萊菔硫烷對大鼠移植心臟細胞凋亡的影響

韓 燕 李占清 鄔鵬宇 楊述亮 王耕野 王 帥 楊 方 鄭素琴 伊 雪

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河北 唐山 063000)

萊菔硫烷對大鼠移植心臟細胞凋亡的影響

韓 燕 李占清1鄔鵬宇1楊述亮1王耕野1王 帥1楊 方 鄭素琴 伊 雪

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河北 唐山 063000)

目的 探討萊菔硫烷(SFN) 預(yù)處理對大鼠心臟移植后心肌缺血再灌注損傷導(dǎo)致的細胞凋亡的影響及可能機制。方法 健康雄性SD大鼠30只隨機分成A組(假手術(shù)組，n=6)，B組(缺血再灌注組，n=12)，C組(SFN預(yù)處理組，n=12)。應(yīng)用HE染色法、Western印跡法觀察心肌組織學(xué)及核因子相關(guān)因子(Nrf)2、血紅素加氧酶(HO)-1、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的蛋白表達水平。結(jié)果 與B組比較，C組心肌組織損傷減輕，心肌組織Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白水平升高(P<0.01)，并且Bcl-2/Bax也升高(P<0.01)，而Bax蛋白水平降低(P<0.01)；但與A組比較，心肌組織仍未恢復(fù)至正常；心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax蛋白水平仍高于正常(P<0.01)，Bcl-2/Bax水平無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論 SFN可能通過激活Nrf2-ARE通路，上調(diào)Bcl-2/Bax比值，提高心肌細胞抗凋亡防御能力，對抗移植心臟冷缺血再灌注損傷。

萊菔硫烷；缺血再灌注損傷；核因子相關(guān)因子2；血紅素加氧酶1；B細胞淋巴瘤/白血病-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白

萊服硫烷(SFN)在心臟移植冷缺血再灌注損傷(IRI)中已經(jīng)證實通過抗凋亡起保護作用〔1〕，但其機制尚不清楚。故本實驗通過SFN預(yù)處理受體大鼠，建立大鼠心臟移植模型，觀察核因子相關(guān)因子(Nrf)2、血紅素加氧酶(HO)-1、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達，研究SFN是否通過Nrf2-ARE信號通路對抗心臟移植IRI凋亡起保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SD大鼠30只，體重200～220 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXX(京)2011-007。SFN (美國LKT Lab.)，兔抗Nrf2多克隆抗體(英國EterLife公司)，兔抗HO-1多克隆抗體(美國Enzo公司)，兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體(美國Abcam公司)、抗β-actin多克隆抗體(杭州華安生物公司)。

1.2 動物分組及模型制備 按照李占清等〔1〕的方法將冷藏于4℃ HTK 液9 h的供心移植到受體大鼠腹腔，建立大鼠異體異位心臟移植模型。動物隨機分為：A組(假手術(shù)組：僅行開關(guān)腹手術(shù)，術(shù)前24 h經(jīng)鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，n=6)，B組(缺血再灌注組：受體于移植前24 h經(jīng)鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，n=12)，C組(SFN處理組：受體于移植前24 h經(jīng)尾靜脈注射SFN2.5 mg/kg，n=12)。其中B組和C組移植后24 h均將移植心臟取出；A組開/關(guān)腹24 h后取自體心臟。

1.3 心肌組織學(xué)變化 10%甲醛溶液固定心肌組織、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，切片，HE染色后觀察心肌組織學(xué)變化。

1.4 Western印跡檢測Nrf2、HO-1、Bax和Bcl-2蛋白表達 將各組適量大鼠心肌組織置入細胞裂解液中提取蛋白質(zhì)，-80℃保存?zhèn)溆?。二喹啉甲?BCA)法蛋白定量后；每孔加入50 μg蛋白樣品電泳；用聚偏二氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜；依分子質(zhì)量大小切取條帶，取相應(yīng)條帶分別加入Nrf2多克隆抗體(1∶500)、HO-1多克隆抗體(1∶1 000)，β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，Bax單克隆抗體(1∶1 000)，Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)4℃過夜；TBST沖洗后，分別與生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗(1∶1 000)室溫震蕩孵育2 h；TBST洗滌后，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。β-actin作為蛋白內(nèi)對照參數(shù)，用Image J軟件進行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織學(xué) A組：大鼠心肌細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，組織間隙無炎性細胞滲出，胞核清晰。B組：心肌細胞排列紊亂，大量心肌細胞水腫，心肌損壞嚴重。C組：心肌細胞排列較整齊，心肌損傷減輕。見圖1。

2.2 Western印跡 與A組比較，B組心肌細胞Nrf2、HO-1、Bax蛋白表達增加(P<0.01)，而Bcl-2和Bcl-2/Bax表達降低(P<0.01)；與B組比較，C組Nrf2、HO-1蛋白進一步增加(P<0.01)，Bcl-2和Bcl-2/Bax 也升高(P<0.01)，而Bax 的表達降低(P<0.01))。見表1，圖2。

圖1 各組心肌組織的組織學(xué)變化(HE,×200)

組別Nrf2HO-1Bcl-2BaxBcl-2/BaxA組0.45±0.020.67±0.030.78±0.050.43±0.011.83±0.07B組0.92±0.051)0.91±0.021)0.59±0.011)0.90±0.021)0.65±0.011)C組1.01±0.031)2)1.05±0.031)2)1.09±0.021)2)0.61±0.011)2)1.78±0.041)

與A組比較：P<0.01；與B組比較：2)P<0.01

圖2 Western印跡檢測各組心肌組織Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax的表達

3 討 論

過量的氧自由基可以直接損傷DNA誘發(fā)心肌細胞凋亡，Nrf2/ARE通路在調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，通過介導(dǎo)下游Ⅱ相酶如HO-1等的活性，來維持機體氧化還原狀態(tài)的平衡并降低氧化應(yīng)激造成的損傷〔2〕。SFN可通過激活Nrf2/ARE通路，誘導(dǎo)下游抗氧化酶的表達，抑制氧化應(yīng)激損傷，對創(chuàng)傷后腦損傷的神經(jīng)起保護作用〔3〕。本實驗結(jié)果表明SFN預(yù)處理激活了Nrf2/ARE信號通路，對移植心臟起了保護作用。

細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞死亡的最主要形式〔4〕，近年來研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2的同源基因，功能相反。Bcl-2與Bax可共同調(diào)節(jié)細胞凋亡，與Bcl-2/Bax的比值有關(guān)，比值增大，抑制細胞凋亡，反之

則使細胞凋亡增多〔5〕。劉景詩〔6〕通過冠脈轉(zhuǎn)染Nrf2腺病毒，建立心肌缺血再灌注模型，結(jié)果表明，通過激活Nrf2-Keap1-ARE信號通路，上調(diào)Bcl-2/Bax的比值抑制心肌細胞凋亡保護缺血再灌注心肌。本實驗結(jié)果表明心臟移植后，心肌細胞損傷嚴重，SFN預(yù)處理增加了Bcl-2/Bax的比值，抑制了心臟移植中冷IRI引起的心肌細胞凋亡。

1 李占清，伊 雪，鄔鵬宇，等.萊菔硫烷對大鼠移植冷缺血再灌注的保護作用〔J〕.中華胸心血管外科雜志，2014;30(4)：234-7.

2 Heiss EH，Schachner D，Zimmermann K，etal.Glucose availability is a decisive factor for Nrf2-mediated gene expression〔J〕.Redox Biol，2013;1(1)：359-65.

3 Hong Y，Yall W，Chen S，etal.The role of Nrf2 signaling in the regulation of antioxidant and detoxifying enzymes after traumatic brain injury in rats and mice〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010;31(11)：1421-30.

4 吳錦波，吳平生.心肌缺血/再灌注損傷與細胞凋亡〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2011;17(19)：2961-3.

5 Zhang H，Li Q，Li Z，etal.The protection of Bcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro〔J〕.Neurosci Res，2008;62(2)：140-6.

6 劉景詩.冠脈轉(zhuǎn)染Nrf2基因?qū)Υ笫笕毖俟嘧⑿募〉谋Ｗo作用及機制的研究〔D〕.長沙：中南大學(xué)，2010.

〔2015-08-24修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

留學(xué)回國人員科研啟動基金(教外司留〔2010〕1561號)

伊 雪(1971-)，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事缺血再灌注研究。

韓 燕(1982-)，女，碩士，講師，主要從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。

R965

A

1005-9202(2017)06-1335-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.013

1 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科