被轉(zhuǎn)化生長因子β活化的長鏈非編碼RNA對人淋巴瘤Raji細胞增殖、周期及凋亡的影響

趙偉，李曉明

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

被轉(zhuǎn)化生長因子β活化的長鏈非編碼RNA對人淋巴瘤Raji細胞增殖、周期及凋亡的影響

趙偉1，李曉明2

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的 研究被轉(zhuǎn)化生長因子β活化的長鏈非編碼RNA（LncRNA-ATB）對人淋巴瘤Raji細胞增殖、凋亡和周期的影響及其潛在機制。方法 通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測LncRNA-ATB短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）和miR-200c模擬物（miR-200c mimics）效果，以及LncRNA-ATB、miR-200c和鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）的表達；噻唑藍（MTT）法檢測沉默LncRNA-ATB對Raji細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)檢測LncRNA-ATB對Raji細胞凋亡和周期的影響；熒光素酶報告基因（Luciferase）實驗檢測KRAS是否為miR-200c的直接靶基因。結(jié)果 LncRNA-ATB-shRNA可有效沉默Raji細胞中LncRNAATB的表達，沉默LncRNA-ATB的表達可抑制Raji細胞的增殖能力，促進Raji細胞的凋亡能力，并使Raji細胞的周期阻滯于G1期。進一步研究顯示LncRNA-ATB可作為ceRNA與miR-200c競爭性地調(diào)控miR-200c直接靶分子KRAS的表達而促進腫瘤細胞增殖。結(jié)論 LncRNA-ATB可通過上調(diào)KRAS的表達而在淋巴瘤細胞的增殖、凋亡和周期過程中發(fā)揮著重要的作用。

被轉(zhuǎn)化生長因子β活化的長鏈非編碼RNA；Raji細胞；鼠類肉瘤病毒癌基因；miR-200c；增殖

淋巴瘤是一組起源于淋巴結(jié)或淋巴結(jié)以外的淋巴組織的高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，在我國，結(jié)外淋巴瘤較結(jié)內(nèi)淋巴瘤更為普遍[1]。根據(jù)病理學特征可分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，其中非霍奇金淋巴瘤為我國惡性淋巴瘤的主要類型[2]。近年來，我國惡性淋巴瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。隨著新型免疫治療和分子靶向治療在臨床上應用，某些亞型的惡性淋巴瘤的治療效果、預后和生存質(zhì)量較以往有了顯著提高。但仍有部分亞型的惡性淋巴瘤尚無有效的治療方案，臨床治療效果極差，5年生存率仍處于較低水平[3]。因此，目前急需尋找淋巴瘤潛在的治療靶點，并制定全新并有效的治療策略。

近年來，越來越多的研究證實非編碼RNA在人體多種疾病進程中發(fā)揮著至關重要的作用[4]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）為轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt但自身不編碼蛋白質(zhì)的RNA[5]。許多研究已證實，被轉(zhuǎn)化生長因子β活化的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA activated by TGF-β，LncRNA-ATB）在多種生理過程中起著關鍵作用，如細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[6-8]。因此，LncRNA可作為原癌基因參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。LncRNA-ATB是新近發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，定位于14號染色體[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA-ATB可通過與miR-200家族結(jié)合并調(diào)控其下游信號通路而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。然而Lnc RNA-ATB在血液系統(tǒng)腫瘤尤其是淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，目前尚無研究報道。本研究擬通過檢測沉默 Burkitt淋巴瘤 Raji細胞中 LncRNA-ATB的表達對Raji細胞的增殖、凋亡和周期的影響并檢測LncRNA-ATB、miR-200c及鼠肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）的相互作用關系，來研究LncRNA-ATB對Raji細胞增殖、凋亡和周期的影響并探討其發(fā)揮作用的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol試劑購自江蘇省海門市碧云天生物技術(shù)研究所，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購自日本TaKaRa公司，LncRNA-ATB-shRNA和miR-200c mimics由上海吉瑪公司設計并合成，LipofectamineTM2000試劑購于美國 Invitrogen公司，MTT試劑盒購自美國Promega公司，F(xiàn)ITC標記的Annexin-V及PI試劑購自美國BD公司，人淋巴瘤系Raji細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人淋巴瘤細胞系Raji用購自美國Gibco公司含100 ml/L胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的1640培養(yǎng)基，置于溫度37℃、50 ml/L二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達70%后，將LncRNA-ATB-shRNA及LncRNAATB NC經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入Raji細胞中，具體操作步驟參見脂質(zhì)體試劑說明書。將轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細胞分別為LncRNA-ATB-shRNA組和Lnc RNA-ATB NC組。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）待細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，用Trizol裂解Raji細胞，分別提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄以cDNA為模板。qRT-PCR的反應條件為：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，共35個循環(huán)，實驗重復3次。

1.2.3 MTT 細胞轉(zhuǎn)染48h后，取對數(shù)生長期的Raji細胞，制備單細胞懸液，以5.0×103/孔細胞密度接種于96孔板，每組設8個復孔，分別培養(yǎng)1～6 d，每孔加入20 μl濃度為1.5 g/L的MTT，培養(yǎng)4 h后每孔加入150μl甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），讀取吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.2.4 流式細胞術(shù) 取轉(zhuǎn)染48 h后的處理組細胞及對照細胞，用5 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），1000r/min離心5min，反復洗滌3次后，棄上清液；加入100 μl流式洗液和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的Annexin-V （20 μg/ml）10 μl，室溫避光30 min，再加入蛋白酶抑制劑(protease inhibitor，PI）（50μg/ml）5μl，避光反應10 min后，加入400 μl流式洗液，尼龍膜過濾細胞，除去細胞團塊后，立即利用流式細胞儀檢測。如檢測細胞凋亡，處理后同時以加入FITC標記的Annexin-V和PI的同型對照抗體細胞作為對照，尼龍膜過濾細胞，除去細胞團塊后，立即利用流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間的數(shù)據(jù)比較用t檢驗，多組間重復測量數(shù)據(jù)比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-ATB-shRNA

下調(diào)Raji細胞中LncRNA-ATB的表達轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC（LncATB-NC）及LncRNA-ATB-shRNA（Lnc-ATB-shRNA）于Raji細胞48 h后，分別提取兩組細胞總RNA，各自逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測兩組間LncRNA-ATB的相對表達量，結(jié)果顯示，qRT-PCR結(jié)果標準化后，LncRNA-ATB-NC組LncRNA-ATB表達量為（1.000± 0.050），則LncRNA-ATB-shRNA組LncRNA-ATB表達量為（0.381±0.083），經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=7.346，P=0.007），LncRNA-ATB-shRNA組中LncRNA-ATB表達較LncRNA-ATB-NC組下調(diào)。見圖1。

2.2 LncRNA-ATB-shRNA抑制Raji細胞的增殖

MTT檢測轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC與LncRNA-

圖1 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-shRNA和NC的Raji細胞中LncRNA-ATB表達水平

ATB-shRNA的Raji細胞的增殖情況。結(jié)果顯示：①不同時間點的OD值有差異（F=11.251，P=0.003）。②LncRNA-ATB-shRNA組與LncRNA-ATB-NC組與LncRNA-ATB-shRNA的Raji細胞的細胞凋亡情況，結(jié)果可見，LncRNA-ATB-NC組凋亡細胞百分比為（3.741±1.331）%，LncRNA-ATB-shRNA組凋亡細胞百分比為（11.517±4.319）%，經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=6.448，P=0.021），見圖3。Lnc RNA-ATB-shRNA組的Raji細胞的凋亡細胞數(shù)目較LncRNA-ATB-NC組增加。的OD值有差異（F=21.126，P=0.001），LncRNAATB-shRNA組與LncRNA-ATB-NC組相比在OD值較低，增殖速度較慢。③LncRNA-ATB-shRNA組與LncRNA-ATB-NC組的OD值變化趨勢有差異（F=11.119，P=0.007）見附表和圖2。從檢測后第3天開始，LncRNA-ATB-shRNA組細胞的增殖較對照組出現(xiàn)增殖抑制的現(xiàn)象。

2.3 LncRNA-ATB-shRNA促進Raj細胞的凋亡

流式細胞術(shù)檢測分別轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC

圖2 轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-shRNA與NC的Raji細胞的增殖情況

附表 兩組各時間點OD值比較 （n=3）

2.4 LncRNA-ATB-shRNA阻滯Raji細胞周期

流式細胞術(shù)檢測分別轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC 與LncRNA-ATB-shRNA的Raji細胞的細胞周期情況，結(jié)果可見，LncRNA-ATB-NC組G1期細胞百分比為（39.564±3.194）%，LncRNA-ATB-shRNA組G1期細胞百分比為（53.451±6.179）%，經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=3.153，P=0.037），見圖4。LncRNA-ATB-shRNA組的Raji細胞的G1期細胞數(shù)目較LncRNA-ATB-NC組增加。

圖3轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-shRNA與LncRNA-ATB-NC 的Raji細胞的凋亡情況

圖4轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-shRNA與LncRNA-ATB-NC的Raji細胞周期情況

2.5 Raji細胞LncRNA-ATB可調(diào)控miR-200c的表達

qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC與Lnc RNA-ATB-shRNA的Raji細胞中miR-200c的表達，以及轉(zhuǎn)染miR-200c-NC與miR-200c-mimics的Raji細胞中LncRNA-ATB的表達。結(jié)果顯示，qRTPCR結(jié)果標準化后，LncRNA-ATB-NC組miR-200c表達量為（1.000±0.050），則LncRNA-ATB-shRNA 組LncRNA-ATB表達量為（3.319±0.013），經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=10.473，P=0.011），見圖5A。轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-shRNA組的Raji細胞miR-200c的表達比LncRNA-ATB-NC組增加。而轉(zhuǎn)染miR-200c-NC與 miR-200c mimics的 Raji細胞LncRNA表達無變化（t=0.795，P=0.597），見圖5B。結(jié)果提示在淋巴瘤細胞系Raji細胞中LncRNA-ATB可調(diào)控miR-200c的表達。

2.6 miR-200c靶向抑制KRAS

上述結(jié)果提示，LncRNA-ATB可能作為ceRNA調(diào)控miR-200c的表達而參與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此，進一步檢測Raji細胞中miR-200c的靶基因。經(jīng)查閱既往文獻及網(wǎng)站預測，選取增殖相關基因KRAS作為下一步的研究重點[12-13]。Luciferase結(jié)果顯示，在淋巴瘤細胞Raji中KRAS為miR-200c直接靶基因（見圖6A）。結(jié)果顯示，qRT-PCR結(jié)果標準化后，miR-200c-NC組KRAS表達量為（1.000± 0.050），則 miR-200c mimics組KRAS表達量為（0.347±0.107），經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=4.195，P=0.027），見圖6B。miR-200c-mimics組的Raji細胞中KRAS的表達較miR-200c-NC降低。結(jié)果提示，在淋巴瘤Raji細胞中miR-200c可直接靶向抑制增殖相關基因KRAS的表達。

圖5 淋巴瘤Raji細胞中LncRNA-ATB與miR-200c的相互作用關系

2.7 Raji細胞LncRNA-ATB可調(diào)控KRAS的表達本研究利用qRT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染LncRNA-ATB-NC與 LncRNA-ATB-shRNA的Raji細胞中KRAS的表達。結(jié)果顯示，qRT-PCR結(jié)果標準化后，LncRNA-ATB-NC組KRAS表達量為（1.000±0.050），則LncRNA-ATB-shRNA組KRAS表達量為（0.547±0.047），經(jīng)t檢驗，兩組差異有統(tǒng)計學意義（t=3.198，P=0.41），見圖7。LncRNA-ATB-shRNA組的Raji細胞KRAS的表達較LncRNA-ATBNC組降低。結(jié)果提示，淋巴瘤Raji細胞中，LncRNAATB可競爭性地上調(diào)KRAS的表達而促進淋巴瘤的增殖。

圖6 淋巴瘤Raji細胞中miR-200c靶向抑制KRAS的表達

圖7 淋巴瘤Raji細胞中沉默LncRNA-ATB抑制KRSA的表達

3 討論

越來越多的研究證實，LncRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生及進展密切相關，其可通過不同機制在不同的調(diào)節(jié)水平發(fā)揮作用，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平，從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能。隨著2代測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的長鏈非編碼RNA被證實同淋巴瘤的惡性表型密切相關。研究表明，長鏈非編碼RNA HOTAIR和LUNAR1等均可促進淋巴瘤細胞的增殖并同彌漫性大B淋巴瘤的不良預后呈正相關[14-15]。由Notch活性調(diào)控的長鏈非編碼RNA LUNAR1可增強IGF1R mRNA的表達并維持IGF1信號，因此，LUNAR1對T細胞急性淋巴細胞白血病體內(nèi)和體外的增殖至關重要[16]。但惡性淋巴瘤特異性的長鏈非編碼RNA的相關研究仍較少，由于LncRNA具有高度組織特異性和時空特異性，目前急需進一步挖掘更多的與淋巴瘤發(fā)生及進展密切相關的LncRNA。LncRNA-ATB是新近鑒定出的可被TGF-β活化的長鏈非編碼RNA，可介導TGF-β的促轉(zhuǎn)移作用[11]。在胰腺癌[17]、結(jié)直腸癌[10]和前列腺癌等[18]多種實體腫瘤內(nèi)異常高表達，且與惡性腫瘤的不良預后密切相關，提示其可參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其生理功能和作用機制尚不完全清楚。然而，關于LncRNA-ATB在血液系統(tǒng)腫瘤尤其是惡性淋巴瘤發(fā)生、進展中的研究，目前國內(nèi)外尚無相關報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，沉默淋巴瘤Raji細胞LncRNA-ATB表達后，Raji細胞的增殖受到抑制，而凋亡能力則增加，此外其細胞周期亦阻滯于G1期，提示LncRNAATB可促進淋巴瘤細胞的增殖。既往文獻報道，LncRNA-ATB可在多種腫瘤細胞及瘢痕疙瘩成纖維細胞中作為競爭性內(nèi)源性RNA與miR-200c結(jié)合[19-20]。為尋找進一步的機制，筆者檢測Raji細胞中LncRNA-ATB與miR-200c的關系。結(jié)果顯示，LncRNA-ATB可調(diào)控miR-200c的表達，而miR-200c的表達則對LncRNA-ATB的表達無影響。上述結(jié)果提示LncRNA-ATB在淋巴瘤Raji細胞中亦作為ceRNA與miR-200c競爭性地調(diào)控其下游通路。

KRAS基因又稱為GTP酶KRA，于人類11、12及1號染色體定位。KRAS基因是一類癌基因，編碼大小為21kD的RAS蛋白，其具有GTP酶活性[21]。當原癌基因的RAS基因激活變?yōu)榘┗驎r，其表達產(chǎn)物KRAS蛋白的構(gòu)型和功能亦發(fā)生相應改變，活化的KRAS蛋白可持續(xù)性地激活下游信號通路，使細胞不可控制地增殖[22-23]。在淋巴瘤患者中約有10%的患者KRAS基因發(fā)生突變[24]，當KRAS突變后，將導致細胞內(nèi)細胞傳導系統(tǒng)紊亂，細胞增殖失控而導致癌變。本研究結(jié)果顯示，在淋巴瘤Raji細胞中KRAS為miR-200c的直接靶分子，而LncRNA-ATB可作為miR-200c的ceRNA競爭性地上調(diào)KRAS的表達，從而促進淋巴瘤細胞增殖。

綜上所述，本研究利用RNA干擾技術(shù)沉默Raji細胞中LncRNA-ATB的表達，檢測LncRNA-ATB在Raji細胞增殖、凋亡和周期中的作用及潛在機制。研究發(fā)現(xiàn)，沉默LncRNA-ATB表達可以抑制Raji細胞增殖，而促進結(jié)腸癌細胞的凋亡，并使細胞周期阻滯于G1期。其可能的潛在機制為LncRNA-ATB作為ceRNA與miR-200c競爭性地調(diào)控KRAS的表達。本研究為LncRNA-ATB在淋巴瘤細胞惡性增殖過程中的分子機制相關研究提供一定的前期基礎，為進一步研究LncRNA-ATB在淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論基礎，為淋巴瘤的治療提供新的分子靶標。

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Effect of LncRNA-ATB on proliferation,apoptosis and cell cycle of Raji cell

Wei Zhao1,Xiao-ming Li2
(1.Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China;2.Department of Hematology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To investigate effects of long non-coding RNA activated by TGF-β (LncRNA-ATB) on cell proliferation,apoptosis,and cell cycle of human lymphoma Raji cell. Methods The efficiency of LncRNA-ATB shRNA,miR-200c mimics,and the expressions of LncRNA-ATB,miR-200c,and KRAS were detected by quantitative real time PCR (qRT-PCR).The cell proliferation of Raji transfected with LncRNAATB shRNA and NC were analyzed by MTT assays,and the cell apoptosis and cell cycle of Raji cells transfected with LncRNA-ATB shRNA and NC were analyzed by flow cytometry.Luciferase assays were performed to detect whether KRAS was the direct target of miR-200c.Results The expression of LncRNA-ATB could be effectively silenced by LncRNA-ATB-shRNA.Compared with Raji cells transfected with LncRNAATB-NC,cell proliferation significantly inhibited in Raji cells transfected with LncRNA-ATB-shRNA,but cells apoptosis was significantly promoted.Cell cycle was arrested at G1 phage in Raji cells transfected with LncRNA-ATB-shRNA.Further investigation found that LncRNA-ATB could promote the proliferation of Raji cells and function as ceRNA to upregulate the expression of KRAS by competed with miR-200c.Conclusions LncRNA-ATB may play an important role in the proliferation,apoptosis and cell cycle of Raji cells by upreg－ulating the expression of KRAS.

LncRNA-ATB;Raji cell;kirsten rat sarcoma viral oncogene;miR-200c;proliferation

R733.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.004

1005-8982（2017）05-0018-06

2016-06-07

李曉明，E-mail：lxm6358@21cn.com