升降散治療血管性癡呆模型大鼠的療效及作用機(jī)制

史江峰 馬 健 郭春暉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

升降散治療血管性癡呆模型大鼠的療效及作用機(jī)制

史江峰1馬 健 郭春暉1

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

目的 探討升降散治療血管性癡呆模型大鼠的臨床效果及作用機(jī)制。方法 SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和升降散組，假手術(shù)組大鼠僅切開(kāi)頸前，模型組和升降散組大鼠行2-AO法永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈得到血管性癡呆模型大鼠。應(yīng)用Morris水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，免疫熒光組織化學(xué)染色檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)，細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL法，采用SABC免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2，Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果 給藥后，升降散組和模型組大鼠的學(xué)習(xí)次數(shù)高于假手術(shù)組、正常組，正確次數(shù)均顯著低于假手術(shù)組、正常組(P<0.05)，升降散組大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)低于模型組，正確次數(shù)顯著高于模型組(P<0.01)；正常組和假手術(shù)組大鼠僅有少量VEGF陽(yáng)性細(xì)胞，升降散組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最高，顯著高于其他三組(P<0.01)；升降散組海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組而顯著高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01)；海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)模型組大鼠高于正常組和假手術(shù)組(P<0.01)，升降散組大鼠海馬CA1區(qū)Bax 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于模型組而B(niǎo)cl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 升降散可促進(jìn)腦部血管再生，可通過(guò)下調(diào)Bax 蛋白和上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)以抑制腦細(xì)胞的凋亡，顯著改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

升降散；血管性癡呆

血管性癡呆(VD)屬于臨床常見(jiàn)的疾病，指的是腦血管疾病造成的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的一組臨床綜合征，伴隨著我國(guó)人口老齡化加劇，VD的發(fā)病率逐年上升，為僅次于阿爾茨海默病的老年性癡呆疾病，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，目前缺乏理想的治療藥物〔1〕。本病主要是由于腦血管病變引發(fā)腦部缺氧、缺血造成記憶及認(rèn)知等特定功能的神經(jīng)組織功能障礙，由于缺血后再灌注極易致海馬神經(jīng)造成損傷并出現(xiàn)神經(jīng)元死亡，進(jìn)而誘發(fā)永久性腦損傷。中醫(yī)理論認(rèn)為，老年臟腑虛衰，腎精虧虛，腦髓不充，痰癖阻絡(luò)，靈機(jī)不聰是癡呆的主要病因病機(jī)，但是中藥在作用機(jī)制方面還有待進(jìn)一步研究〔2〕。本研究探討升降散治療VD模型大鼠的效果和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取出生1 w的雄性健康SD大鼠72只，體重240～260 g，在有光環(huán)境和黑暗環(huán)境每12 h交替喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及儀器 藥物為本院自制膠囊制劑升降散，由僵蠶、蟬蛻、姜黃、川大黃組成，制作成膠囊每粒重0.4 g。Morris 水迷宮由淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司提供；Bcl-2，Bax 免疫組織化學(xué)試劑盒為武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)，兔Ⅷ因子多克隆抗體購(gòu)于北京中生公司；小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VFGF)單克隆抗體購(gòu)于南京建成生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 造模和分組 全部SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和升降散組，每組均18只。模型組和升降散組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食、不禁水，麻醉使用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射，將大鼠固定于鼠板上并碘酒消毒；以大鼠頸部中央處為切口點(diǎn)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈鈍性分離，腹腔注射硝普鈉2.5 mg/kg后立即夾閉10 min雙側(cè)頸總動(dòng)脈，逐層縫合傷口后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠行頸前切開(kāi)而不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈、不注射硝普鈉。大鼠喂養(yǎng)環(huán)境為 20℃左右，術(shù)后肌注青霉素2 000 U/d，連續(xù) 3 d。造模3 d，大鼠活動(dòng)減少、行為遲緩、飲食下降代表建模成功，各組大鼠均隨機(jī)選取12只作為研究。

1.3.2 給藥方法 升降散組給予大鼠用生理鹽水溶解的升降散，按10 ml/kg給藥?kù)o脈滴注；其余三組均給予生理鹽水10 ml/kg靜脈滴注。

1.4 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試 包括定位航行測(cè)試和空間搜索測(cè)試，前者為給藥30 d后，水迷宮共分4個(gè)象限，大鼠朝池壁放入水中，隨機(jī)選擇方位作為起始位置，記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)時(shí)間，每只大鼠每天共訓(xùn)練4次，每次需間隔0.5 h，聯(lián)系訓(xùn)練5 d，第6天測(cè)定有效區(qū)停留時(shí)間、停留距離、逃避潛伏期及總路程等指標(biāo)。定位航行能力測(cè)試后第2天開(kāi)始空間搜索測(cè)試，平臺(tái)去除，探查測(cè)試持續(xù)120 s，動(dòng)物經(jīng)先前象限的對(duì)側(cè)入水，并記錄大鼠途經(jīng)有效區(qū)及虛擬平臺(tái)的停留時(shí)間、距離、次數(shù)、有效停留時(shí)間距離和轉(zhuǎn)向角等檢測(cè)指標(biāo)。

1.5 動(dòng)物處死與標(biāo)本收集 所有大鼠測(cè)試后稱重，用 10%的水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，將各組動(dòng)物快速斷頭處死。標(biāo)本收集在冰盤(pán)上快速剖取腦組織，吸取血跡，稱量左側(cè)皮層腦組織100 mg左右，加預(yù)冷的生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃3 000 r/min，離心10 min，取上清液，儲(chǔ)存-20℃冰箱備用。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色 顯微鏡下觀察VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，每只大鼠抽取隨機(jī)切片2張，觀察4個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)4個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞的總數(shù)，然后計(jì)算平均數(shù)。Ⅷ因子應(yīng)用在微血管密度(MVD)計(jì)算方面，隨機(jī)取大鼠切片2張，選擇皮質(zhì)區(qū)血管最豐富4處置于100倍鏡下觀察；微血管數(shù)量及計(jì)算每mm2內(nèi)微血管量置于400倍鏡下觀察。

1.7 細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax檢測(cè) 采用免疫組化SABC方法檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：光鏡下(1)出現(xiàn)棕黃色顆粒Bcl-2蛋白；(2)棕黃色顆粒Bax蛋白可見(jiàn)于胞質(zhì)及核膜內(nèi)；高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)不重疊的胞質(zhì)內(nèi)皮質(zhì)缺血區(qū)并計(jì)算出平均細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測(cè)結(jié)果 給藥后，升降散組和模型組大鼠的學(xué)習(xí)次數(shù)高于假手術(shù)組、正常組，正確次數(shù)均低于假手術(shù)組、正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而升降散組大鼠學(xué)習(xí)次數(shù)低于模型組、正確次數(shù)高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 VEGF陽(yáng)性細(xì)胞的胞膜或胞質(zhì)為深棕黃色。見(jiàn)圖1。正常組〔(54.78±3.53)個(gè)〕和假手術(shù)組〔(59.58±3.35)個(gè)〕大鼠僅有少量VEGF陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升降散組〔(82.89±3.25)個(gè)〕顯著高于其他三組，模型組為〔(71.12±5.47)個(gè)〕(P<0.01)。

2.3 MVD檢測(cè)結(jié)果 400倍光鏡下觀察，染色微血管形態(tài)無(wú)規(guī)則性，血管含有和不含有單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成管腔血管比例相當(dāng)，內(nèi)皮細(xì)胞排列成條狀或聚集成細(xì)胞團(tuán)簇，或僅單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞。見(jiàn)圖2。MVD模型組〔(21.78±2.76)個(gè)/mm2〕與其他三組〔正常組(16.78±1.58)個(gè)/mm2，假手術(shù)組(18.80±1.69)個(gè)/mm2，升降散組(31.68±2.87)個(gè)/mm2〕比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

組別學(xué)習(xí)次數(shù)正確次數(shù)正常組31.17±3.127.85±0.81假手術(shù)組32.98±3.257.55±0.78模型組54.47±5.064.80±0.79升降散組40.12±3.856.21±0.88F/P值12.358/0.004213.054/0.0032

圖1 各組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞(DAB，×400)

圖2 各組Ⅷ因子標(biāo)記陽(yáng)性血管(DAB，×400)

2.4 海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡結(jié)果 給藥后，大鼠海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)升降散組為(18.28±4.43)個(gè)，顯著高于正常組〔(2.64±1.37)個(gè)〕和假手術(shù)組〔(3.81±1.85)個(gè)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而顯著低于模型組〔(28.89±5.58)個(gè)〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.5 海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax免疫組化結(jié)果 給藥后，大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2和Bax 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)模型組均高于正常組和假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，升降散組大鼠海馬CA1區(qū)Bax 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖4。

圖3 凋亡細(xì)胞染色結(jié)果(×400)

組別Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Bax陽(yáng)性細(xì)胞正常組3.12±1.353.23±0.75假手術(shù)組3.64±1.473.55±0.77模型組14.25±2.3135.18±1.56升降散組25.20±2.2117.58±1.34F/P值20.422/<0.000132.054/<0.0001

圖4 Bcl-2、Bax免疫組化染色結(jié)果(DAB，×400)

3 討 論

VD屬于臨床常見(jiàn)的老年慢性疾病，影響發(fā)病的因素較多，持續(xù)性高血壓可損傷小動(dòng)脈，增大血管阻力并減少血流量，造成心律失常而使血流量急劇降低，部分患者脂肪沉積在血管壁形成粥樣硬化斑塊也與VD發(fā)病相關(guān)。VD主要是由于腦血管病變引發(fā)腦組織缺氧、缺血而損傷腦部記憶、認(rèn)知等特定神經(jīng)組織所致〔3〕。患者出現(xiàn)腦缺血缺氧病理生理改變，缺氧狀態(tài)下大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、蒼白球等最容易受到損傷，腦缺血后使能量供應(yīng)不足，細(xì)胞釋放大量谷氨酸，細(xì)胞外液谷氨酸水平急劇升高，過(guò)度激活相應(yīng)受體而使鈣離子內(nèi)流，誘發(fā)酶信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，合成大量自由基而損傷細(xì)胞質(zhì)、脂肪酸，而細(xì)胞去極化釋放的鉀離子可引發(fā)梗死處去極化，此外自由基還可激活炎癥因子，加劇炎癥反應(yīng)并合成自由基從而進(jìn)入惡性循環(huán)〔4〕。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為本病病位在腦和心，同肝脾肺腎臟腑功能失衡相關(guān)，腦為髓海，是元神之府，人至暮年，臟腑功能減退，肝腎虧虛，腎中精氣不足，不能生髓，髓?？仗?，進(jìn)而神機(jī)失用形成呆證；另一方面部分患者平素憂思多慮，積怒傷肝，肝失疏泄，肝氣郁滯，肝郁乘脾，脾失健運(yùn)，痰濁內(nèi)生，痰濁上擾蒙蔽清竅，思慮過(guò)度則耗上心脾，暗耗陰血，氣血生化乏源，氣血不足，不能充養(yǎng)腦髓，腦失所養(yǎng)，神機(jī)失用，造成神志失常，形成呆證，因此本病病位在心腦，病性屬于本虛標(biāo)實(shí)，因此在治療上需要制定以調(diào)暢氣機(jī)、補(bǔ)充血脈為原則的治療方案〔5〕。

腦作為人體耗氧量最多的器官之一，其中不飽和脂肪酸含量豐富，一旦發(fā)生缺血缺氧就會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基，自由基化學(xué)性質(zhì)活潑，能夠直接攻擊生物膜磷脂中不飽和脂肪酸，造成大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷繼而讓神經(jīng)元丟失產(chǎn)生癡呆〔6〕。自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在中樞神經(jīng)病變中起到了重要作用，其引發(fā)損傷一直貫穿神經(jīng)損傷進(jìn)程，自由基最容易攻擊腦細(xì)胞膜中多不飽和酸雙鍵，還可以繼續(xù)損傷蛋白與核酸，引發(fā)細(xì)胞進(jìn)一步凋亡與蛋白質(zhì)和DNA破壞。VD同梗死面積和低灌注具有很好的相關(guān)性，梗死灶的數(shù)量與范圍是決定癡呆發(fā)生的重要因素。研究顯示人體腦缺血和缺氧后，通過(guò)旁分泌機(jī)制促進(jìn)了酪氨酸激酶受體-4和特異性酪氨酸激酶受體-1表達(dá)過(guò)程，誘導(dǎo)體內(nèi)VEGF，激活細(xì)胞信號(hào)及轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，加快內(nèi)皮細(xì)胞的增殖速率而形成新血管，并發(fā)揮加速神經(jīng)干細(xì)胞增殖及保護(hù)神經(jīng)元的作用，有效減少神經(jīng)元缺損〔7〕。改善局部的微循環(huán)及促進(jìn)血管再生對(duì)治療VD具有重要意義，VEGF則在正調(diào)節(jié)因子中較為重要，特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，起到了再生血管形成的啟動(dòng)效果〔8〕。

Ⅷ因子可以判斷血管密度，進(jìn)而判定腦組織中新生血管數(shù)量，同樣可以體現(xiàn)對(duì)VD改善的效果。細(xì)胞凋亡是一個(gè)基因控制細(xì)胞死亡的過(guò)程，主要包括兩方面：Bax為主導(dǎo)的促細(xì)胞凋亡；Bcl-2基因?yàn)橹鲗?dǎo)的抗細(xì)胞凋亡。調(diào)控細(xì)胞凋亡的過(guò)程由兩者表達(dá)水平?jīng)Q定，Bcl-2是內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的一種，體內(nèi)高Bcl-2可以阻滯多種凋亡因子，延長(zhǎng)了細(xì)胞壽命，而過(guò)度Bax表達(dá)可通過(guò)形成同源二聚體而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9，10〕。

中藥升降散方中僵蠶性溫，歸心、脾、肺、肝經(jīng)，發(fā)揮清熱解郁、祛風(fēng)除濕、化痰散結(jié)的作用，藥性輕浮上升，屬于陽(yáng)中之陽(yáng)，引諸藥上行，直達(dá)病所，《本草綱目》中記載：“治風(fēng)化痰，散結(jié)行經(jīng)，所謂因其氣相感，而以意使之者也。蓋厥陰、陽(yáng)明之藥，故又治諸血病、癥病、拒病也”〔11〕；蟬蛻甘咸，其氣清肅，升浮宣透，能夠清熱解毒宣毒透表；姜黃氣味辛苦性寒，可以行氣活血化瘀，暢通氣機(jī)，活血通絡(luò)，溫散寒邪，助僵蠶和蟬蛻散郁火；大黃作為使藥，苦寒泄瀉，通腑化瘀，清熱瀉火，擅長(zhǎng)降濁陰，攻積導(dǎo)滯，推陳出新，讓體內(nèi)血液通暢而氣行；全方合用寒溫并用，升降同施，具有升清降獨(dú)、通里達(dá)表、宣郁散火、活血化癖、驅(qū)風(fēng)勝濕、鎮(zhèn)驚止痙的作用。

本研究顯示，升降散應(yīng)用在VD模型大鼠中能夠改善學(xué)習(xí)記憶功能。升降散可能是通過(guò)促進(jìn)缺血區(qū)血管生成、改善局部血液循環(huán)發(fā)揮作用。升降散可能通過(guò)下調(diào)Bax蛋白和上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡，并對(duì)VD大鼠認(rèn)知功能起到改善作用。

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〔2016-04-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

馬 健(1959-)，男，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)腦病基礎(chǔ)及臨床研究。

史江峰(1971-)，男，碩士，主任中醫(yī)師，主要從事腦病中醫(yī)基礎(chǔ)及臨床研究。

R749

A

1005-9202(2017)06-1341-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.016

1 徐州市中醫(yī)院腦病科