亞硒酸鈉調(diào)控AMPK/mTOR信號通路對結直腸癌細胞增殖凋亡的影響及機制

廖漓漓 何少忠 涂江江 齊廣瑩 陳 瑩 張劍波

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

亞硒酸鈉調(diào)控AMPK/mTOR信號通路對結直腸癌細胞增殖凋亡的影響及機制

廖漓漓 何少忠 涂江江 齊廣瑩 陳 瑩1張劍波2

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣西 桂林 541001)

目的 探討亞硒酸鈉調(diào)控AMPK/mTOR信號通路對結直腸癌細胞增殖凋亡的影響及機制。方法 培養(yǎng)人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116，用1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理細胞48 h，CCK8試驗檢測不同濃度亞硒酸鈉對細胞增殖的影響；10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29 12、24、48、72 h后，CCK8試驗檢測亞硒酸鈉作用不同時間對細胞增殖的影響；10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29 48 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡率并用Western印跡檢測蛋白表達。結果 隨著亞硒酸鈉濃度的增加，人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和HCT116的抑制率增大，具有濃度依賴性，亞硒酸鈉對人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和HCT116的IC50分別為(5.060±1.01)、(6.701±1.21)、(7.471±1.47)μmol/L，后期選擇人結直腸癌細胞株HT-29為研究對象；10和20 μmol/L的亞硒酸鈉對細胞的抑制率在各個時間點都顯著高于0 h抑制率(P<0.01)，且隨著時間的延長抑制率增加；10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理后細胞的凋亡率均顯著高于0 μmol/L，具有濃度依賴性(P<0.01)，細胞中p-AMPK和Bax的蛋白表達顯著高于0 μmol/L組，p-mTOR和Bcl-2的蛋白表達顯著低于0 μmol/L組且具有濃度依賴性(P<0.01)。結論 亞硒酸鈉能抑制人結直腸癌細胞株HT-29的增殖，促進細胞的凋亡，使Bcl-2蛋白表達下降，Bax蛋白表達上升，可能與AMPK/mTOR信號通路調(diào)控有關。

亞硒酸鈉；結直腸癌；AMPK/mTOR；增殖；凋亡

我國結直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢〔1,2〕。目前治療主要采取手術切除和放化療輔助，但都有一定的局限性〔3〕。硒是人體必需的微量元素，對人體的健康具有重要影響〔4〕。硒的生物學特性非常廣泛，可誘導肺癌、胃癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的凋亡〔5～7〕。亞硒酸鈉是研究最早的一種無機硒化合物，同樣能誘導腫瘤細胞的凋亡〔8〕，但亞硒酸鈉對結直腸癌細胞的影響及機制的研究較少，本文旨在探討硒酸鈉對結直腸癌細胞增殖凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116購自中國科學院細胞庫。主要試劑和儀器：兔抗鼠Bcl-2、Bax多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；p-AMPK和 p-mTOR抗體購自Cell Signaling Technology 公司；青鏈霉素購自華北制藥廠；RPMI1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自Invitrogen公司；CCK8細胞增殖試劑盒購自北京莊盟有限公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon；流式細胞儀均購自美國BD公司；酶標儀購自美國Bio-rad公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出裝有人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116的凍存管，立即放入37℃水浴鍋中并輕輕搖動凍存管使其在1 min內(nèi)溶解。在凍存管中加入含有10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入細胞生長液懸浮細胞后，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新的培養(yǎng)基。細胞融合度達到90%以上時，加入胰酶消化細胞，完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，離心，倒掉培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代。

1.2.2 不同濃度亞硒酸鈉對細胞增殖的影響 取生長至對數(shù)期的人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116，0.25%的胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，調(diào)整細胞濃度為5×103個/ml，每孔加入100 μl細胞懸液，接種于96孔板中，37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞貼壁后，棄去上清，加入終濃度為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉，不加亞硒酸鈉為對照組，置于37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)箱孵育3 h，用酶標儀在波長為490 nm處測定并記錄各組的吸光度OD，計算細胞增殖抑制率及IC50，細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 亞硒酸鈉作用不同時間對細胞增殖的影響 取生長至對數(shù)期的人結直腸癌細胞株HT-29，細胞生長液懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為每毫升含有2×104個細胞，細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μl細胞懸液，37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為10、20 μmol/L的亞硒酸鈉，不加亞硒酸鈉的為對照組，置于37℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)箱孵育3 h，酶標儀記錄各組的吸光度OD，計算細胞增殖抑制率，細胞抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.4 亞硒酸鈉對細胞凋亡的影響 采用Annexin V/PI雙染法，用10、20 μmol/L的亞硒酸鈉處理人結直腸癌細胞株HT-29 48 h后，胰蛋白酶消化細胞，PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度每毫升含有2×106個細胞，取出1 ml細胞懸浮液，4℃ 1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌細胞3次，向細胞中加入200 μl緩沖液重懸細胞，分別加入10 μl PI和 Annexin-V，混合均勻后室溫避光靜置20 min，加400 μl緩沖液，流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 Western印跡檢測蛋白表達 取生長至對數(shù)期的人結直腸癌細胞株HT-29，培養(yǎng)基懸浮細胞后接種于培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁及同步化處理后加入10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于細胞48 h，預冷的PBS洗滌細胞，適量的裂解液冰上裂解30 min，收集細胞，4℃ 13 000 r/min離心15 min，收集上清。按照試劑盒說明提取細胞蛋白并測定提取的蛋白濃度。將蛋白樣品和上樣緩沖液充分混勻，電泳分離，4℃轉(zhuǎn)膜過夜。取膜，TBST洗膜3次，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗、二抗孵育。TBST洗膜3次，顯影，通過掃描系統(tǒng)分析蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1 不同濃度亞硒酸鈉對細胞增殖的影響 1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116 48 h后，CCK8檢測結果顯示，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和HCT116的抑制率增大，具有濃度依賴性。亞硒酸鈉對人結直腸癌細胞株HT-29、SW620和 HCT116的IC50分別為(5.060±1.01)、(6.701±1.21)、(7.471±1.47)μmol/L，后期選擇人結直腸癌細胞株HT-29為研究對象。見表1。

2.2 亞硒酸鈉作用不同時間對細胞增殖的影響 10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29 12、24、48、72 h后CCK8檢測結果顯示，10和20 μmol/L的亞硒酸鈉對細胞的抑制率在各個時間點都顯著高于0 h抑制率(P<0.01)，且隨著時間的延長抑制率增加。見表2。

2.3 亞硒酸鈉對細胞凋亡的影響 10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29 48 h后，細胞的凋亡率〔(1.28±0.26)%、(11.24±2.12)%〕均顯著高于對照組〔(25.37±2.23)%〕，具有濃度依賴性(P<0.01)。

2.4 Western印跡檢測蛋白的表達 10、20 μmol/L的亞硒酸鈉作用于人結直腸癌細胞株HT-29 48 h后，細胞中Bax和p-AMPK的蛋白表達顯著高于0 μmol/L組，Bcl-2和p-mTOR的蛋白表達顯著低于0 μmol/L組(P<0.01)，且具有濃度依賴性。見圖1，表3。

組別HT-29SW620HCT1160μmol/L1.8±0.661.74±0.611.83±0.621.25μmol/L13.21±2.561)10.32±1.981)9.02±1.561)2.5μmol/L27.32±2.371)22.32±2.211)19.26±3.021)5μmol/L48.62±2.741)41.57±2.631)38.43±3.211)10μmol/L67.36±2.681)61.36±3.111)58.89±1.981)20μmol/L85.87±2.571)80.58±2.231)77.62±1.871)

與0 μmol/L比較：1)P<0.01

組別10μmol/L20μmol/L0h1.81±0.361.84±0.3712h19.88±3.121)27.23±3.231)24h41.36±3.331)62.61±3.321)48h66.36±3.431)83.87±3.451)72h81.93±3.521)95.42±3.651)

與0 h比較：1)P<0.01

圖1 亞硒酸鈉對細胞中蛋白表達的影響

亞硒酸鈉濃度(μmol/L)Bcl-2Baxp-AMPKp-mTOR00.289±0.0090.010±0.0070.247±0.0090.321±0.010100.157±0.0081)0.192±0.0081)0.371±0.0111)0.142±0.0081)200.090±0.0061)0.357±0.0101)0.489±0.0121)0.011±0.0071)

與0 μmol/L組比較：1)P<0.01

3 討 論

腫瘤是機體在致癌因素作用下，局部組織細胞不能被正常調(diào)控而出現(xiàn)的異常增生或是分化而形成。惡性腫瘤的增殖及擴散非?？欤蓪е聶C體嚴重受損最終死亡，給人類的健康造成很大的威脅〔9,10〕。結直腸癌是消化道中高發(fā)的一種惡性腫瘤，隨著人類飲食、環(huán)境等的改變，我國結直腸癌的發(fā)病率持續(xù)上升〔11〕。我國對結直腸癌的治療一般采用手術治療，放化療輔助，對于晚期結直腸癌，一般采用全身化療〔12〕。大多數(shù)化療藥物都存在一定的毒副作用，因此開發(fā)出有效、毒副作用小的化療藥物治療結直腸癌非常重要。硒是人體必需的一種微量元素，其防癌和抗癌作用已受到廣大研究者的關注。亞硒酸鈉是一種無機硒，能誘導多種腫瘤細胞的凋亡〔13～15〕，但對于每一種腫瘤，亞硒酸鈉誘導細胞凋亡的機制并不一樣。研究顯示，亞硒酸鈉能抑制胃癌、肺癌等腫瘤細胞的增殖，促進細胞的凋亡且作用隨著濃度的增加而增加〔13,14〕。本研究結果均說明，亞硒酸鈉能抑制結直腸癌細胞的增殖，促進細胞凋亡。

細胞的凋亡是由多個因子和因素控制的，如caspase家族、Bcl-2家族、原癌基因和抑癌基因等〔16〕。Bcl-2是Bcl-2家族的抑凋亡基因，Bax是Bcl-2家族的促凋亡基因，兩者之間可形成同源二聚體和異源二聚體〔17〕。有研究指出，細胞的凋亡取決于Bax和Bcl-2的比率，Bcl-2的表達下降而同時Bax的表達上升，則發(fā)揮促細胞凋亡的作用，反之則抑制細胞的凋亡〔18,19〕。本研究說明Bax和Bcl-2的比率促進了細胞的凋亡。

AMPK是一種異源三聚體蛋白，由α催化亞基和β、γ調(diào)節(jié)亞基組成，它能調(diào)控細胞的能量代謝并通過p53和mTOR調(diào)控細胞的凋亡〔20〕。研究證實，在多種腫瘤細胞中，AMPK都能被異常激活，AMPK磷酸化的激活可對mTOR、P13K等一些在細胞能量代謝過程中的關鍵蛋白激酶進行調(diào)控，從而影響細胞凋亡〔21〕。本研究說明亞硒酸鈉可能通過激活AMPK信號通路，進而抑制mTOR信號通路，從而促進細胞凋亡。

1 Cohen SA,Qu C,Harrison TA,etal.Assessment of candidate host “progression genes” in the development of advanced colorectal cancer〔J〕.Cancer Res,2016;76(14 Suppl):1622.

2 Ferlay J,Soerjomataram I,Dikshit R,etal.Cancer incidence and mortality worldwide:sources,methods and major patterns in GLOBOCAN 2012〔J〕.Int J Cancer,2015;136(5):E359-E386.

3 Van Cutsem E,Lenz HJ,K?hne CH,etal.Fluorouracil,leucovorin,and irinotecan plus cetuximab treatment and RAS mutations in colorectal cancer〔J〕.J Clin Oncol,2015;33(7):692-700.

4 荊 芬.新型有機硒化合物的合成及其抗癌活性的研究〔D〕.天津：天津理工大學,2015.

5 王 艷,趙 上,蘇衍萍,等.亞硒酸鈉通過線粒體途徑誘導人胃癌 SGC-7901 細胞凋亡的機制〔J〕.解剖學報,2016;47(3):353-8.

6 Ying Q,Ansong E,Diamond AM,etal.Selenium-binding protein 1-mediated tumor suppression is associated with alterations of lipid/glucose metabolic pathways in vivo〔J〕.Cancer Res,2015;75(15 Suppl):1197.

7 Barrington WE,Schenk JM,Etzioni R,etal.Difference in association of obesity with prostate cancer risk between US African American and non-Hispanic white men in the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial(SELECT)〔J〕.JAMA Oncol,2015;1(3):342-9.

8 胡 博.Na_2SeO_3 誘導腫瘤細胞凋亡過程中硒醇和活性氧的檢測〔D〕.濟南：山東師范大學,2015.

9 張洪彥.結腸癌合并腸梗阻治療體會〔J〕.臨床合理用藥雜志,2015;8(8):167.

10 王 健,宋秀宇,徐文貴.18F-FDG PET/CT 顯像在結直腸癌診斷中的應用價值〔J〕.國際醫(yī)學放射學雜志,2016;39(3):291-5.

11 Zhao J,Zhu X,Shrubsole MJ,etal.Calcium to magnesium intake ratio and colorectal carcinogenesis,results from the Prostate,Lung,Colorectal,and Ovarian cancer screening trial〔J〕.Cancer Res,2016;76(14 Suppl):1739.

12 鄭民華,馬君俊.結直腸癌肝轉(zhuǎn)移的腹腔鏡微創(chuàng)手術治療〔J〕.中華胃腸外科雜志,2015;18(6):521-4.

13 Yang Y,Luo H,Hui K,etal.Selenite-induced autophagy antagonizes apoptosis in colorectal cancer cells in vitro and in vivo〔J〕.Oncol Rep,2016;35(3):1255-64.

14 Mix M,Ramnath N,Gomez J,etal.Effects of selenomethionine on acute toxicities from concurrent chemoradiation for inoperable stage Ⅲ non-small cell lung cancer〔J〕.World J Clin Oncol,2015;6(5):156.

15 Cristóbal I,González-Alonso P,Daoud L,etal.Activation of the tumor suppressor PP2A emerges as a potential therapeutic strategy for treating prostate cancer〔J〕.Marine Drugs,2015;13(6):3276-86.

16 張逸平,李正祎.IL-24 聯(lián)合大蒜素體外抗肺癌細胞生長的實驗研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2016;17(3):335-8.

17 劉黎明,張建軍,胡東輝.抗纖軟肝膠囊對肝纖維化大鼠肝組織 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達的影響〔J〕.中國老年學雜志,2016;36(11):2615-6.

18 Zhao B,He T.Chidamide,a histone deacetylase inhibitor,functions as a tumor inhibitor by modulating the ratio of Bax/Bcl-2 and P21 in pancreatic cancer〔J〕.Oncol Rep,2015;33(1):304-10.

19 Wang J,Wei T,Gao J,etal.Effects of Naringenin on inflammation in complete freund's adjuvant-induced arthritis by regulating Bax/Bcl-2 balance〔J〕.Inflammation,2015;38(1):245-51.

20 任新華,王衛(wèi)平.細胞自噬在腫瘤化療耐藥中的作用〔J〕.中國生物化學與分子生物學報,2015;31(5):448-54.

21 Mao N,Tan RZ,Wang SQ,etal.Ginsenoside Rg1 inhibits angiotensin Ⅱ-induced podocyte autophagy via AMPK/mTOR/PI3K pathway〔J〕.Cell Biol Int,2016;40(8):917-25.

〔2016-11-02修回〕

(編輯 郭 菁)

更正 曹正濤所撰寫論文《老年中低位直腸癌患者手助腹腔鏡與開腹直腸癌根治術的療效比較》已在我刊2016年36卷第20期第5043～5045頁發(fā)表，作者曹正濤單位應為：天津醫(yī)科大學研究生院。

廣西自然科學基金面上項目(2013GXNSFAA019353)

張劍波(1965-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤研究。

廖漓漓(1971-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤臨床研究。

R735.3+7

A

1005-9202(2017)06-1313-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.005

1 桂林醫(yī)學院病理生理教研室 2 桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科