指導(dǎo)教師：孫 靜(1981年-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤免疫和自身免疫病方向研究，E-mail：jsun@szhct.edu.cn

R392.11

A

1000-484X(2017)03-0414-04

②蘇州科技城醫(yī)院，蘇州2151530。

③蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床免疫研究所，蘇州215007。