補(bǔ)中益氣顆粒對(duì)脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IL-5及鼻黏膜IL-5m RNA表達(dá)的影響*

劉婷 朱玲 吳飛虎

補(bǔ)中益氣顆粒對(duì)脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IL-5及鼻黏膜IL-5m RNA表達(dá)的影響*

劉婷1朱玲2吳飛虎2

目的 通過觀測補(bǔ)中益氣顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清IL-5水平及鼻黏膜IL-5mRNA表達(dá)水平的影響，探討其治療脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制。方法①采用病癥結(jié)合造模原理，在采用游泳力竭法、大黃法、饑餓法等多因素復(fù)合傷脾的方法造成大鼠脾氣虛模型的基礎(chǔ)上，用卵清蛋白為過敏原使大鼠致敏，建立脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠模型。②以補(bǔ)氣升陽，甘溫除熱的代表方藥補(bǔ)中益氣顆粒灌胃，創(chuàng)立脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠中藥組模型。③觀察各模型組大鼠接受治療后癥狀改變情況，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)各組血清中IL-5水平進(jìn)行檢測；用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)各組鼻黏膜中IL-5 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果與變應(yīng)性鼻炎組及脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎組相比，脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎藥物組癥狀改善明顯，且血清IL-5水平及鼻黏膜IL-5mRNA表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。結(jié)論補(bǔ)中益氣顆粒治療脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制之一是通過調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞因子IL-5的表達(dá)，從而糾正Th2細(xì)胞因子的失衡狀態(tài)，最終對(duì)脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎產(chǎn)生治療效果。

補(bǔ)中益氣顆粒；變應(yīng)性鼻炎；脾氣虛；IL-5

變應(yīng)性鼻炎(Allergic Rhinitis AR)是指特異性個(gè)體接觸過敏原后導(dǎo)致包含IgE介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)釋放和多種免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥性疾病，臨床上稱為變應(yīng)性鼻炎，是臨床上的常見病、多發(fā)病[1]。AR雖不至危及生命，但可不同程度地影響患者的生活質(zhì)量，并可能導(dǎo)致其他相關(guān)疾病如哮喘、鼻竇炎、腫瘤等的發(fā)生及發(fā)展，目前已成為一個(gè)全球性的健康問題，其防治也是全球醫(yī)務(wù)工作者研究的熱點(diǎn)之一[2]。變應(yīng)性鼻炎歸屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，又稱嚏、鼽、鼽嚏等，均以其癥狀進(jìn)行命名。中醫(yī)醫(yī)家針對(duì)此病也進(jìn)行了廣泛深入的研究，近代中醫(yī)耳鼻咽喉科創(chuàng)始人干祖望教授提出了“耳鼻喉科脾胃論”的觀點(diǎn)，在臨床上力薦應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯治療變應(yīng)性鼻炎，大量臨床觀察亦證實(shí)補(bǔ)中益氣湯治療變應(yīng)性鼻炎臨床療效確切，同時(shí)也證實(shí)其對(duì)AR患者Th1/Th2平衡、血清IgE、多種炎性細(xì)胞因子都有一定的調(diào)節(jié)作用[3-5]。本研究通過評(píng)價(jià)脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠在應(yīng)用補(bǔ)中益氣顆粒治療前后，血清中IL-5水平及鼻黏膜中IL-5 mRNA表達(dá)水平的變化，來探討補(bǔ)中益氣顆粒用以治療脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物及分組

健康SD大鼠48只，體重200g，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)2天后，隨機(jī)分為正常組12只（正常-AR組）、AR組12只（1-AR組）、脾氣虛模型組24只，雌雄各半。脾氣虛模型組經(jīng)評(píng)價(jià)造模成功后再次分為脾氣虛AR組（p-AR組）、脾氣虛AR中藥組（藥-AR組），每組12只，雌雄各半。正常組自由飲水，正常飲食。

2 造模方法的選擇

2.1 1-AR組（AR組）

[6]，以卵清白蛋白O.30mg作抗原，氫氧化鋁粉末30mg作佐劑，加生理鹽水lml形成混懸液，腹腔內(nèi)注射，隔日1次，共7次。腹腔注射完成后的第2天，行被動(dòng)皮膚免疫反應(yīng)試驗(yàn)(passivecutaneous-anaphylasis，PCA)，待確定大鼠體內(nèi)OVA特異性抗體陽性后，兩側(cè)鼻腔均以5%卵白蛋白溶液10ul局部免疫，每日1次，共7次；

2.2 脾氣虛模型組

采用大黃法、游泳力竭法、饑餓法多因素復(fù)合傷脾的方法，連續(xù)21天，造成脾氣虛模型[7，8]。即：減少每日飼料的攝入量，每日上午8點(diǎn)添加飼料，下午8點(diǎn)撤去飼料；②每日下午于大鼠尾根部栓上鐵絲，使其負(fù)重，并確保其可以沉入水中，放入水溫約20℃、水深約50cm的水桶內(nèi)游泳，使其力竭而不致死（大鼠鼻尖沒進(jìn)水中10S，），每日1次；③每日上午，以大黃冷浸液3ml/只灌服大鼠，1次/日，共21日。如大便稀溏，進(jìn)食量減少，身體瘦削，拉尾排便次數(shù)增多，肛周污穢甚或脫肛，陰囊脫垂，精神倦怠，活動(dòng)減少，毛發(fā)不光澤，蜷縮聚堆，眼穢增多，弓背等，則表明脾氣虛模型復(fù)制成功[9]。

2.3 p-AR組（脾氣虛AR組）、藥-AR組（脾氣虛AR中藥治療組）

在脾氣虛模型組的基礎(chǔ)上，再造AR病證結(jié)合模型組，造模方法同AR組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?；A(chǔ)致敏成功后，將脾氣虛AR組大鼠隨機(jī)分為：p-AR組、藥-AR組。治療組以補(bǔ)中益氣顆粒灌胃，大鼠用藥量與人按體表面積折算等效劑量：用補(bǔ)中益氣顆粒（吉靈參）65g×0.18×5=5.85/kg灌胃給藥，每日1次，每次1ml/100g，連續(xù)用藥15天。

3 藥品及試劑

卵清蛋白Sigma A-5253 10G。氫氧化鋁,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：津Q/HG NK 204-2000。伊文斯藍(lán)Sigma E-2129 1G。補(bǔ)中益氣顆粒(成分：炙黃芪、黨參、炙甘草、當(dāng)歸、炒白術(shù)、升麻、柴胡、陳皮、生姜、大棗)，北京漢典制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20040120。大鼠IL-5 ELISA試劑盒購于雷杜公司。

4 指標(biāo)觀測

4.1 動(dòng)物的一般情況

從實(shí)驗(yàn)第1天起，認(rèn)真觀察并記錄大鼠的一般情況：如攝食、飲水、大小便情況、活動(dòng)狀態(tài)、精神狀態(tài)，每周記錄體重1次，仔細(xì)觀察鼻部癥狀，觀察噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)，是否有鼻分泌物等情況。

4.2 鼻部行為學(xué)癥狀觀察

每次鼻腔激發(fā)后30分鐘內(nèi)，仔細(xì)觀察并記錄大鼠抓鼻動(dòng)作、噴嚏次數(shù)、流涕范圍等鼻部癥狀，計(jì)分方法選用疊加量化法。觀察計(jì)分如表1。

表1 鼻部行為學(xué)癥狀計(jì)分

每只大鼠的行為學(xué)計(jì)分采用其7次激發(fā)得分的均數(shù)，如分?jǐn)?shù)超出5分，表示AR模型造模成功。治療組通過鼻腔激發(fā)后的行為學(xué)觀察來了解經(jīng)過藥物干預(yù)后鼻部癥狀的改善情況。

4.3 PCA實(shí)驗(yàn)（被動(dòng)皮膚免疫反應(yīng)試驗(yàn)）用0.1ml生理鹽水，對(duì)正常組進(jìn)行皮內(nèi)注射；用1mg卵清蛋白和1%伊文斯藍(lán)混合液1ml，對(duì)1-AR組、p-AR組、藥-AR組大鼠進(jìn)行皮內(nèi)注射，注射后30min后，觀察注射部位有無皮膚硬結(jié)，以及染料是否擴(kuò)散，記錄擴(kuò)散范圍，直徑＞10mm記做（+），5mm＜直徑＜10mm記做（±），5mm以下則為（-），PCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性者，說明已有OVA特異抗體存在于大鼠體內(nèi)，證明致敏成功。

4.4 各組造模成功后第2天，麻醉后取主動(dòng)脈血，血標(biāo)本用離心機(jī)離心3000r/min,15min，移液管移取上清液，用ELISA方法測定血清中IL-5的含量。各組大鼠取血標(biāo)本后處死，并將上頜骨從顱骨中游離出來，沿鼻中線剪開鼻腔，暴露鼻中隔及雙側(cè)鼻腔，留取大鼠鼻黏膜，黏膜速置于液氮中，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，檢測時(shí)應(yīng)用PCR法檢測待測鼻黏膜IL-5mRNA表達(dá)指標(biāo)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行管理和統(tǒng)計(jì)分析構(gòu)成比較；對(duì)所檢測的指標(biāo)均進(jìn)行α正態(tài)性檢驗(yàn)α＝0.1；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；等級(jí)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為有差異，P＜0.01有顯著差異，P＞0.05為沒有統(tǒng)計(jì)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1 動(dòng)物的一般情況

實(shí)驗(yàn)前，各組動(dòng)物正常飲食、活動(dòng)，未見打噴嚏、流清涕、搔抓鼻部等癥狀，AR組大鼠在鼻局部致敏第一天，初始時(shí)未見明顯鼻部癥狀，15分鐘左右時(shí)局部癥狀出現(xiàn)，隨后逐漸增強(qiáng)，20分鐘左右時(shí)癥狀最為明顯，30分鐘時(shí)癥狀基本消失。造模時(shí)間越久，打噴嚏、流清涕、搔抓鼻部等癥狀加重，且癥狀較初期時(shí)發(fā)作時(shí)間減短，第3～4次時(shí)，可出現(xiàn)典型的變應(yīng)性鼻炎鼻部癥狀，打噴嚏、抓鼻一般都在10次以上，可出現(xiàn)涕流滿面的癥狀。而AR病癥結(jié)合模型組，鼻部致敏第一天，5～10分鐘左右時(shí)癥狀便可出現(xiàn)，部分癥狀嚴(yán)重的大鼠1小時(shí)后癥狀才基本消失，造模成功后部分大鼠無鼻部刺激后仍有明顯的打噴嚏、流清涕、搔抓鼻部癥狀。

2 檢測結(jié)果

2.1 血清IL-5水平

表1 補(bǔ)中益氣顆粒對(duì)脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠血清IL-5水平的影響

2.2 鼻黏膜IL-5mRNA表達(dá)水平

從圖1可以看出，正常-AR組大鼠鼻黏膜中IL-5mRNA相對(duì)表達(dá)量最低，p-AR組相對(duì)表達(dá)量最高。藥-AR組大鼠鼻黏膜中IL-5mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于未使用藥物的1-AR組及p-AR組。

圖1 IL-5mRNA相對(duì)表達(dá)量

討論

目前變應(yīng)性疾病在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢。AR作為耳鼻咽喉科常見病多發(fā)病,影響著全球大約5億人的生活[10]。在我國13個(gè)省（63個(gè)市）和4個(gè)直轄市，針對(duì)508名耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)生進(jìn)行的問卷調(diào)查結(jié)果顯示，AR患者占全部耳鼻咽喉頭頸外科門診患者的比例平均為1/5，占全部鼻腔鼻竇疾病門診患者的1/3[11]。大量研究顯示，Th1和Th2細(xì)胞間免疫反應(yīng)失衡是導(dǎo)致AR的免疫學(xué)基礎(chǔ)[12]。輔助性T淋巴細(xì)胞亞群按產(chǎn)生細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)的功能的不同，可以分為Th1和Th2兩種類型，正常情況下，Th按一定的比例向Th1和Th2分化，兩者處于相對(duì)平衡狀態(tài)，維持著機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。當(dāng)機(jī)體受到異?？乖碳r(shí)，兩者間的平衡被打破，Th2亞群功能升高，而Th1亞群功能降低，即可引起異常的免疫應(yīng)答[13]。在此免疫應(yīng)答過程中，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等細(xì)胞因子，此類細(xì)胞因子稱為Th2細(xì)胞因子[14]，AR發(fā)病過程中Th1細(xì)胞劣勢表達(dá)，Th2細(xì)胞優(yōu)勢表達(dá)，即Th2相關(guān)細(xì)胞因子的優(yōu)勢表達(dá)。何迎春等[15]研究表明，AR大鼠遲發(fā)相脾組織中IL-5表達(dá)增高，且其水平與鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）數(shù)呈正相關(guān)。龐文會(huì)等[16]研究亦證實(shí)，IL-5水平與鼻黏膜組織局部的EOS數(shù)目改變也是一致的，在AR組含量明顯升高。

IL-5對(duì)促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞(EOS)成熟及延長其生存期也可產(chǎn)生作用。AR鼻黏膜組織中EOS的浸潤與癥狀的嚴(yán)重水平密切相關(guān),IL-5在遲發(fā)相反應(yīng)中亦占據(jù)重要作用,在鼻黏膜的變態(tài)性反應(yīng)遲發(fā)相中最為重要的病理改變,如EOS的浸潤、分化、活化等,均通過IL-5來維持和延續(xù),慢性變應(yīng)性炎癥反應(yīng)主要通過抑制IL-5來控制,所以IL-5決定著AR慢性炎性反應(yīng)的發(fā)展[17]。

另有研究表明，IL-5也激活了循環(huán)中的EOS，這些EOS聚集到抗原刺激部位，導(dǎo)致變應(yīng)性鼻炎的發(fā)作,嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）則在抗原刺激后增加合成,迅速而又強(qiáng)大地促進(jìn)EOS在局部組織中選擇性募集，一旦在抗原刺激部位積聚了大量的EOS，IL-5即與其他因素一起，促使EOS延長保存并釋放出一系列蛋白顆粒，從而導(dǎo)致AR發(fā)作[18]。由此看來，IL-5在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病以及治療過程中發(fā)揮著極其重要的作用。

中醫(yī)認(rèn)為，鼻鼽是由于臟腑虛損，正氣不足，腠理疏松，衛(wèi)表不固，不任風(fēng)寒，或稟質(zhì)特異，異氣侵襲所致。其病位在肺，與脾胃密切相關(guān)，而脾為后天之本，氣血生化之源，“四季脾旺不受邪”[19]。李東垣曾在《脾胃論·脾胃勝衰論》中指出:“飲食入胃,先行陽道,而陽氣升浮也。浮者,陽氣散滿皮毛,升者,充塞頭頂,則九竅通利也”。鼻位于人體頭面部,皆屬于“清空之竅”,其功能的正常有賴于人體清陽之氣的濡養(yǎng),清陽既升,孔竅分泌之濁陰亦降,則清竅得養(yǎng),濕濁亦可去,官竅得以正常通利。江蘇省中醫(yī)院耳鼻喉干祖望教授提出“耳鼻喉科脾胃論”，在臨床上采用健脾補(bǔ)土，益氣升陽之法治療脾虛型變應(yīng)性鼻炎取得較好的療效。補(bǔ)中益氣湯出自金代李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》，藥物組成包括：黃芪、人參、白術(shù)、升麻、陳皮、炙甘草、柴胡、當(dāng)歸。該方為補(bǔ)氣升陽，甘溫除熱的代表方。方中重用黃芪為君，味甘微溫，入脾、肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣，升陽固表。配伍人參、炙甘草、白術(shù)補(bǔ)氣健脾為臣，與黃芪合用，以增強(qiáng)其補(bǔ)益中氣之功。血為氣之母，氣虛時(shí)久，營血亦虧，故加當(dāng)歸養(yǎng)血和營，協(xié)人參、黃芪以補(bǔ)氣養(yǎng)血；陳皮理氣和胃，使諸藥補(bǔ)而不滯，共為佐藥。且以少量升麻、柴胡升陽舉陷，助君藥以升提下陷之中氣，共為佐使。炙甘草調(diào)和諸藥，亦為使藥。諸藥合用，使氣虛得補(bǔ)，氣陷得升則諸癥自愈。氣虛發(fā)熱者，亦借甘溫益氣而除之。本次實(shí)驗(yàn)所采用的補(bǔ)中益氣顆粒是通過現(xiàn)代制藥工業(yè)的提取、純化分離、制粒、干燥及包裝5個(gè)步驟，按照傳統(tǒng)補(bǔ)中益氣湯的組方用藥制備而來，可有效地糾正中藥湯劑味苦、不易攜帶、熬藥復(fù)雜等特點(diǎn)，同時(shí)其性能穩(wěn)定，易于吸收、安全性高、計(jì)量準(zhǔn)確、方便保管，更利于臨床推廣使用，易于被患者所接受[20]。

當(dāng)代藥理及大量臨床研究表明補(bǔ)中益氣湯具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，其中所含方藥大多也具有提高免疫力的作用:人參所含的主要有效成分人參二醇皂苷及人參多糖在增強(qiáng)免疫方面體現(xiàn)優(yōu)勢[21]，人參皂苷具有雙相免疫調(diào)節(jié)作用，能改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的非特異性免疫和特異性免疫功能[22]，周英武等[23]研究發(fā)現(xiàn)人參皂甙Rg1通過引起OVA小鼠混合性Th1/Th2平衡免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)小鼠對(duì)卵清蛋白的特異性免疫應(yīng)答；黃芪含有的黃芪多糖、黃芪皂苷、黃芪黃酮可以增強(qiáng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫及體液免疫功能[24]；白術(shù)所含白術(shù)多糖可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增強(qiáng)及抗體生成和細(xì)胞因子的分泌[25]，黃利等[26]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)水煎劑可在一定程度上增強(qiáng)小鼠的免疫功能；當(dāng)歸對(duì)多種致炎劑引起的急性毛細(xì)血管通透性增高、組織水腫及慢性損傷均有顯著抑制作用[27]；在抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、促進(jìn)造血功能等方面有很好的藥用價(jià)值[28]；柴胡多糖可促進(jìn)造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分解，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，誘生干擾素，激活機(jī)體免疫機(jī)能[29]。

本研究表明補(bǔ)中益氣顆?？梢燥@著降低脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠升高的IL-5的水平，緩解并改善脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎大鼠的相關(guān)癥狀，促進(jìn)疾病的恢復(fù)。從而提示降低機(jī)體IL-5的水平可能是補(bǔ)中益氣顆粒治療脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)制之一，但因此次實(shí)驗(yàn)所取指標(biāo)較為單一，并不能全面詮釋補(bǔ)中益氣顆粒治療脾氣虛型變應(yīng)性鼻炎的作用機(jī)理，其機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的科學(xué)研究。

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（收稿：2016-08-01 修回：2016-10-25）

The Influence of Buzhong Yiqi Particle on IL-5 and the Expression of Nasal Mucosa IL-5m RNA of rRatsw ith Sp lenic Asthenic Allergic Rhinitis

LIU Ting,ZHU Ling,WU Feihu
Department of Otorhinolaryngology;the First Affiliated Hospital of AnhuiUniversity of traditional Chinese Medicine,Anhui,230038,China

ObjectiveThrough observing the influence of Buzhong Yiqi particle on IL-5 and the expression of nasalmucosa IL-5 mRNA of rats with splenic asthenic allergic rhinitis,this paper discussed themechanisms of splenic asthenic allergic rhinitis.Methodology①With combination of disease and symptom molding theory,methods ofmulti-factor impairment of the spleen like exhaustion method by swimming,rheum officinale and starvation method were employed to produce rats spleen-deficiency models, ovalbumin was used as an allergen to sensitize the rats and splenic asthenic allergic rhinitis ratsmodels were constructed.②The representative traditional Chinese medicine of tonifying Qi and lifting yang as well as clearing heat with sweet-warm medicine-Buzhong Yiqi particle was used as the administration?by gavage to build rats models with splenic asthenic allergic rhinitis.③To observe symptom changes of each model and to test IL-5 levels with ELISA.Furthermore,PCR was used to test IL-5 mRNA expression of nasalmucosa.ResultBy comparing the group with allergic rhinitiswith thatwith splenic asthenic allergic rhinitis,the latter one had more obvious improvement of symptoms and its IL-5 and the expression of IL-5 mRNA were significantly decreased (P＜0.01).ConclusionOne of the actionmechanisms of Buzhong Yiqi particle on splenic asthenic allergic rhinitis is through adjusting the expression of Th2 cytokines IL-5 to rectify the imbalance states of Th2 cytokines so as to produce a therapeutic effect to splenic asthenic allergic rhinitis.

Buzhong Yiqiparticle;Allergic rhinitis;Splenic asthenia;IL-5

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.01.003

漢典鳳凰中西醫(yī)結(jié)合英才基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：hdfh001）

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部（安徽合肥，230038）

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科

朱玲，副主任醫(yī)師.Email:369699562@qq.com