對(duì)乙酰氨基酚通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α信號(hào)通路影響HepaRG細(xì)胞線(xiàn)粒體新生

張廷芬，郭家彬，彭 輝，張 麗，袁海濤，殷 健，崔 嵐，趙 君，彭雙清

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071）

對(duì)乙酰氨基酚通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α信號(hào)通路影響HepaRG細(xì)胞線(xiàn)粒體新生

張廷芬，郭家彬，彭 輝，張 麗，袁海濤，殷 健，崔 嵐，趙 君，彭雙清

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071）

目的 探討對(duì)乙酰氨基酚（APAP）對(duì)HepaRG細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）信號(hào)通路介導(dǎo)的線(xiàn)粒體新生的影響。方法 接種HepaRG細(xì)胞并給予生長(zhǎng)培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，替換為分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每天觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并拍照。APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1）處理誘導(dǎo)分化后的HepaRG細(xì)胞24和48 h，MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。Western蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞線(xiàn)粒體新生相關(guān)蛋白PGC-1α、核呼吸因子2（NRF-2）和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM），以及線(xiàn)粒體構(gòu)成蛋白NADH脫氫酶亞基1（ND-1）的表達(dá)。結(jié)果 誘導(dǎo)分化后顯微鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞樣和膽管細(xì)胞樣2種形態(tài)的細(xì)胞。與正常對(duì)照組相比，APAP作用24和48 h后，隨APAP濃度的增加，細(xì)胞存活率不斷降低，其IC50分別5.64和2.65 mmol·L-1。與正常對(duì)照組相比，APAP作用24 h，0.5，1，2和4 mmol·L-1組PGC-1α表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；0.5 mmol·L-1組NRF-2表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），2，4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；1 mmol·L-1組TFAM表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）；0.5，1，2和4 mmol·L-1組ND-1表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 APAP可誘導(dǎo)或抑制HepaRG細(xì)胞的線(xiàn)粒體新生，其機(jī)制可能與PGC-1α通路蛋白表達(dá)有關(guān)。

對(duì)乙酰氨基酚；線(xiàn)粒體；HepaRG細(xì)胞；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ；共激活因子1α；肝毒性

對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）是一種在臨床上廣泛使用的解熱鎮(zhèn)痛非甾體抗炎藥。在治療劑量時(shí)較為安全，但過(guò)量使用，則有可能引起急性肝功能衰竭（acute liver injury，AILD），甚至死亡［1］。目前的研究顯示，線(xiàn)粒體是APAP引起肝毒性的重要靶標(biāo)之一，其毒性機(jī)制是APAP經(jīng)細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶代謝產(chǎn)生有毒的中間代謝產(chǎn)物N-乙酰-對(duì)苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）。正常情況下，NAPQI可被谷胱甘肽（glutathione，GSH）脫毒，但當(dāng)NAPQI過(guò)量GSH被消耗殆盡后，NAPQI將與細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)合，包括多種線(xiàn)粒體蛋白，從而擾亂線(xiàn)粒體功能，引起細(xì)胞毒性［2］。

線(xiàn)粒體新生，又稱(chēng)線(xiàn)粒體生物合成，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）是該過(guò)程的主要調(diào)節(jié)因子，可與下游核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor-1/2，NRF-1/ 2）結(jié)合，然后共激活線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochon?drial transcription factor A，TFAM），從而介導(dǎo)線(xiàn)粒體新生［3］。PGC-1α主要分布在能量需求大的組織或器官。正常生理狀態(tài)下，生理性地調(diào)控線(xiàn)粒體的數(shù)量或形態(tài)；而在外界刺激下，線(xiàn)粒體新生可能會(huì)被激發(fā)，對(duì)線(xiàn)粒體損傷進(jìn)行修復(fù)，或?qū)€(xiàn)粒體丟失（例如線(xiàn)粒體自噬）進(jìn)行數(shù)量補(bǔ)充，從而減輕外界因素引起的線(xiàn)粒體功能障礙［4］。PGC-1α介導(dǎo)的線(xiàn)粒體新生在骨骼肌、心和肝組織均有報(bào)道［5-6］。

HepaRG細(xì)胞是從肝癌患者的非瘤肝組織分離而得的細(xì)胞株。誘導(dǎo)分化后的HepaRG細(xì)胞，具有成熟肝細(xì)胞的表型，含有豐富的CYP450酶系，包括CYP1A2，CYP2B6，CPY2C，CPY2D6，CYP3A4和二相代謝酶以及肝細(xì)胞的特異性蛋白，這些特征都類(lèi)似原代肝細(xì)胞［7--8］。因此，具有原代人肝細(xì)胞特征的HepaRG細(xì)胞是目前極受關(guān)注的肝細(xì)胞模型之一。

有研究顯示，高劑量APAP會(huì)引起線(xiàn)粒體功能損傷，線(xiàn)粒體自噬雖然可清除受損的線(xiàn)粒體，但是會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體數(shù)量減少，整體的線(xiàn)粒體功能損耗［9］。因此，我們推測(cè)PGC-1α介導(dǎo)的線(xiàn)粒體新生可能在此過(guò)程中發(fā)揮作用，彌補(bǔ)丟失的線(xiàn)粒體數(shù)量以及喪失的線(xiàn)粒體功能。Pesce等［10］研究發(fā)現(xiàn)，乙酰基肉毒堿可能通過(guò)PGC-1α調(diào)控線(xiàn)粒體新生，清除因老齡化引起的大鼠肝細(xì)胞內(nèi)功能障礙的線(xiàn)粒體，另外還能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明線(xiàn)粒體新生在肝細(xì)胞中是可以被介導(dǎo)的。因此，本研究以Hep?aRG細(xì)胞為模型觀(guān)察不同濃度的APAP作用下，線(xiàn)粒體新生信號(hào)通路和線(xiàn)粒體呼吸鏈蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而分析APAP對(duì)PGC-1α信號(hào)通路和線(xiàn)粒體新生的影響，探討PGC-1α在APAP引起的肝細(xì)胞線(xiàn)粒體毒性中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

HepaRG細(xì)胞及基礎(chǔ)培養(yǎng)液（MIL700）、生長(zhǎng)添加劑（ADD710）和分化添加劑（ADD720）（法國(guó)Biopredic公司）。MTT（美國(guó)Sigma-Aldrich）。一抗包括PGC-1α（1∶200）和NRF-2（美國(guó)Santa Cruz，1：250），β肌動(dòng)蛋白（英國(guó)Abcam，1∶3000），TFAM（1∶3000），NADH脫氫酶亞基1（NADH de?hydrogenase subunit 1，ND-1）（美國(guó)Proteintech Group，1∶1000），HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔或羊抗小鼠（Abcam，1∶5000）。RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑cocktail、蛋白質(zhì)定量試劑盒、超敏發(fā)光液（北京普利萊有限公司）。配制蛋白電泳緩沖液和轉(zhuǎn)移緩沖液的試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和Sigma公司），配制各種液體所用的水均為純水儀（美國(guó)Milipore，MilliQ）過(guò)濾的超純水。電泳儀（美國(guó)Bio-Rad），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-5200），5417R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)Ep?pendorf），CR3i高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo），CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus），JJT-1300超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司），MCO-18AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo），MK3多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo）。

1.2 HepaRG細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

根據(jù)Biopredic公司提供的細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入ADD710和ADD720配制成生長(zhǎng)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基。按手冊(cè)建議以5×108L-1密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代HepaRG細(xì)胞，培養(yǎng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，2周后待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底時(shí)，將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換為生長(zhǎng)培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基按比例1∶1混合的培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)渡性培養(yǎng)3 d，之后更換為分化培養(yǎng)基，2～3 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)2周，細(xì)胞可完成分化。分化后的細(xì)胞包含2種形態(tài)，直接傳代使用，不進(jìn)行分離。HepaRG細(xì)胞接種后，在倒置顯微鏡下每天觀(guān)察1次，并進(jìn)行拍照。

1.3 MTT法檢測(cè)HepaRG細(xì)胞存活率

將分化后的HepaRG細(xì)胞以2×107L-1的密度接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，棄舊培養(yǎng)液，分別加入不同濃度的APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1），每孔加入0.2 mL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（不接種細(xì)胞，只加等體積培養(yǎng)基）和細(xì)胞對(duì)照組（接種細(xì)胞不加APAP），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別作用24和48 h后，吸出APAP染毒液，每孔加入0.1 mL含15%MTT（5 g·L-1）的培養(yǎng)液，作用3 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入0.15 mL DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處每孔吸光度（A），重復(fù)3次。細(xì)胞存活率（%）=（藥物組A492nm-空白對(duì)照組A492nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A492nm-空白對(duì)照組A492nm）×100%。用SPSS 17.0軟件“Probit regression”法計(jì)算半數(shù)抑制濃度值（IC50）。

1.4 Western蛋白印跡法檢測(cè)蛋白PGC-1α，NRF-2，TFAM和ND-1表達(dá)

將分化后的細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，貼壁24 h后暴露于不同濃度的APAP作用24 h。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，并按1∶50加入蛋白酶抑制劑cocktail，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印和封閉后，加入不同抗體后置于4℃過(guò)夜反應(yīng)，洗膜后，與二抗在室溫下反應(yīng)1 h，再次洗膜后，滴超敏發(fā)光液并置于Tanan化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)并采集圖像。利用Image J 6.0軟件分析各條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA），以β肌動(dòng)蛋白條帶IA作參照，進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HepaRG細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

HepaRG細(xì)胞增殖周期比一般細(xì)胞系長(zhǎng)，經(jīng)歷特定的生長(zhǎng)期和分化期后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化。第2天鏡下觀(guān)察細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭形，約7 d后細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底，細(xì)胞形態(tài)逐漸變得飽滿(mǎn)，仍呈梭形，第11天細(xì)胞長(zhǎng)得十分擁擠，細(xì)胞形態(tài)呈多樣性。接種14 d后開(kāi)始誘導(dǎo)分化，分化后第2天，細(xì)胞形態(tài)并無(wú)明顯變化，分化后第6天視野下出現(xiàn)2種形態(tài)的細(xì)胞，一種體積較小呈圓形為肝細(xì)胞樣細(xì)胞，一種體積較大呈梭形為膽管樣細(xì)胞，分化后第11天，圓形細(xì)胞數(shù)量增多（圖1）。

Fig.1 Cell morphology of proliferation stage（A）and differentiation stage（B）of HepaRG at different time points（200×）.Cell morphology changed significanthy and finally the bottom became confluent（A）.Cells became more crowded and differentiated into two types of cells：hepatocyte-like（? ）and biliary-like（ → ）cells（B）.

2.2 APAP對(duì)HepaRG細(xì)胞存活率的影響

APAP（0.125，0.25，0.5，1，2，4，8和12 mmol·L-1）作用于HepaRG細(xì)胞24 h后，隨著濃度的升高，細(xì)胞存活率從1 mmol·L-1開(kāi)始出現(xiàn)降低，并呈濃度依賴(lài)性降低（r=0.9717，P＜0.05，P＜0.01），IC50為5.64 mmol·L-1；作用48 h后，細(xì)胞存活率從0.25 mmol·L-1開(kāi)始出現(xiàn)降低，并呈濃度依賴(lài)性降低（r=0.9512，P＜0.01），IC50為2.65 mmol·L-1（圖2）。

Fig.2 Effect of acetaminophen（APAP）on viability of HepaRG cells by MTT assay.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（0 mmol·L-1）group.

2.3 APAP對(duì)HepaRG細(xì)胞PGC-1α，NRF-2和TFAM蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，APAP作用24 h后，0.5，1，2和4 mmol·L-1組PGC-1α的蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.01），8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。0.5 mmol·L-1組NRF-2的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），2，4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。1 mmol·L-1組TFAM的蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），4和8 mmol·L-1組顯著降低（P＜0.01）。APAP作用下，PGC-1α信號(hào)通路3個(gè)蛋白的表達(dá)變化總體趨勢(shì)一致，在相對(duì)低濃度時(shí)蛋白表達(dá)升高，在相對(duì)高濃度時(shí)蛋白表達(dá)降低。結(jié)果提示，APAP能誘導(dǎo)或抑制PGC-1α信號(hào)通路蛋白的表達(dá)（圖3）。

Fig.3 Effect of APAP on protein expression of peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α（PGC-1α），nuclear respiratory factor 2（NRF-2）and mitochondrial transcription factor A（TFAM）by Western blotting.HepaRG cells were exposed to APAP for 24 h.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.，n=3.＊P＜0.01＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（0 mmol·L-1）group.

2.4 APAP對(duì)HepaRG細(xì)胞ND-1蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，APAP 0.5，1，2和4 mmol·L-1組ND-1蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.01），并隨APAP濃度的升高ND-1蛋白表達(dá)的增加逐漸減少，8 mmol·L-1組ND-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。提示相對(duì)低濃度APAP可促進(jìn)ND-1蛋白的表達(dá)，有助于線(xiàn)粒體呼吸功能的加強(qiáng)；而相對(duì)高濃度APAP對(duì)ND-1的表達(dá)有明顯的抑制作用，對(duì)線(xiàn)粒體呼吸作用有抑制作用（圖4）。

Fig.4 Effect of APAP on NADH dehydrogenase sub?unit-1（ND-1）protein expression in HepaRG cells by Western blotting.Cells were exposed to APAP for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control（0 mmol·L-1）group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，HepaRG細(xì)胞自然生長(zhǎng)時(shí)的最初形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)梭形，隨著密度的增長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，仍然保持梭形。當(dāng)細(xì)胞完全長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，細(xì)胞形態(tài)因擠壓呈現(xiàn)多樣性。細(xì)胞完全融合7 d后，加入誘導(dǎo)劑分化，在分化后的第6天即可清晰出現(xiàn)2種不同形態(tài)的細(xì)胞，且有立體感，說(shuō)明分化成功，而且隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，2種細(xì)胞的數(shù)量逐步達(dá)到平衡。與常用的HepG2細(xì)胞和Fa2N-4細(xì)胞相比［7］，分化后的HepaRG細(xì)胞保持了許多原代人肝細(xì)胞的重要特征，在化合物代謝、毒性評(píng)價(jià)很多方面都顯示了突出的優(yōu)點(diǎn)。由于APAP在CYP450酶的作用下才能代謝成為有毒代謝產(chǎn)物NAPQI，進(jìn)而與細(xì)胞或線(xiàn)粒體蛋白結(jié)合，干擾細(xì)胞功能，產(chǎn)生毒性作用。本研究選擇誘導(dǎo)分化后的HepaRG細(xì)胞作為細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)相對(duì)低濃度的APAP對(duì)Hep?aRG細(xì)胞的存活率并沒(méi)有顯著影響，而相對(duì)高濃度APAP則可引起HepaRG細(xì)胞死亡，與臨床上過(guò)量APAP引起急性肝細(xì)胞壞死相似。

PGC-1α是目前公認(rèn)的介導(dǎo)線(xiàn)粒體新生的一個(gè)關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄共激活因子，可與NRF-1/2結(jié)合，并一同激活TFAM，促進(jìn)mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，調(diào)控線(xiàn)粒體的新生。在相對(duì)低濃度APAP作用下該通路3種的蛋白表達(dá)均升高，提示有線(xiàn)粒體新生的發(fā)生。在NRF-2和TFAM出現(xiàn)顯著降低時(shí)PGC-1α蛋白表達(dá)仍顯著升高，這可能是因?yàn)镻GC-1α轉(zhuǎn)錄共激活的下游靶標(biāo)不僅僅是NRF-2，還有其他核蛋白。在此，PGC-1α不僅參與調(diào)控線(xiàn)粒體新生，可能還參與調(diào)解其他的應(yīng)激反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，PGC-1α可能與NRF2結(jié)合，參與調(diào)控氧化還原反應(yīng)，控制APAP引起的氧化應(yīng)激［11］。NRF-1/2是核呼吸因子，又是轉(zhuǎn)錄因子，能作用于核基因，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄線(xiàn)粒體呼吸鏈或是mtDNA復(fù)制和翻譯需要的蛋白［12］，例如細(xì)胞色素c亞單位和ATP合酶γ亞單位、ATP合酶β亞單位。本研究結(jié)果顯示，NRF-2對(duì)APAP的毒性作用最為敏感，在1 mmol·L-1時(shí)，其蛋白表達(dá)便開(kāi)始下降，但是TFAM的蛋白表達(dá)是從2 mmol·L-1開(kāi)始下降的，可能是因?yàn)檫@個(gè)過(guò)程中PGC-1α和NRF-1/2共激活TFAM，而本研究?jī)H檢測(cè)了NRF-2，TFAM的蛋白表達(dá)可能更多受NRF-1調(diào)控。

ND-1是呼吸鏈復(fù)合物I（NADH脫氫酶）11個(gè)亞單位之一，是由mtDNA編碼的蛋白，呼吸鏈復(fù)合物I主要是負(fù)責(zé)催化酶和呼吸鏈質(zhì)子泵酶的活性［13］。本研究結(jié)果顯示，在相對(duì)低濃度時(shí)，ND-1蛋白表達(dá)升高，提示APAP對(duì)線(xiàn)粒體呼吸功能有影響，ND-1蛋白表達(dá)量變化間接反映了線(xiàn)粒體新生的發(fā)生，而ND-1蛋白水平變化趨勢(shì)與PGC-1α信號(hào)通路的蛋白水平變化趨勢(shì)一致，從側(cè)面進(jìn)一步證明了PGC-1α確實(shí)參與了線(xiàn)粒體新生。

本研究結(jié)果顯示，在相對(duì)低濃度APAP作用下線(xiàn)粒體新生被激發(fā)，呈適應(yīng)性反應(yīng)，通過(guò)線(xiàn)粒體的新生為細(xì)胞提供更多能量，從而防御APAP可能產(chǎn)生的線(xiàn)粒體毒性作用，而不是我們推測(cè)的線(xiàn)粒體新生可能會(huì)發(fā)生在過(guò)量APAP引起線(xiàn)粒體損傷后發(fā)揮修復(fù)作用，通過(guò)線(xiàn)粒體新生補(bǔ)充線(xiàn)粒體數(shù)量從而減輕APAP的毒性作用。與我們的假設(shè)不一致，在相對(duì)高濃度時(shí)線(xiàn)粒體新生是被抑制的，猜測(cè)線(xiàn)粒體可能通過(guò)其他方式維持線(xiàn)粒體功能，如線(xiàn)粒體分裂，但需要進(jìn)一步證明。

本研究成功地完成了對(duì)新引入的HepaRG細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代和分化。APAP能誘導(dǎo)或抑制Hep?aRG細(xì)胞的線(xiàn)粒體新生，PGC-1α信號(hào)通路在此過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用，可能成為干預(yù)APAP所致肝細(xì)胞線(xiàn)粒體毒性的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

［1］Jaeschke H，McGill MR，Ramachandran A.Oxidant stress，mitochondria，and cell death mechanisms in drug-induced liver injury：lessons learned from acetaminophenhepatotoxicity［J］.DrugMetab Rev，2012，44（1）：88-106.

［2］McGill MR，Williams CD，Xie Y，Ramachandran A，Jaeschke H.Acetaminophen-induced liver injury in rats and mice：comparison of protein adducts，mitochondrial dysfunction，and oxidative stress in the mechanism of toxicity［J］.Toxicol Appl Phar?macol，2012，264（3）：387-394.

［3］Wareski P，Vaarmann A，Choubey V，Safiulina D，Liiv J，Kuum M，Kaasik A.PGC-1α And PGC-1β regulate mitochondrial density in neurons［J］.J Biol Chem，2009，284（32）：21379-21385.

［4］Venditti P，Bari A，Di Stefano L，Cardone A，Della Ragione F，D′Esposito M，et al.Involvement of PGC-1，NRF-1，and NRF-2 in metabolic response by rat liver to hormonal and environmental signals［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，305（1-2）：22-29.

［5］Lehman JJ，Barger PM，Kovacs A，Saffitz JE，Medeiros DM，Kelly DP.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma coactivator-1 promotes cardiac mitochondrial biogenesis［J］.J Clin Invest，2000，106（7）：847-856.

［6］Wright DC，Han DH，Garcia-Roves PM，Geiger PC，Jones TE，Holloszy JO.Exercise-induced mitochondrial biogenesis begins before the increase in muscle PGC-1 alpha expression［J］.J Biol Chem，2007，282（1）：194-199.

［7］McGinnity DF，Zhang G，Kenny JR，Hamilton GA， Otmani S，Stams KR，et al.Evaluation of multiple in vitro systems for assessment of CYP3A4 induc?tion in drug discovery：human hepatocytes，preg?nane X receptor reporter gene，and Fa2N-4 and HepaRG cells［J］.Drug Metab Dispos，2009，37（6）：1259-1268.

［8］Anthérieu S，Chesné C，Li R，Camus S，Lahoz A，Picazo L，et al.Stable expression，activity，and in?ducibility of cytochromes P450 in differentiated HepaRG cells［J］.Drug Metab Dispos，2010，38（3）：516-525.

［9］Ni HM，Bockus A，Boggess N，Jaeschke H，Ding WX.Activation of autophagy protects against acetaminophen-induced hepatotoxicity［J］.Hepa?tology，2012，55（1）：222-232.

［10］ Pesce V，Nicassio L，F(xiàn)racasso F，Musicco C，Cantatore P，Gadaleta MN.Acetyl-L-carnitine acti?vates the peroxisome proliferator-activated recep?tor-γ coactivators PGC-1α/PGC-1β-dependent sig?naling cascade of mitochondrial biogenesis and decreases the oxidized peroxiredoxins content in old rat liver［J］.Rejuvenation Res，2012，15（2）：136-139.

［11］ Clark J，Simon DK.Transcribe to survive：tran?scriptional control of antioxidant defense programs for neuroprotection in Parkinson′s disease［J］. Antioxid Redox Signal，2009，11（3）：509-528.

［12］ Vercauteren K，Gleyzer N，Scarpulla RC.PGC-1-Related coactivator complexes with HCF-1 and NRF-2beta in mediating NRF-2（GABP）-depen?dentrespiratory gene expression［J］.J Biol Chem，2008，283（18）：12102-12111.

［13］Anderson S，Bankier AT，Barrell BG，de Bruijn MH，Coulson AR，Drouin J，et al.Sequence and orga?nization of the human mitochondrial genome［J］. Nature，1981，290（5806）：457-465.

Effect of acetaminophen on mitochondrial biogenesis via PGC-1α pathway in HepaRG cells

ZHANG Ting-fen,GUO Jia-bin,PENG Hui,ZHANG Li,YUAN Hai-tao,YIN Jian, CUI Lan,ZHAO Jun,PENG Shuang-qing
(Evaluation and Research Center for Toxicology,Institute of Disease Prevention and Control, Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

OBJECTIVE To observe the effect of acetaminophen(APAP)on mitochondrial biogenesis regulated by peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α(PGC-1α)pathway in HepaRGcells.METHODS HepaRG cells were seeded and cultured with growth medium,which was replaced by differential medium after confluence.The morphology of cells was daily observed and photographed. Cell viability was tested using MTT method after cells were exposed to APAP 0.125,0.25,0.5,1,2,4,8 and 12 mmol·L-1for 24 and 48 h,respectively.Protein expression of PGC-1α,nuclear respiratory factor-2 (NRF-2),mitochondrial transcription factor A(TFAM)pathway and subunit NADH dehydrogenase subunit1(ND-1)of mitochondrial respiratory chain complexⅠwas detected by Western blotting after exposure at different concentrations for 24 h.RESULTS Two types of cells,hepatocyte-like and biliarylike cells,were observed by microscopy.Compared with normal control,cell viability at 24 h and 48 h was inhibited in a concentration-dependent manner.IC50was 5.64 and 2.65 mmol·L-1,respectively.After 24 h exposure,protein expression of PGC-1α increased significantly(P＜0.01)in APAP 0.5,1,2 and 4 mmol·L-1groups,but decreased significantly(P＜0.01)in 8 mmol·L-1group.Protein expression of NRF-2 increased significantly(P＜0.05)in 0.5 mmol·L-1groups but decreased significantly(P＜0.01)in 2,4 and 8 mmol·L-1groups.Protein expression of TFAM increased significantly(P＜0.05)in 1 mmol·L-1group,but decreased significantly(P＜0.01)in 4 and 8 mmol·L-1groups.Protein expression of ND-1 increased significantly(P＜0.01)in 0.5,1,2 and 4 mmol·L-1groups but decreased significantly(P＜0.01) in 8 mmol·L-1group.CONCLUSION APAP can induce or inhibit mitochondrial biogenesis,which is possibly regulated by PGC-1α pathway in successfully differentiated HepaRG cells.

acetaminophen;mitochondrial;HepaRG cells;peroxisome proliferator activated recep?tor-γ;coactivator 1α;hepatotoxicity

PENG Shuang-qing,E-mail:pengsq@hotmail.com,Tel:(010)66948462

R966

A

1000-3002-（2017）02-0145-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.04

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81302864);and Unilever International Collaborative Support(CH-2011-1318)

2016-03-03 接受日期：2017-01-16）

（本文編輯：沈海南 喬 虹）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81302864）；聯(lián)合利華國(guó)際合作項(xiàng)目（CH-2011-1318）

張廷芬，女，碩士，助理研究員，從事藥物毒理與安全性評(píng)價(jià)；彭雙清，男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事食品與藥品的安全性評(píng)價(jià)。

彭雙清，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462