食管鱗癌中骨橋蛋白、表皮生長因子受體與蛋白激酶B蛋白的表達(dá)及臨床意義

張 卉 楊德生 馬許輝 索智敏

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 開封 475000)

食管鱗癌中骨橋蛋白、表皮生長因子受體與蛋白激酶B蛋白的表達(dá)及臨床意義

張 卉 楊德生 馬許輝 索智敏

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 開封 475000)

目的 研究骨橋蛋白(OPN)及表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶B(Akt)蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及與其臨床意義。方法 應(yīng)用S-P免疫組化技術(shù)檢測70例食管鱗癌及其相應(yīng)的癌旁正常組織中OPN和EGFR、Akt蛋白的表達(dá)。結(jié)果 70例食管鱗癌組織中OPN、EGFR、Akt蛋白的陽性表達(dá)率72.9%(51/70)、67.1%(47/70)、75.7%(53/70)均高于癌旁正常組織〔5.7%(4/70)、18.6%(13/70)、17.1%(12/70)，P<0.05〕；OPN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)；EGFR蛋白的表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)；Akt蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。OPN與EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.325、0.403，均P<0.05)，EGFR與Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.384，P<0.05)。結(jié)論 OPN可能通過激活EGFR /Akt所在的信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮其抗食管鱗癌作用。

骨橋蛋白；食管鱗狀細(xì)胞癌；表皮生長因子受體；蛋白激酶B

食管癌在我國腫瘤性死因中占第四位，其中絕大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌，其發(fā)病機(jī)制涉及多基因的改變以及多條信號(hào)通路異常等〔1〕。骨橋蛋白(OPN)是從最初骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，具有多種功能的一種胞外基質(zhì)蛋白，參與細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移，影響腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移進(jìn)程。表皮生長因子受體(EGFR)為酪氨酸激酶受體，在體內(nèi)通過多種信號(hào)途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔2〕。PI3K/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)途徑是癌細(xì)胞存活的首要通路，Akt位于其樞紐部位，位于EGFR下游，是EGFR信號(hào)傳導(dǎo)的一條主要通路〔3〕。本文應(yīng)用免疫組化法檢測OPN和EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 河南大學(xué)淮河醫(yī)院胸外科2006年1月至2011年12月手術(shù)切除食管癌標(biāo)本70例，均經(jīng)HE切片病理證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌，所有病例術(shù)前均未接受任何放療或化療，并排除其他臟器的惡性腫瘤。選取同一病例的癌旁切緣正常組織70例作為對(duì)照。70例食管鱗癌中，男39例，女31例；年齡31～74〔平均(46.2±5.6)〕歲；高、中、低分化鱗癌分別為23例、34例和13例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無轉(zhuǎn)移33例；按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期16例及Ⅳ期17例；按浸潤深度分，T1 21例，T2 15例，T3 22例，T4 12例。

1.2 試劑 濃縮型鼠抗人單克隆抗體OPN、EGFR、Akt及免疫組化、DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組化S-P法。取厚4 μm石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化后，采用電爐加熱煮沸修復(fù)抗原；OPN與EGFR、Akt蛋白單克隆抗體均按1∶100稀釋，操作參照產(chǎn)品說明書，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。用已證實(shí)的OPN、EGFR、Akt染色陽性食管鱗癌切片作陽性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 OPN與EGFR、Akt蛋白均按照以下標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)染色程度及陽性細(xì)胞數(shù)來計(jì)算評(píng)分，a 染色程度：陰性(0分)，弱陽性(1分)，中等陽性(2分)，強(qiáng)陽性(3分)；b 陽性細(xì)胞數(shù)：無陽性細(xì)胞(0分)，陽性細(xì)胞1%～25%(1分)，陽性細(xì)胞26%～50%(2分)，陽性細(xì)胞>50%(3分)；a+b之和為3～6分者評(píng)為免疫組織染色陽性；計(jì)數(shù)方法，結(jié)果判定在雙盲法下進(jìn)行，每張切片由兩名病理醫(yī)師分別判斷。兩者不一致時(shí)重新計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 OPN、EGFR、Akt蛋白的表達(dá)情況 70例食管鱗癌組織中，OPN陽性表達(dá)率72.9%(51/70)，其陽性表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)；EGFR的陽性表達(dá)率67.1%(47/70)，陽性表達(dá)部位為細(xì)胞膜；Akt的陽性表達(dá)率75.7%(53/70)，陽性表達(dá)部位為主要在細(xì)胞質(zhì)，部分在細(xì)胞核，均呈強(qiáng)陽性過度表達(dá)現(xiàn)象。癌旁正常組織中，OPN、EGFR、Akt蛋白均為弱陽性低表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為5.7%(4/70)、18.6%(13/70)、17.1%(12/70)。兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=51.148、33.717、36.664，P<0.05)。

2.2 OPN與EGFR、Akt蛋白的陽性表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 OPN的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、臨床分期相關(guān)(P<0.05)，與腫瘤分化程度及浸潤深度無關(guān)(P>0.05)；EGFR蛋白的陽性表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)(P<0.05)，與腫瘤分化程度無關(guān)(P>0.05)；Akt蛋白的陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，與浸潤深度、腫瘤分化程度、臨床分期無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 OPN、EGFR、Akt蛋白的陽性表達(dá)與食管鱗癌病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 OPN與EGFR、Akt 蛋白在食管鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性 OPN與EGFR、Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.325，P=0.006；r=0.403，P=0.001)，EGFR與Akt蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.384，P=0.001)。

3 討 論

整合素是一類異源二聚體跨膜蛋白，作為受體，通過特異的Arg-Gly-Asp序列(RGD)識(shí)別包括纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、膠原蛋白、骨橋蛋白等在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。他們作為細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)器，通過他們的調(diào)解黏附到細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排，并激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的能力。整合素和生長因子受體調(diào)節(jié)相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，和他們一起調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和存活〔4〕。OPN是與整合素結(jié)合的糖蛋白，參與各種生理和病理過程，包括炎癥，局部缺血-再灌注，骨吸收，動(dòng)脈硬化和腫瘤進(jìn)展等。OPN表面受體結(jié)合，引起在細(xì)胞功能的廣泛變化，如增強(qiáng)的移動(dòng)性和黏附，加速生長和分裂，以及延長細(xì)胞的存活，從而腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要作用〔5〕。Kita等〔6〕用免疫組化方法檢測175例食管癌中OPN的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OPN的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)。在本研究中OPN表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在食管鱗癌中的陽性率顯著高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，這與之前的報(bào)道相符。

EGFR是一種跨膜蛋白，屬于ErbB家族受體酪氨酸激酶(RTK)。它被激活后與EGF家族的肽生長因子結(jié)合，其中包括表皮生長因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α等，通過與配體結(jié)合誘導(dǎo)ErbB受體聚合物和異二聚體，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)的激酶結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶自身磷酸化和激活。激活EGFR結(jié)果同時(shí)激活多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)制的多效性細(xì)胞的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖，遷移，侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。除了配體誘導(dǎo)的信號(hào)途徑，可以由其他的蛋白激酶，如G-蛋白耦聯(lián)受體，細(xì)胞因子受體和黏附受體式(主要是整合素)激活〔7〕。整合素和生長因子受體之間的相互作用已被確認(rèn)為腫瘤進(jìn)展的很多方面至關(guān)重要。此外，這種配體-EGFR獨(dú)立激活EGFR的方式被認(rèn)為在單克隆抗體抗EGFR治療發(fā)揮重要作用〔8〕。本研究顯示，EGFR在食管鱗癌組織中表達(dá)率顯著高于較正常組織，且與食管鱗癌的分化不良、腫瘤分期、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤深度、預(yù)后不良相關(guān)。與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

Akt活化啟動(dòng)由易位到質(zhì)膜和磷酸化在Thr308位點(diǎn)由PI3K-依賴性蛋白激酶(PDK)1和Ser473的PDK2〔9〕。Akt的易位到不同的亞細(xì)胞，磷酸化它的底物，并調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能，如存活，細(xì)胞周期進(jìn)程和生長。研究表明，Akt蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程通過多種信號(hào)通路被激活〔9，10〕。Akt的活化在腫瘤和其與臨床病理特征的相關(guān)性已被研究證實(shí)〔10〕。Takahashia等〔11〕從23例沒有術(shù)前化療的手術(shù)切除食管癌組織標(biāo)本Akt1-3基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行了分析。通過免疫組化方法檢測，Akt主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，其陽性率為77.8%。這些與本實(shí)驗(yàn)相符。本實(shí)驗(yàn)中，Akt的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Akt參與食管鱗癌的細(xì)胞增殖和浸潤轉(zhuǎn)移過程。

研究發(fā)現(xiàn)，OPN和EGFR基因表達(dá)上調(diào)，增加的NF-κB的活化與很強(qiáng)的相關(guān)性〔12〕。由EGF通過與受體結(jié)合可以在乳腺癌細(xì)胞，大鼠腎上皮細(xì)胞〔13〕，HepG2細(xì)胞〔14〕和HL60細(xì)胞〔15〕中誘導(dǎo)OPN基因的表達(dá)。在另一方面，在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的體外研究表明，腫瘤細(xì)胞中的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活導(dǎo)致了與整合結(jié)合的OPN誘發(fā)的c-Src的依賴性的EGFR的轉(zhuǎn)錄〔16〕。EGFR酪氨酸激酶信號(hào)途徑可被內(nèi)在受體終止。整合素和生長因子受體各種激活和抑制信號(hào)的平衡被認(rèn)為可以確定細(xì)胞的命運(yùn)。然而，整合素和生長因子受體之間的相互作用比簡單的獨(dú)立激活相同的信號(hào)通路更復(fù)雜。在缺乏配體如EGFR的情況，整合素所誘導(dǎo)多種受體酪氨酸激酶激活都將被中斷。在細(xì)胞的生長和延長細(xì)胞的存活，蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)效應(yīng)方面，骨橋蛋白和表皮生長因子受體配體結(jié)合和Akt的活化的信號(hào)途徑是重疊的〔17〕。

Akt是EGFR下游主要通路之一，是EGFR激活的關(guān)鍵〔18〕。EGFR的激活導(dǎo)致其磷酸化的Akt的活化絲氨酸-473。由于EGFR和Akt所涉及的各個(gè)方面，從腫瘤的發(fā)生，血管生成和轉(zhuǎn)移腫瘤的生長，EGFR-Akt軸線的是一個(gè)有吸引力的干預(yù)治療目標(biāo)〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EGFR和Akt蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，與既往研究理論相符。Wang等〔19〕研究顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌OPN通過的avβ3/PI3-K/Akt的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加速內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，包括增殖，遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，提示OPN通過Akt所在的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。在血管生成，轉(zhuǎn)移和抗凋亡等方面，EGFR，Akt也起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中，OPN與Akt蛋白在食管鱗癌中的高表達(dá)呈正相關(guān)，證實(shí)了上述觀點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，OPN可能通過激活EGFR/PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

1 赫 捷，邵 康.中國食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來對(duì)策〔J〕.中國癌癥雜志，2011；21(7)：501-4.

2 Heuckmann JM，Rauh D，Thomas RK.Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling and covalent EGFR inhibition in lung cancer〔J〕.Clin Oncol，2012；30(27)：3417-20.

3 Yamada T，Takeuchi S，F(xiàn)ujita N，etal.Akt kinase-interacting protein 1，a novel therapeutic target for lung cancer with EGFR-activating and gatekeeper mutations〔J〕.Oncogene，2013；32(37)：4427-35.

4 Cabodi S，del Pilar Camacho-Leal M，Di Stefano P，etal.Integrin signalling adaptors：not only figurants in the cancer story〔J〕.Nat Rev Cancer，2010；10(12)：858-70.

5 張 忠，王旭光.聯(lián)合檢測血清骨橋蛋白和MG7抗原在胃癌診斷中的應(yīng)用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(2)：254-6.

6 Kita Y，Natsugoe S，Okumura H.etal.Expression of osteopontin in oesophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Br J Cancer，2006；45(15)：634-8.

7 Normanno N，De Luca A，Bianco C，etal.Epidermal growth factor receptor(EGFR)signaling in cancer〔J〕.Gene，2006；366(1)：2-16.

8 Wheeler DL，Dunn EF，Harari PM.Understanding resistance to EGFR inhibitors-impact on future treatment strategies〔J〕.Nat Rev Clin Oncol，2010；7(9)：493-507.

9 郭 琳，王 強(qiáng).P13K、Akt以及PrrEN在胃腸道間質(zhì)瘤的表達(dá)及意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(22):5519-21.

10 Bellacosa A，Kumar CC，Di Cristofano A，etal.Activation of AKT kinases in cancer：implications for therapeutic targeting〔J〕.Adv Cancer Res，2005；94：29-86.

11 Takahashia K，Miyashitaa M，Makinoa H，etal.Expression of Akt and Mdm2 in human esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Exp Mol Pathol，2009；87(1)：42-7.

12 Pan D,Lin X. Epithelial growth factor receptor-epithelial growth factor receptor-associated tumors〔J〕.Cancer J,2013;19(16):461-7.

13 Malyankar UM，Almeida M，Johnson RJ，etal.Osteopontin regulation in cultured rat renal epithelial cells〔J〕.Kidney Int，1997；51(6)：1766-73.

14 Zhang G，Zhao ZQ，Wang HD，etal.Enhancement of osteopontin expression in HepG2 cells by epidermal growth factor via phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway〔J〕.World J Gastroenterol，2004；10(2)：205-8.

15 Chakalaparampil I，Peri A，Nemir M，etal.Cells in vivo and in vitro from osteopetrotic mice homozygous for c-src disruption show suppression of synthesis of osteopontin，a multifunctional extracellular matrix protein〔J〕.Oncogene，1996；12(7)：1457-67.

16 Tuck AB,Hota C,Wilson SM,etal.Dstepontin-induced migration of human mammary epithelial cells involves activation of egf receptor and multiple singal transduction pathways〔J〕.Oncogene,2003;22(8):1198-205.

17 Matu?an-Ilija? K，Damante G，F(xiàn)abbro D，etal.EGFR expression is linked to osteopontin and Nf-κB signaling in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.Clin Transl Oncol，2012；10(1)：12089-94.

18 Loganathan S，Kandala PK，Gupta P，etal.Inhibition of EGFR-AKT axis results in the suppression of ovarian tumors in vitro and in preclinical mouse model〔J〕.PLoS One,2012;7(8)：e43577.

19 Wang YY，Yan W，Lu XM，etal.Overexpression of osteopontin induces angiogenesis of endothelial progenitor cells via the avβ3/PI3K/AKT/eNOS/NO signaling pathway in glioma cells〔J〕.Eur J Cell Biol，2011；90(8)：642-8.

〔2015-12-02修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

索智敏(1969-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事消化道腫瘤臨床研究。

張 卉(1980-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤臨床研究。

R735.1

A

1005-9202(2017)06-1432-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.056