葛根素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制

金若天 殷 濤

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外二科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

葛根素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制

金若天 殷 濤

(赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外二科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

目的 探討葛根素(Pue)對大鼠肝臟缺血再灌注(IR)損傷的保護(hù)作用及其對細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法 健康雄性SD大鼠72只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、IR組、缺血預(yù)處理(IP)組和Pue預(yù)處理組(Pue組)，每組按再灌注(1、6、24 h)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分3個(gè)亞組。建立動(dòng)物模型；測Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)情況及肝組織凋亡指數(shù)(AI)；透射電鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞的變化。 結(jié)果 與假手術(shù)組相比，IR組、IP組、Pue組肝組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)以及AI均增加(P<0.05)；與IR組比較，IP組、Pue組肝組織Bax蛋白的表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；與IP組比較，Pue組肝組織Bax蛋白的表達(dá)及凋亡指數(shù)減少，而Bcl-2蛋白的表達(dá)增加(P<0.05)。通過透射電鏡下對肝細(xì)胞學(xué)觀察，可見假手術(shù)組肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，IR組損傷最重，IP組及Pue組損傷較IR組輕，Pue組要更輕。結(jié)論 IP及Pue都可通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，來減輕肝細(xì)胞凋亡，相比之下后者效果要更好。

肝；缺血再灌注損傷；葛根素；凋亡

肝臟缺血再灌注(IR)損傷常見于很多的手術(shù)過程中，如肝部分切除術(shù)、肝移植等，直接影響到疾病的預(yù)后,細(xì)胞凋亡可能在肝臟IR損傷中起到了十分重要的作用〔1〕。Bcl-2和Bax基因是一組能對細(xì)胞凋亡能產(chǎn)生抑制和促進(jìn)作用的基因。葛根素(Pue)能明顯改善大鼠腎臟,小腸等器官的IR損傷,可能是通過預(yù)防生物膜的脂質(zhì)過氧化,減輕鈣超載，抑制凋亡等機(jī)制起到保護(hù)作用〔2,3〕,但其能否通過抑制肝細(xì)胞凋亡來減輕肝IR后的肝細(xì)胞損傷尚有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)探討Pue對肝臟IR損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 72只健康雄性SD大鼠,由赤峰學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重210～240 g。Pue(2 ml:100 mg) 為石家莊神威藥業(yè)有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號:20100175。免疫組化試劑盒Bcl-2、Bax購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 各組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。按規(guī)定要求術(shù)前禁食水。術(shù)前采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉、備皮、常規(guī)消毒皮膚。參照Pringle法〔4〕，建立肝IR損傷模型，取腹正中切口，分離并顯露肝門部，剪開左中肝葉各韌帶，游離左、中肝葉的膽管及門靜脈、肝動(dòng)脈分支，用無損傷血管夾夾閉供應(yīng)肝左外葉、肝中葉之門靜脈及肝動(dòng)脈分支，造成70%肝缺血模型(阻斷后可見被阻斷區(qū)肝葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色表明肝臟缺血成功)，40 min后移走動(dòng)脈夾恢復(fù)肝臟血流。

1.2.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)處理 72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IR組、缺血預(yù)處理(IP)組和Pue組，按再灌注1、6、24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為3個(gè)亞組。IR組：缺血前5 min分別自尾靜脈緩慢注射0.9%氯化鈉2 ml；假手術(shù)組：同IR組，但只是暴露肝中葉和左葉的肝蒂，不阻斷血流；IP組：在實(shí)驗(yàn)前阻斷肝門使其缺血5 min，然后開放5 min，反復(fù)3次；Pue組：按4 g/kg用0.9氯化鈉稀釋到2.0 ml，再灌注前5 min自尾靜脈注入。

1.2.3 標(biāo)本收集 各組分別在再灌注1、6、24 h對6只大鼠取左肝固定部位的組織，大小適中，迅速放于-80℃冰箱中保存；每組上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取1只大鼠的左肝固定部分組織，一塊快速置于10%中性甲醛中固定；另一塊置于3%戊二醛中固定。

1.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

1.3.1 Bcl-2、Bax免疫組化檢測及凋亡檢測 Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒SP法染色步驟進(jìn)行。Bcl-2、Bax的陽性表達(dá)的依據(jù)是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色染色。凋亡細(xì)胞檢測：按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，應(yīng)用赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。

1.3.2 電鏡檢查 取出固定的肝組織塊，按照脫水，浸透，包埋，切超薄，染色，電鏡觀察，拍片等步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行SNK法比較。

2 結(jié) 果

2.1 各組Bax，Bcl-2表達(dá)及AI變化 與假手術(shù)組相比，IR、IP、Pue組肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)、AI均增加(P<0.05)；與IR組比較，IP、Pue組肝組織Bax蛋白表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白的表達(dá)增加(P<0.05)；與IP組比較，Pue組肝組織Bax蛋白表達(dá)及AI減少，而Bcl-2蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。見表1～表3，圖1。

組別1h6h24h假手術(shù)組20.98±2.0820.93±2.0721.07±2.12IR組17.03±1.911)30.33±3.491)36.50±3.451)IP組26.33±2.451)2)41.17±3.911)2)30.50±2.941)2)Pue組31.84±2.781)2)3)50.00±4.011)2)3)58.00±4.661)2)3)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與IR組比較：2)P<0.05；與IP組比較：3)P<0.05，下表同

2.2 透射電鏡下觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 IR 6 h后，假手術(shù)組線粒體排列規(guī)則，細(xì)胞核核膜雙重結(jié)構(gòu)清楚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴(kuò)張，排列規(guī)整；IR組線粒體明顯腫脹擴(kuò)張，嵴斷裂，部分細(xì)胞核核膜消失，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，其上的核蛋白體脫落；IP組部分線粒體輕微腫脹，無明顯擴(kuò)張或空泡變性，核膜結(jié)構(gòu)較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴(kuò)張，排列較規(guī)則；Pue組僅有少量線粒體略微腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍有擴(kuò)張，核膜結(jié)構(gòu)很清楚，排列很規(guī)則。見圖2。

組別1h6h24h假手術(shù)組2.20±0.212.23±0.262.27±0.34IR組12.43±1.111)13.33±1.491)13.50±1.591)IP組10.33±1.051)2)11.17±1.711)2)11.50±1.841)2)Pue組7.84±0.881)2)3)8.00±0.911)2)3)8.10±1.061)2)3)

組別1h6h24h假手術(shù)組3.2±0.93.5±1.23.7±1.3IR組28.4±3.11)47.3±3.41)37.5±3.21)IP組25.3±2.51)2)35.7±3.71)2)31.50±3.41)2)Pue組17.4±2.81)2)3)28.0±3.51)2)3)22.1±3.01)2)3)

圖1 各組大鼠IR 6 h肝細(xì)胞凋亡情況(TUNEL，×400)

圖2 各組大鼠IR 6 h肝臟超微結(jié)構(gòu)變化(×12 000)

3 討 論

肝IR損傷不僅是一個(gè)全身炎癥反應(yīng)的過程，又是一個(gè)細(xì)胞凋亡的過程〔5〕。在IR時(shí)由于鈣超載、氧自由基、炎癥因子等因素共同存在時(shí)，改變了肝細(xì)胞的線粒體膜通透性，使得能量合成受到很大影響，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞凋亡。Bcl-2作為Bcl-2家族蛋白中重要的抗凋亡基因，在IR中起非常重要的作用〔6〕，而Bax作為Bcl-2的同源體，其作用是抑制Bcl-2作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，兩者表達(dá)水平的平衡決定了凋亡信號刺激后細(xì)胞的存活或凋亡〔7〕。Bcl-2是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物定位于線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜上。作為重要的抑制凋亡基因，可通過其表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔，從而調(diào)節(jié)線粒體膜通透性〔8〕。此外，Bcl-2蛋白還可以利用抑制鈣離子釋放，來阻止促凋亡基因信號傳遞等發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。Bax基因作為Bcl-2的同源基因，含有和Bcl-2基因一致的同源區(qū)域，其表達(dá)產(chǎn)物定位與Bcl-2蛋白相同，但其作用與Bcl-2蛋白結(jié)合形成結(jié)合體，兩者的比例關(guān)系則可以決定細(xì)胞的凋亡狀態(tài)〔9〕。當(dāng)Bax蛋白表達(dá)高于Bcl-2蛋白時(shí)，形成Bax-Bax同源二聚體，使細(xì)胞凋亡增加；當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)高于Bax蛋白時(shí)，Bcl-2-Bcl-2形成同源二聚體，凋亡受抑制；而當(dāng)Bcl-2蛋白與Bax蛋白表達(dá)水平相當(dāng)時(shí)，Bcl-2與Bax形成異源二聚體，則細(xì)胞凋亡終止。本研究表明，在肝IR早期，IP通過誘導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而改變Bax及Bcl-2蛋白的比例，形成更多的Bcl-2-Bcl-2同源二聚體，來抑制肝細(xì)胞凋亡。由此推斷，Pue素很可能通過上述途徑來抑制肝細(xì)胞的凋亡，且效果要比IP要好。另外，通過對IR后肝細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)觀察，也證實(shí)在IR 6 h后肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)有很大程度的改變，Pue及IP組較IR組損傷較輕，而Pue組更輕。這也表明在IR早期，IP及Pue都對肝細(xì)胞有很大的保護(hù)作用，這種微觀變化可能是通過抑制肝細(xì)胞凋亡所起的作用。Pue所表現(xiàn)的效果顯得要更好。

1 Gujral JS,Bucci TJ,Farhood A,etal.Mechanism of cell death during warm hepatic ischemia-reperfusion in rats:apoptosis or necrosis〔J〕.Hepatology,2001;33(2):397-405.

2 邵亞芳,徐 群,沈艷艷,等.葛根素對肝缺血再灌注損傷所致心功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制〔J〕.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2011;14(4):20-2.

3 柳家賢,陳金和.葛根素對腸缺血再灌注大鼠腸粘膜細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國藥理與臨床,2009;25(2):50-1.

4 Pringle JH.Notes on the arrest of hepatic hemorrhage Puee due to trauma〔J〕.Ann Surg,1908;48(4):541-9.

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6 孫 凱,劉志蘇,孫 權(quán).大鼠肝臟缺血再灌注時(shí)肝細(xì)胞凋亡與Bcl-2蛋白表達(dá)的關(guān)系〔J〕.肝臟,2003；8(3):12-5.

7 Oltval Z,Milliman C,Korsmeyer S.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,bax,that accelerates programmed cell death〔J〕.Cell,1993;74(4):609-19.

8 Marchetti P,Castedo M,Susin SA,etal.Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis〔J〕.J Exp Med,1996;184(3):1155-60.

9 夏先明,蘇 松,馮春紅,等.缺血預(yù)處理對肝缺血再灌注時(shí)細(xì)胞凋亡及調(diào)控基因表達(dá)的影響〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2007;17(6):665-8.

〔2015-06-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

殷 濤(1984-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中藥治療腹部疾病研究。

金若天(1980-)，男，副教授，主要從事中藥治療肝臟疾病研究。

R285

A

1005-9202(2017)06-1344-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.017