曾輝 王麗華 丁毅 姬毓嬌 陳媛 郭裕
夏枯草開音合劑治療慢喉喑藥效學(xué)研究*
曾輝1王麗華1丁毅1姬毓嬌1陳媛1郭裕1
目的 建立血瘀痰凝型大鼠慢喉喑模型,研究夏枯草開音合劑對大鼠慢喉喑的治療效果。方法采用SPF級SD大鼠50只,隨機(jī)分成空白對照組(A),模型對照組(B),中藥低濃度組(C),中藥中濃度組(D),中藥高濃度組(E),血瘀痰凝型慢喉喑大鼠造模成功后,A、B組使用生理鹽水,C-E組分別使用低、中、高濃度夏枯草開音合劑灌胃,灌胃30天后取聲帶標(biāo)本觀察病理改變,并進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果大鼠聲帶各項檢驗指標(biāo)表明實驗造模成功。灌胃30天后,夏枯草開音合劑對聲帶充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤、組織增生指標(biāo)的療效有統(tǒng)計學(xué)差異,并且在低中高3種藥物濃度范圍內(nèi),療效隨著藥物濃度增高而提高。結(jié)論夏枯草開音合劑對血瘀痰凝型大鼠慢喉喑具有顯著的治療作用。
大鼠;慢喉喑;夏枯草開音合劑;實驗研究
慢喉喑是以聲音低沉費力,日久不愈,甚則嘶啞失音的喉科常見慢性疾病,包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性喉炎、聲帶小結(jié)、聲帶息肉等喉部疾病。主要表現(xiàn)為聲帶或室?guī)юつっ?xì)血管擴(kuò)張充血,炎細(xì)胞浸潤,細(xì)胞間質(zhì)水腫,甚至黏膜肥厚,出現(xiàn)聲帶小結(jié)、聲帶息肉。隨著生活節(jié)奏不斷加快,人際交往越發(fā)頻繁,用嗓過度的問題愈發(fā)突出,慢喉喑的發(fā)病率也越來越高,且慢喉喑病程長,易反復(fù)發(fā)作,臨床上中成藥物品種雖多,但多清熱解毒類,治療急喉喑效果好,慢喉喑療效較差。因此,慢喉喑成為困擾廣大患者的常見耳鼻咽喉科疾病。
夏枯草開音合劑是上海市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科主任醫(yī)師郭裕教授通過長期臨床觀察,根據(jù)多年辨證經(jīng)驗結(jié)合喉鏡所示局部體征,創(chuàng)制而成的以活血化瘀、祛痰散結(jié)為主的院內(nèi)自制制劑。臨床療效確切,副作用小[1-3],儲存、攜帶、服用方便。本研究通過建立血瘀痰凝型大鼠慢喉喑模型,研究夏枯草開音合劑對慢喉喑大鼠聲帶組織充血、間質(zhì)水腫、炎細(xì)胞浸潤等方面的治療效果。以補充夏枯草開音合劑治療慢喉喑藥效學(xué)的實驗研究,為進(jìn)一步市場開發(fā)奠定基礎(chǔ)?,F(xiàn)介紹如下:
1 實驗動物
SPF級SD大鼠50只,體重400±20g,由上海杰思捷實驗動物有限公司提供,合格證號:2010002608336。
2 主要器材和試劑
顯微內(nèi)窺鏡、冷光源、光導(dǎo)纖維、電腦顯示器、主機(jī)、顯微咬鉗、負(fù)壓吸引器、大鼠固定板、2ml注射器,體重計、固定皮套若干、干棉球若干、酒精棉球若干、灌胃針、鑷子等。
夏枯草開音合劑(上海市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑,滬藥制字Z05190765),10%水合氯醛,生理鹽水,10%福爾馬林,脫水劑,二甲苯,石蠟,染色液,蒸餾水,乙醇等。
3 方法
①分組:50只SPF級SD大鼠50只,隨機(jī)分成空白對照組(A組),模型對照組(B組),中藥低濃度組(C組),中藥中濃度組(D組),中藥高濃度組(E組)5組,每組10只。動物喂養(yǎng)在同一標(biāo)準(zhǔn)化條件下(2~3大鼠/籠,溫度為20~24℃,相對濕度45%~65%,12小時的光/暗周期),整個研究中一直提供食物和水。
②模型制作:用10%水合氯醛以0.3ml/100g劑量行腹腔注射進(jìn)行麻醉,3~4分鐘后大鼠進(jìn)入深睡眠后將鼠固定在鼠固定板上,將上門牙向大鼠背部方向牽拉并固定,下門牙與舌一起用橡皮筋牽拉并固定,使口咽氣道充分暴露。在顯微內(nèi)窺鏡下,用顯微咬鉗沿內(nèi)窺鏡旁伸入聲門處,迅速鉗傷大鼠雙側(cè)聲帶上皮層,成功后使用負(fù)壓吸引器吸除聲門處滲血及痰液,使大鼠呼吸道保持通暢。B-E組40只大鼠在同一條件下由同一人順次完成。
③給藥方法:A組和B組大鼠使用0.9%生理鹽水4ml,每天分2次灌胃(7am,4pm);C組用夏枯草開音合劑按公式換算后,8.3mg/100g生藥,0.9%生理鹽水稀釋為4ml,每天分2次灌胃(7am,4pm);D組夏枯草開音合劑按公式換算后,16.6mg/100g生藥,0.9%生理鹽水稀釋為4ml,每天分2次灌胃(7am,4pm);E組夏枯草開音合劑按公式換算后,33.2mg/ 100g生藥,0.9%生理鹽水稀釋為4ml,每天分2次灌胃(7am,4pm)。由實驗組四人協(xié)作完成,共灌胃30天??刂剖覝卦?8~22℃,定時清潔籠具,充足供應(yīng)大鼠飼料和水。
④制作標(biāo)本:灌胃30天后處死大鼠,使用10%水合氯醛3ml/100g體重的量進(jìn)行腹腔注射,3~5分鐘后大鼠死亡,在耳顯微內(nèi)窺鏡下使用耳顯微咬鉗取出雙側(cè)聲帶標(biāo)本,用10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水、浸蠟、包埋程序制作4μm石蠟連續(xù)切片,進(jìn)行HE染色,觀察組織充血、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤、組織增生等指標(biāo),按其嚴(yán)重程度分為四個等級:-(未出現(xiàn))、+(輕度)、++(中度)、+++(重度)。
⑤統(tǒng)計學(xué)方法。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行,兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗,多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗,檢驗標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
各組大鼠性別、體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異,具有可比性。A組及D組各有一只大鼠因操作失誤死亡。1組織充血指標(biāo),見表1。
表1 空白對照組及模型對照組組織充血指標(biāo)(n,%)
表1所示為A組和B組在聲帶充血指標(biāo)方面的秩和檢驗,結(jié)果提示兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001),說明在聲帶組織充血方面造模成功。
表2 模型對照組及不同濃度藥物組組織充血指標(biāo)(n,%)
由表2可知,四組在組織充血方面經(jīng)秩和檢驗,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.015<0.05),說明夏枯草開音合劑能緩解慢喉喑聲帶組織充血狀況。且在本實驗中的3種藥物濃度中,隨著藥物濃度增加,治療效果越好。
2 聲帶水腫指標(biāo)
表3 空白對照組及模型對照組聲帶水腫指標(biāo)(n,%)
表3所示為A組和B組在聲帶水腫指標(biāo)方面的秩和檢驗,結(jié)果提示兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001),說明在聲帶組織水腫方面造模成功。
表4 模型對照組及不同濃度藥物組聲帶水腫指標(biāo)(n,%)
由表4為四組在聲帶水腫方面的秩和檢驗,結(jié)果顯示有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001),說明夏枯草開音合劑能有效緩解血瘀痰凝型慢喉喑聲帶組織水腫,且在此3種藥物濃度中,隨著濃度增加,治療效果越好。
3 炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)
表5 空白對照組及模型對照組炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)(n,%)
表5為兩組在炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)方面的秩和檢驗,差異具體統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001<0.05),說明動物造模造成了大鼠聲帶的炎細(xì)胞浸潤。
表6 模型對照組及不同濃度藥物組炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)(n,%)
表6為四組炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)的秩和檢驗,P=0.032<0.05,有統(tǒng)計學(xué)差異。表明夏枯草開音合劑能有效治療大鼠慢喉喑聲帶的炎細(xì)胞浸潤狀況,并且在本實驗的3種藥物濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度增加而療效越好。
表7 空白對照組及模型對照組聲帶組織增生指標(biāo)(n,%)
經(jīng)秩和檢驗,P<0.001,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。說明造模后大鼠聲帶組織增生。
表8 模型對照組及不同濃度藥物組聲帶組織增生指標(biāo)(n,%)
表9表明,在改善聲帶組織增生方面夏枯草開音合劑有顯著療效(P<0.001),此療效隨著藥物濃度增高而提高。
各組大鼠聲帶病理切片結(jié)果如下圖。
圖1 A組大鼠聲帶病理標(biāo)本
圖2 B組大鼠聲帶病理標(biāo)本
圖3 E組大鼠聲帶病理標(biāo)本
圖4 D組大鼠聲帶病理標(biāo)本
圖5 C組大鼠聲帶病理標(biāo)本
慢喉喑相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的慢性喉炎,及聲帶小結(jié)和聲帶息肉等嗓音疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病主要是由發(fā)聲過度或者用聲不當(dāng)、大量吸入有害氣體以及呼吸道疾病長期刺激使喉部黏膜血管擴(kuò)張而成[4,5]。西醫(yī)多采用抗生素加激素治療。但慢性喉炎很少有細(xì)菌感染,采用抗生素治療不能起到很好的治療效果,反而大多數(shù)抗生素對人體有副作用,危害人體健康[6],采用類固醇激素靜脈注射和口服治療慢性喉炎,此類藥物在患者聲帶中濃度低,不能起到很好的治療效果,且長期使用會產(chǎn)生一些副作用[7],因此,臨床上更傾向于使用療效確切、副作用低的中藥制劑。
祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢喉喑病因病機(jī)較為復(fù)雜,多責(zé)之陰虛、氣虛、痰濁、淤血?!端貑枴分杏小拔逍八鶃y,搏陰則為喑?!薄爸惺⑴K滿,氣勝傷恐者,聲如從室中言,是中氣之濕也。”等記載,認(rèn)為喑啞與陰虛、痰濁有關(guān)?!秱浼鼻Ы鹨健?“補肺湯,治肺氣不足,咳逆短氣,寒從背起,口中如含霜雪,語無音聲而渴,舌本干燥方?!敝赋龇螝馓摀p致喑啞。及至明代,樓英所著《醫(yī)學(xué)綱目》中才首次提出“喉喑”病名。《證治準(zhǔn)繩·雜病·第五冊》“肺間邪氣,胸中積血作痛,失音”,首次提出了淤血致喑。《景岳全書·卷二十八》認(rèn)為:“五臟之病皆能為喑”?!班硢≈?,當(dāng)知虛實。實者,其病在標(biāo),因竅閉而喑也;虛者,其病在本,因內(nèi)奪而喑也?!钡於撕磬场敖饘嵅圾Q”、“金破不鳴”的理論基礎(chǔ)。清朝《臨證指南醫(yī)案·卷二》說:“發(fā)聲之本在于腎,其標(biāo)則在乎肺。病有虛實,由咳嗽而起者居多?;蚍斡性锘?,外感寒邪,火氣郁而喑者;有肺金燥甚,木火上炎,咽干喉痹而喑者;有風(fēng)熱痰涎,壅遏肺竅而喑者;有嗔怒號叫,致傷會厭者;亦有龍相之火上炎,凌爍肺金,久咳不已而喑者;有內(nèi)奪而厥,則為喑痱,此腎虛也?!盵8]提出了肺陰虛、心火灼肺、肺腎陰虛發(fā)為喑啞的觀點。導(dǎo)師郭裕教授從慢喉喑患者聲帶充血、室?guī)Х屎裨錾炔±砀淖冋J(rèn)為喑啞最常見的病因病機(jī)是氣滯血瘀痰凝,這與現(xiàn)代名老中醫(yī)干祖望老先生的觀點不謀而合。針對這一病因病機(jī),郭裕教授自創(chuàng)夏枯草開音合劑來治療慢喉喑,其藥物組成為:三棱、莪術(shù)、桃仁、紅花、葛根、山楂、半夏、陳皮、茯苓、桔梗、夏枯草、海蛤殼、威靈仙、胖大海。方中君藥三棱、莪術(shù)、桃仁、紅花、山楂活血化瘀;臣藥夏枯草、半夏、陳皮、茯苓、祛痰消腫;佐以海蛤殼、威靈仙軟堅散結(jié);胖大海、桔梗、葛根利咽開音,引藥上行為使,全方共奏活血化瘀、祛痰消腫、軟堅散結(jié)、利咽開音之功。在臨床應(yīng)用中,夏枯草開音合劑治療慢喉喑取得了較好療效,為進(jìn)一步推廣應(yīng)用,并為進(jìn)一步市場化奠定基礎(chǔ)我們補充研究夏枯草開音合劑治療慢喉喑藥效學(xué)實驗研究。
在國內(nèi)研究中,大多數(shù)學(xué)者采用更為方便直觀的家兔或狗進(jìn)行聲帶病變實驗研究,但狗和家兔聲帶與人類聲帶存在較大差異,且價格較為昂貴,生長周期長,造模困難等導(dǎo)致觀察周期過長[9]。Tateya Tetal等[10]研究表明大鼠聲帶與人類聲帶結(jié)構(gòu)更為相似,且大鼠生長周期短,價格低廉,較狗和家兔具有明顯的優(yōu)勢,故本實驗采用大鼠進(jìn)行慢喉喑實驗研究。目前國內(nèi)外尚無大鼠慢喉喑造模成功的標(biāo)準(zhǔn),但有研究表明,喉鏡檢查結(jié)果可作為慢性喉炎血瘀痰凝證癥候診斷的客觀依據(jù)[11],血瘀痰凝證慢性喉炎聲帶喉鏡主要表現(xiàn)為聲帶黏膜腫脹、慢性充血,本實驗參考文獻(xiàn)大鼠聲帶動物模型建立方法進(jìn)行大鼠慢喉喑建模[12],并于造模后第三天內(nèi)窺鏡檢查大鼠聲帶,聲帶充血、水腫,符合血瘀痰凝型慢性喉炎的診斷。
在本實驗中,充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤、組織增生四個指標(biāo)A組和B組對比均有統(tǒng)計學(xué)意義,說明造模成功。從數(shù)據(jù)看,夏枯草開音合劑對聲帶充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤、組織增生指標(biāo)的療效有統(tǒng)計學(xué)差異,并且在本實驗采用的3種藥物濃度范圍內(nèi),療效隨著藥物濃度增高而提高,說明在一定濃度范圍內(nèi),隨著藥物濃度增加,療效更好。因此我們認(rèn)為夏枯草開音合劑對血瘀痰凝型慢喉喑具有確切的療效。
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(收稿:2016-12-01)
10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.01.006
上海市博士點基金項目(JX007301)
1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科
郭裕,主任醫(yī)師.Email:guoyilun007@sina.com