CEA迷你肽表位基因疫苗誘導(dǎo)小鼠抗腫瘤免疫的研究①

魏海峰 譚 巖 李 丹 劉 磊 米旭光 李首慶 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實驗中心，長春130021)

CEA迷你肽表位基因疫苗誘導(dǎo)小鼠抗腫瘤免疫的研究①

魏海峰 譚 巖 李 丹②劉 磊 米旭光 李首慶 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實驗中心，長春130021)

目的：利用含有CEA625-667基因的單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667免疫小鼠后，觀察其誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)。方法：采用4～6周純系BALB/c小鼠，肌肉注射法分pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667三組免疫小鼠，對其激發(fā)的機體特異性及非特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行研究。流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫小鼠脾細(xì)胞的T細(xì)胞亞群和CD4+/CD8+比值；3H-TdR 摻入法檢測免疫小鼠的特異性淋巴細(xì)胞增殖；Western blot雜交及ELISA法檢測免疫小鼠血清中的CEA特異性抗體；ELISA法檢測免疫動物脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)IFN-γ、IL-4、GM-CSF的分泌水平。結(jié)果：實驗組與對照組的CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)過基因疫苗免疫的小鼠與天然小鼠相比，其脾細(xì)胞在體外與短肽共孵育之后，會在更短的時間內(nèi)出現(xiàn)更明顯的細(xì)胞增殖；免疫了CEA迷你基因串聯(lián)體腫瘤疫苗的小鼠血清中可以產(chǎn)生低滴度的抗體，提示HTL的活化；免疫小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組，而pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667,pcDNA-triCEA625-667各組IL-4的含量均很低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；迷你基因三倍體疫苗所引發(fā)的增殖效應(yīng)以及釋放細(xì)胞因子的水平均高于迷你基因一倍體，說明我們所采用將目的基因多倍串聯(lián)的抗原改造的方式起到了增強免疫效應(yīng)的作用。結(jié)論：CEA迷你肽表位基因單倍體及三倍體疫苗均不能顯著改變動物體內(nèi)CD4/CD8比值，但均能誘導(dǎo)HTL活化，使被免疫機體T細(xì)胞趨向于Th1效應(yīng)且三倍體疫苗的免疫原性強于單倍體疫苗。

癌胚抗原；迷你基因；基因疫苗；腫瘤生物治療

癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)作為腫瘤相關(guān)抗原，因其在正常組織中極有限的表達(dá)，以及廣泛出現(xiàn)在上皮源性腫瘤細(xì)胞的過量表達(dá)而成為腫瘤生物治療研究的熱點[1,2]。目前以CEA為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療分為主動免疫和被動免疫治療，主動免疫主要指DNA疫苗，被動免疫包括多肽疫苗和抗體治療。其中DNA疫苗因其具有良好的安全性，且作用持久、設(shè)計簡便、產(chǎn)量大、較經(jīng)濟等特點而備受研究者關(guān)注[3]。本研究組前期成功構(gòu)建了含有CEA625-667基因單倍體疫苗pcDNA-CEA625-667及三串聯(lián)體的DNA疫苗pcDNA-triCEA625-667。本次實驗擬將此重組DNA疫苗免疫小鼠，對其激發(fā)的體液免疫和細(xì)胞免疫進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-CEA625-667及pcDNA-triCEA625-667(本室制備并保存)；FITC標(biāo)記的羊抗鼠單克隆抗體、生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(北京鼎國生物公司)；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒、小鼠白介素-4 ELISA試劑盒、小鼠單核-巨噬細(xì)胞克隆刺激因子ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；IMDM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibcobrl公司)；3H-TdR(3H-胸腺嘧啶，中國原子能研究所)；雙色熒光抗體FITC(異硫氰酸熒光素)和PE(藻紅蛋白)標(biāo)記的羊抗鼠單克隆抗體CD3/CD4、CD3/CD8(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；6～8周齡雄性BALB/c小鼠購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物室。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和免疫 4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為3組，每組6只：pcDNA3.0組； pcDNA-CEA625-667組；pcDNA-triCEA625-667組。肌肉注射法免疫動物。濃度為0.95 μg/μl的質(zhì)粒與終濃度3%氫氧化鋁膠懸液1∶1(V∶V)混合，每只小鼠每次接種100 μg質(zhì)粒(溶于0.1 ml氫氧化鋁膠中與質(zhì)?；旌虾罂傮w積0.2 ml)。分兩側(cè)注射與小鼠大腿內(nèi)側(cè)肌群，每隔10 d免疫1次，共免疫4次。

1.2.2 收集免疫動物血清 最后一次免疫后10 d，取小鼠眼血，37℃放置30 min，1 000 r/min離心10 min，取上清-20℃保存。

1.2.3 免疫動物脾細(xì)胞的收集 最后一次免疫后10 d，斷頸處死小鼠，無菌取脾。將脾浸入含10%小牛血清的IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕研磨，紗布過濾后用玻璃試管收集脾細(xì)胞。離心、破紅、重懸、洗滌后并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，用一定體積的完全細(xì)胞培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，使?jié)舛葹?×107ml-1。

1.2.4 小鼠T細(xì)胞亞群檢測 各免疫組小鼠每個樣本取1×106小鼠脾細(xì)胞加入管內(nèi)，用0.1 mol/L、pH7.0 PBS洗滌2次，分別加入熒光標(biāo)記抗體10 μl，振蕩混勻后室溫避光作用20 min。用PBS洗2次后，再加入0.5 ml PBS混勻，上機檢測CD3、CD4、CD8陽性表達(dá)率。

1.2.5 Western blot檢測免疫動物血清中的CEA625-667抗體 取10 μl濃度為0.95 mg/ml的純化短肽CEA625-667行SDS-PAGE電泳，利用半干式轉(zhuǎn)移電泳儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進(jìn)行Western blot，一抗為各免疫組小鼠的1∶100稀釋血清。

1.2.6 ELISA方法檢測免疫動物脾細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4、GM-CSF的含量 各免疫組小鼠每個樣本設(shè)2復(fù)孔，各取脾細(xì)胞1×106孔-1，加入96孔板，事先每孔中加入終濃度為10 μg/ml的CEA625-667短肽(對照孔中不加)，并用IMDM完全培養(yǎng)基，將每孔總體積調(diào)為200 μl，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，置-70℃冰箱中保存待測。IFN-γ、IL-4、GM-CSF的ELISA檢測方法按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.2.73H-TdR摻入法檢測免疫動物特異性淋巴細(xì)胞增殖水平 各免疫組小鼠每個樣本設(shè)3復(fù)孔，各取脾細(xì)胞1×106孔，加入96孔板，事先每孔中加入終濃度為10 μg/ml的CEA625-667短肽(對照孔中不加)，并用IMDM完全培養(yǎng)基，將每孔總體積調(diào)為200 μl，置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后，加入3H-TdR 1.0 Ci/孔，再培養(yǎng)16 h，用多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集于玻璃纖維濾紙上，烤干后將濾紙放入閃爍杯中，液閃儀計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，若方差齊則采用樣本均數(shù)比較的方差檢驗(LSD-t檢驗)；若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(秩和檢驗)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667組和空質(zhì)粒pc-DNA3.0組免疫小鼠的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)，見表1。

2.2 免疫小鼠血清中CEA625-667抗體的Western blot檢測結(jié)果 空質(zhì)粒對照組在6.7 kD處未見陽性蛋白帶，pcDNA-CEA625-667和pcDNA-triCEA625-667免疫組血清在1∶500稀釋度下，與重組CEA短肽結(jié)合，在6.9 kD處可見陽性蛋白帶,見圖1。

2.3 免疫小鼠脾細(xì)胞體外誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌 免疫小鼠脾細(xì)胞在體外用CEA短肽刺激72 h后，檢測IFN-γ、GM-CSF及IL-4的分泌，結(jié)果見表2。CEA短肽刺激可明顯誘導(dǎo)釋放IFN-γ及GM-CSF的水平升高，與不用CEA短肽刺激組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。免疫小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組(P<0.001)，pcDNA-triCEA625-667誘導(dǎo)釋放IFN-γ的水平均高于pcDNA-CEA625-667，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中GM-CSF的含量在pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667組測量值依次增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗組和對照組均未檢測到IL-4分泌。

2.4 免疫動物的特異性淋巴細(xì)胞增殖水平 末次免疫后10 d，取免疫組小鼠脾細(xì)胞與10 μmol/L CEA625-667短肽共孵育96 h后，測細(xì)胞增殖。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)結(jié)果見表3。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各實驗組間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

GroupsCD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+pcDNA-3.052.25±3.0524.57±2.4112.44±3.032.05±0.31pcDNA-CEA625-66753.01±3.7823.45±4.2811.18±3.352.18±0.30pcDNA-triCEA625-66758.72±3.2125.87±3.3114.28±3.501.87±0.24

GroupsConcentrationofIFN-γ(pg/ml)WithpeptideNopeptideConcentrationofGM-CSF(pg/ml)WithpeptideNopeptidepcDNA-3.053.33±6.5265.00±8.25198.50±16.871)23.83±5.05pcDNA-CEA625-667 213.17±13.251)2)147.24±6.79228.17±12.351)18.67±5.53pcDNA-triCEA625-667 335.17±42.761)2)3)190.53±4.98240.67±13.981)15.83±5.21

Note：1)P<0.001 vs no peptide；2)P<0.001 vs pcDNA-3.0 group； 3)P<0.05 vs pcDNA-CEA625-667group.

圖1 免疫小鼠血清中CEA625-667抗體的Western blot檢測結(jié)果Fig.1 Western blot for CEA625-667 hybridized by serum from immuned miceNote: 1.The standard protein marker;2.Recombinant CEA625-667 protein;3.The western blot of pcDNA-3.0 group;4.The Western blot of pcDNA-CEA625-667 group;5.The Western blot of pcDNA-triCEA625-667 group.

GroupsCpmvalueWithpeptideNopeptidepcDNA-3.01590.00±97.281)277.67±74.15pcDNA-CEA625-667 5034.33±178.211)2)239.00±67.60pcDNA-triCEA625-667 7881.67±201.121)2)3)248.33±48.55

Note：1)P<0.001 vs no peptide；2)P<0.001 vs pcDNA-3.0 group；3)P<0.01 vs pcDNA-CEA625-667group.

3 討論

免疫細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子或直接接觸，進(jìn)行細(xì)胞間的相互作用，從而對免疫應(yīng)答進(jìn)行直接或間接的調(diào)節(jié)，當(dāng)機體的免疫系統(tǒng)被某種異種抗原激活后，會表現(xiàn)出CD4+/CD8+比值上升，提示免疫應(yīng)答的正調(diào)節(jié)占優(yōu)勢。在本實驗中疫苗免疫小鼠后，實驗組與對照組的CD4+/CD8+比值無統(tǒng)計學(xué)差異，得到這種結(jié)果的原因可能是多方面的，以往認(rèn)為，CD4+T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，分泌細(xì)胞因子的作用，而CD8+T細(xì)胞則有免疫抑制和細(xì)胞毒性作用。但目前人們已經(jīng)確認(rèn)存在CD4+殺傷性T細(xì)胞[4]，因而不能說CD4+T細(xì)胞一定發(fā)揮上調(diào)作用；而且最近研究表明，抑制免疫應(yīng)答的T細(xì)胞亞群確實存在，但這些細(xì)胞不是CD8+T細(xì)胞，而是CD4+T細(xì)胞[5]。CD8+T細(xì)胞中也還有一類顯示反抑制活性的細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮上調(diào)作用[6]。當(dāng)然，也不能除外我們所構(gòu)建的以表位為基礎(chǔ)的疫苗無法達(dá)到全基因疫苗一樣激活整個免疫系統(tǒng)的免疫效力，或DNA疫苗在體內(nèi)提呈不完全等情況。

本實驗應(yīng)用細(xì)胞增殖實驗以及抗體和細(xì)胞因子的檢測來反映免疫小鼠的HTL效應(yīng)，經(jīng)過DNA免疫的小鼠與天然小鼠相比，其脾細(xì)胞在體外與短肽共孵育之后，會在更短的時間內(nèi)出現(xiàn)更明顯的細(xì)胞增殖。通過對抗體的檢測，我們發(fā)現(xiàn)免疫了CEA迷你基因串聯(lián)體腫瘤疫苗的小鼠血清中可以產(chǎn)生低滴度的抗體，進(jìn)一步證實了CEA迷你肽表位基因疫苗可有效誘導(dǎo)HTL效應(yīng)，激發(fā)機體的特異性免疫。有實驗證明CD4+T細(xì)胞的激活需要抗原遞呈細(xì)胞通過MHC classⅡ提供抗原表位，其標(biāo)志性的改變是B細(xì)胞分泌抗原表位特異性的IgG抗體[7]。由于Th1/Th2類細(xì)胞因子含量體現(xiàn)了Th細(xì)胞輔助其他淋巴細(xì)胞發(fā)揮免疫活性的功能，隨后我們通過對免疫小鼠脾細(xì)胞上清中細(xì)胞因子的檢測，對Th1/Th2類細(xì)胞的活化趨勢做了進(jìn)一步的探討。實驗結(jié)果表示免疫小鼠脾細(xì)胞上清中IFN-γ的含量明顯高于對照組，而pc-DNA3.0、pcDNA-CEA625-667、pcDNA-triCEA625-667各組IL-4的含量均很低，提示了本研究所選用的高親和力Th表位使被免疫機體T細(xì)胞趨向于Th1效應(yīng)。這與Ahlers[8]的實驗結(jié)果相吻合，可能是由于高親和力的Th表位可以產(chǎn)生一個更強的CD40L信號傳導(dǎo)來激活樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-12，而得到一個更加極性化的抗原提呈細(xì)胞，這對誘導(dǎo)出能夠產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞可能是必要的[9]。

與全序列基因疫苗比較，迷你基因疫苗能夠針對特異性抗原表位誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而避免了無關(guān)抗原表位的影響。本研究結(jié)果表明，迷你基因三倍體疫苗所引發(fā)的增殖效應(yīng)以及釋放細(xì)胞因子的水平均高于迷你基因一倍體，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)差異，說明我們所采用的將目的基因多倍串聯(lián)的抗原改造方式起到了增強免疫效應(yīng)的作用。本研究為有關(guān)CEA短小目的基因串聯(lián)疫苗的研制與臨床前實驗奠定了基礎(chǔ)。

[1] Ahn E,Kim H,Han KT,etal.A loss of antitumor therapeutic activity of CEA DNA vaccines is associated with the lack of tumor cells' antigen presentation to Ag-specific CTLs in a colon cancer model[J].Cancer Lett,2015,356(2):676-685.

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[收稿2016-12-09]

(編輯 許四平)

Study on antitumor effect of minigene DNA vaccine derived from Carcinoembryonic Antigen (CEA) gene in mice

WEIHai-Feng,TANYan,LIDan,LIULei,MIXu-Guang,LIShou-Qing,FANGYan-Qiu.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To observe the immunological activity of haploid vaccine and three tandem repeats of minigene DNA vaccine derived from Carcinoembryonic Antigen (CEA) gene.Methods: The immunoreaction was induced by intramuscular injection with pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667and pcDNA-triCEA625-667in BALB/c.Four weeks after injection,the spleen cells and serum were separated respectively from the mice for the in vitro assessment.Changes of the T lymphocytes subset was analyzed by flow cytometry.Lymph proliferation responses were tested by3H-TdR incorporation,IFN-γ，IL-4 and GM-CSF in their cultural supernatants were detected with ELISA and seral IgG antibody against CEA were detected with Western blot and ELISA.Results: The difference of the ratio of CD4+/CD8+of the mice immuned by pc-DNA3.0,pcDNA-CEA625-667or pcDNA-triCEA625-667was not significant.Lymph proliferation responses were more significant in the mice immuned by pcDNA-CEA625-667and pcDNA-triCEA625-667in a shorter time by contrast with na?ve mice.Low tilter IgG antibody against CEA was detected in the antiserum of the mice immuned by repeats of minigene DNA vaccine,which suggested the activation of helper T-cell.ELISA showed that the level of IFNγ in the 3 days culture of the splenocytes was relatively higher in the groups of minigene DNA vaccination than in the control groups,while IL-4 expression was absent in all groups.The immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine pcDNA-triCEA625-667was superior to that elicited by pcDNA-CEA625-667,which showed that any immunogenic inadequacies in minigene presentation can be rectified by linking itself in a string-of-beads vaccine.Conclusion: The haploid vaccine and three tandem repeats of minigene DNA vaccine derived from CEA gene both can not change the ratio of CD4+/CD8+but can induce the activation of helper T-cell and skew T cells toward Th1 response.The immune response level elicited by three tandem repeats of minigene DNA vaccine was superior to that elicited by haploid vaccine.

Carcinoembryonic antigen;Minigene;DNA vaccine;Tumor biological therapy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.03.014

①本文受吉林省科技廳國際合作項目(20140414043GH)、吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團隊項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發(fā)資金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助。

魏海峰(1978年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤基礎(chǔ)及臨床研究，E-mail：whfweb@163.com。

及指導(dǎo)教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤生物治療基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：yq.fang@163.com。

R392 R730.5

A

1000-484X(2017)03-0384-04

②吉林大學(xué)第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長春130021。