桑葉中1-脫氧野尻霉素的提取、分離及純化方法研究進展

倪沁，朱柏羽，蔣浣竹，鄭小堅，陸小平，曹霞敏，*

（1.蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州215123；2.蘇州大學金螳螂建筑與城市環(huán)境學院，江蘇蘇州215123）

桑葉中1-脫氧野尻霉素的提取、分離及純化方法研究進展

倪沁1，朱柏羽1，蔣浣竹1，鄭小堅1，陸小平2，曹霞敏1，*

（1.蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州215123；2.蘇州大學金螳螂建筑與城市環(huán)境學院，江蘇蘇州215123）

1-脫氧野尻霉素是一種存在于自然界的生物堿類化合物，對人體具有多種保健功能。主要就近年來國內(nèi)外對1-脫氧野尻霉素的提取、分離和純化的研究進展進行綜述。

1-脫氧野尻霉素；提??；分離；純化

Abstract：1-Deoxynojirimycin is an alkaloid in mulberry leaf.The research interests of 1-deoxynojirimycin are increasing due to its potential health benefits.A review of the most significant advances achieved in the field of extraction，isolation and purification of 1-deoxynojirimycin in recent years at home and abroad was made.

Key words：1-deoxynojirimycin；extraction；isolation；purification

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一種哌啶生物堿，學名為3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶[1]。DNJ最早由Yagi等[2]從桑根皮中分離得到，之后相繼在野拓草[3]、風信子[4]、沙參屬植物[5]及芽孢桿菌[6]體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了DNJ，但其含量遠低于桑資源，因此桑樹是DNJ的主要來源。在桑樹的種子、葉、根和枝中均有DNJ分布，其中桑樹種子中DNJ的含量約為0.13%[7]，桑葉中的含量較高，約為0.11%～0.49%[7-14]，桑根中含量約為0.10%[7]，桑樹莖中含量約為0.19%[7]，桑枝皮中含量可達0.38%～0.50%[10-11]，桑枝木質(zhì)部含量僅為0.04%～0.05%[10-11]。另外，不同生長期的桑葉中的DNJ含量也不同，研究表明，同一季節(jié)不同發(fā)育時期桑葉中的DNJ含量均按葉位（成熟度）由高到低遞減，即嫩芽＞嫩葉＞成熟葉＞老葉[15]，嫩芽中含量約為11.9%[16]。目前桑葉已經(jīng)成為獲取天然DNJ的主要來源。DNJ是桑葉中主要的生物活性物質(zhì)，它能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，顯著降低人體空腹血糖和餐后血糖峰值，目前多作為功能性或藥用添加劑用于控制血糖[17-19]。目前國內(nèi)外有關DNJ的研究主要集中在DNJ的定性與定量方法研究、DNJ的高效提取與分離、DNJ的生理活性與功能研究機制以及以DNJ為原料或輔料開發(fā)降血糖藥物4個方面，這些內(nèi)容的深入研究有利于進一步合理利用與開發(fā)桑葉中的DNJ資源。本文重點就近年來國內(nèi)外學者對1-脫氧野尻霉素的提取、分離和純化方法的最新研究進行了分析總結。

1 提取方法研究進展

提取是分離、純化和利用DNJ的基礎和主要環(huán)節(jié)。近年來DNJ的提取獲得了越來越多的關注，有關的研究報道逐漸增多，一些新的提取方法如微波、超聲波等都得到了應用。

1.1 溶劑提取

溶劑提取是植物天然產(chǎn)物的常規(guī)提取方法，溶劑多選擇甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶劑等。DNJ的提取目前多采用傳統(tǒng)溶劑進行熱提取，已有研究通常從提取溶劑、料液比、提取溫度和時間等因素進行優(yōu)化，盡管工藝簡便，但提取得率均較低[20-22]。

從桑葉中提取DNJ的最初方法是蒸餾水提取法，即將樣品烘干后以蒸餾水為溶劑，沸騰條件下多次提取，該方法耗時長，并且DNJ極易被破壞而失去生物活性[12]。楊海霞等[21]以水為溶劑，加熱回流2 h～2.5 h提取桑葉粉中的DNJ，兩次提取得率僅為0.038%。劉樹興等[22]改良了蒸餾水提取工藝，通過將樣品暴曬而大量縮短了樣品熱分解的時間，通過正交試驗優(yōu)化了熱溶劑提取桑葉DNJ的工藝參數(shù)，提取溶劑為水，物料粒為 60目，料液比為 1∶30（g/mL），溫度為 70℃，時間為3 h，依此工藝，桑葉DNJ的提取得率為0.088%。黎歡吉[23]用蒸餾水浸提桑葉中的DNJ，通過陽離子交換柱層析對DNJ進行初步純化后采用分光光度法測定DNJ的含量，發(fā)現(xiàn)提取液pH值為9.4～10.5時DNJ含量最高，約為0.023 7%。蒸餾水提取法提取率較低，雜質(zhì)多，分離困難。

為了改進提取工藝，根據(jù)DNJ的化學特性，酸提取法發(fā)展起來，酸溶液可以有效軟化細胞壁，溶解DNJ，提高提取率。馬靜等[24]采用正交試驗確定酸水提取桑葉DNJ的最佳工藝為：粒度60目、提取溫度為55℃、提取溶劑為HCl酸化水溶液（pH 3.0）、料液比為1∶20（g/mL）、提取時間為15 h，DNJ的得率為0.062%。

有機溶劑提取法是目前提取生物堿的常用方法，該方法提取時間短，純度高。周炎等[20]比較了不同溶劑對桑枝DNJ提取得率的影響，發(fā)現(xiàn)80%乙醇的提取效果好于水。胡娟霞[7]研究發(fā)現(xiàn)65%乙醇為溶劑提取的DNJ的量比以0.05 mol/L HCl為溶劑提取的 DNJ量高。Wang等[25]通過響應面法優(yōu)化DNJ的提取條件為：乙醇濃度55%，提取溫度80℃，提取時間1.2 h，料液比 1∶12（g/mL），提取率達到 0.256%。馬靜等[24]結合酸水提取法和有機溶劑提取法，確定了酸性乙醇提取法的最佳工藝：粉末粒度60目、提取溫度55℃、pH值為1的 75%乙醇溶液、料液比 1∶30（g/mL）、提取時間1.5 h，DNJ得率0.064%。

1.2 超聲波輔助萃取

超聲波作為一種輔助提取手段主要集中在中草藥成份、植物油、多酚、芳香成份、多糖以及其他功能成份的提取等研究領域。陳巖[26]、耿鵬[27]等均采用超聲波輔助提取了桑樹中的DNJ，徐鑫等[28]開展了不同的提取方法對桑葉中DNJ的提取率影響的對比研究，相同條件下超聲波細胞破碎儀輔助提取的DNJ得率是熱（70℃）浸提的3.02倍；同時，采用響應面法優(yōu)化了超聲波輔助提取DNJ的工藝參數(shù)，最佳提取條件為超聲功率 350 W，料液比 1∶16（g/mL），溫度 75℃，時間60 min?；←惖萚29]以桑葉為原料，優(yōu)化了超聲波輔助提取DNJ的最佳工藝參數(shù)，提取溶劑為乙醇（濃度65%），料液比為 1∶40（g/mL），超聲波功率 125 W，溫度為70℃，時間為20 min，DNJ的得率為0.091%，固形物中DNJ純度為27.2%。李宇亮等[30]采用超聲波提取桑葉中的DNJ，發(fā)現(xiàn)以65%的乙醇為提取劑，料液比為 1∶8（g/mL），1 800 W 下超聲 20 min，提取率達到95.8%，得率為124.54 mg/100 g。超聲波輔助提取與傳統(tǒng)提取方法相比，大大縮短了提取的時間，提高了提取效率以及提取物的穩(wěn)定性。

1.3 微波輔助萃取

1986年，Ganzleret等[31]首次報道了利用微波從土壤、種子、食品、飼料中分離各種類型化合物的樣品制備新方法。2007年，胡瑞君等[32]通過對微波輔助萃取提取桑葉中DNJ的工藝研究，發(fā)現(xiàn)對桑葉DNJ得率的影響因素依次為：微波功率＞時間＞固液比，確定了微波提取的最佳工藝條件為：功率為406 W、時間為1.5 min、固液比為 1∶40（g/mL），提取次數(shù)為 2 次，得率為0.024%。

1.4 聯(lián)合輔助提取

基于單一提取手段的利弊不一，有學者嘗試采用聯(lián)合輔助提取的方式以提高產(chǎn)物的提取率。劉超等[33]采用超聲-微波結合法提取桑葉中DNJ，發(fā)現(xiàn)用0.05mol/L的鹽酸水溶液作為溶劑，液料比為46.47 mg/L，微波處理9.6 min后超聲波處理30.89 min，DNJ的得率最高可達0.205%。同時，研究了不同溶劑對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)得率依次為：正丁醇＞乙酸乙酯＞石油醚。楊翠平等[34]比較了超聲-表面活性劑輔助提取法、回流提取法及超聲-回流法對桑葉DNJ提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)用超聲-表面活性劑輔助法的得率顯著高于回流提取法、超聲-回流法，并優(yōu)化了最佳參數(shù)：超聲時間為32 min、料液比為 1∶10（g/mL）、提取溫度為 73 ℃、表面活性劑（聚乙二醇辛基丙基醚）濃度為2.1%，在此工藝下DNJ的提取量為0.996 mg/g。

2 分離、純化方法研究進展

DNJ的分離與純化方法是DNJ領域的一個研究重點，目前報道的主要方法有薄板層析、柱層析、高效液相、膜分離技術等。

2.1 膜分離

膜分離是20世紀60年代后迅速崛起的一門分離新技術，已廣泛應用于天然產(chǎn)物的分離純化[35]。若直接采用超濾膜分離桑葉水提物浸膏，膜通量很低，且超濾膜污染嚴重，清洗非常困難。而先用陶瓷膜微濾處理，再采用超濾去除大分子雜質(zhì)，膜通量的衰減變化則不顯著[36]。因此，顏繼中等[36]將微濾與超濾膜結合用于桑葉DNJ的純化，桑葉水提取液中DNJ的質(zhì)量分數(shù)從1.32%提高到7.84%，回收率為88.06%。劉國艷等[37]比較了不同的超濾和納濾膜對桑葉DNJ濃縮效果的影響，發(fā)現(xiàn)截留分子量為8.0 kDa的復合超濾膜最適于DNJ的分離，截留分子量為0.2 kDa的復合納濾膜對DNJ的濃縮效果顯著，濃縮倍數(shù)可以達到10.1，對DNJ的截留率為81.94%，DNJ純度為4.65%。

2.2 溶劑萃取分離

溶劑萃取分離法是在兩種互不相溶或微溶的溶劑中，目標化合物在其中的溶解度或分配系數(shù)不同，而從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中，并經(jīng)過反復多次萃取，將絕大部分的化合物提取出來。楊茹等[38]將桑葉提取濃縮液以氯仿萃取，保留水相，水相以正丁醇萃取，保留正丁醇相，濃縮至小體積，收集析出的固相，所得產(chǎn)物中DNJ含量達到98%。

2.3 薄層層析

薄層色譜也是分離天然產(chǎn)物的一種傳統(tǒng)而重要的手段，固定相一般選用硅膠、氧化鋁、聚酰胺或纖維素等。李玲等[39]建立了薄層層析分離鑒定DNJ的方法，確定最佳條件為：硅膠G薄層板，展開劑為正丁醇∶冰乙酸∶水（5∶3∶1），顯色劑為 0.2%茚三酮，DNJ的 Rf=0.36，分離效果和顯色效果均很好。

2.4 柱層析

植物天然產(chǎn)物的分離純化多選擇各種樹脂來去除提取物中糖、有機酸、礦物質(zhì)及其它水溶性雜質(zhì)。蔣磊等[40]研究了不同樹脂對桑葉DNJ分離純化效果的影響，結果表明純度依次為陽離子交換樹＞大孔樹脂＞硅膠樹脂?；←惖萚41]進行了大孔樹脂吸附法純化DNJ的研究，結果表明：以DXA-6樹脂裝柱、pH10、原液濃度0.352 mg/mL、流速2.0 BV/h條件下吸附，80%乙醇溶液以2.5 BV/h的流速洗脫，解析率可達到85.5%，通過純化DNJ的純度由21.3%增加到61.6%。黃勇等[42]以001×7型陽離子交換樹脂分離純化桑葉DNJ，得到純度為29.75%的分離物。殷紅等[43]將桑葉提取液濃縮后過陽離子樹脂，洗脫液濃縮后經(jīng)有機溶劑萃取、重結晶、凝膠過濾層析后制備獲得1-DNJ精制品，純度高于98.5%。楊翠平[34]采用D72型陽離子交換樹脂、D296型陰離子交換樹脂和氧化鋁柱層析聯(lián)用，得到了純度63.9%的DNJ，濃度比桑葉粗提液高40.97倍。李宇亮等[30]采用732 H陽離子樹脂分離純化桑葉DNJ的乙醇提取物，發(fā)現(xiàn)用蒸餾水洗至流出液為無色后用0.25 mol/L的氨水洗脫（洗脫速度1 mL/min～2 mL/min），洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，正丁醇萃取，回收正丁醇，真空干燥后可得到純度為92.3%的DNJ。劉衛(wèi)旗等[12]采用磺酸型離子交換樹脂法純化桑葉DNJ水提取液，用0.5 mol/L的氨水洗脫純化后再進行液相檢測，桑葉中的DNJ含量為1.622 mg/g。楊梅等[44]以桑葉粉為原料，用蒸餾水熱提取其中的DNJ，提取液用001×7強酸型陽離子交換樹脂進行純化，經(jīng)過氨水洗脫、濃縮后進行液相檢測，發(fā)現(xiàn)DNJ純度高達95.98%。劉樹興等[22]比較了4種不同的大孔吸附樹脂D101、LX-38、AB-8、DXA-6對DNJ的純化效果，發(fā)現(xiàn)XDA-6樹脂最適于桑葉DNJ的分離純化，通過靜態(tài)、動態(tài)吸附試驗，確定pH10，原液濃度0.352 g/L，流速2.0 BV/h為最佳條件。

2.5 高速逆流色譜

高速逆流色譜是一種較新型的液-液分配色譜，在天然產(chǎn)物純化方面得到越來越廣泛的開發(fā)和應用。劉玲等[39]釆用傳統(tǒng)提取分離方法與高速逆流色譜相結合的方式，對桑葉乙酸乙酯提取物進行分離純化，分離得到包括DNJ的9種化合物。高速逆流色譜技術分離效率高且分離量大，為桑葉DNJ的分離提供了一個新的技術，可以用來大批量分離制備DNJ，以解決當前臨床以及分析中對DNJ需求量大的難題。

2.6 反相柱色譜純化法

反相高效液相色譜是指以強疏水性的填料做固定相，以可以和水混溶的有機溶劑作流動相的液相色譜，是應用廣泛的液相色譜方法之一。周惠燕等[14]采用反相柱色譜純化法對桑葉鹽酸-水DNJ粗提液進行純化，先將DNJ提取液過MCI gel CHP 20P柱色譜，用不同濃度的甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，收集含有DNJ的洗脫液濃縮后再過Sephadex LH-20色譜柱，以不同濃度的甲醇-水為流動相進行梯度洗脫，最后收集含DNJ的洗脫液，濃縮并干燥，得到的固體中DNJ含量為10.7%。

2.7 聯(lián)合純化

為了得到高純度產(chǎn)品，也有將多種分離技術聯(lián)合用于DNJ的純化。魏曉蕊等[10]將陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂和超濾聯(lián)合應用于DNJ的分離純化，結果表明，DNJ的純度達到15.18%。徐鑫等[45]聯(lián)合膜分離和柱層析技術純化DNJ，將桑葉水提取液通過離心、微濾膜處理后經(jīng)過二次超濾、納濾、陽離子交換樹脂層析和葡聚糖凝膠層析，獲得純度為80%以上的DNJ。馬全民等[46]將提取液用超濾膜、強酸性陽離子樹脂柱和大孔樹脂柱洗脫，經(jīng)濃縮、干燥、溶解、吸附、結晶后，得到DNJ含量可達98.3%。李凡等[47]將桑葉提取液經(jīng)濃縮、大孔樹脂、陰離子交換樹脂、堿液洗脫，純化分離桑葉中DNJ效果明顯。李有貴[48]等采用液質(zhì)聯(lián)用儀分離純化法對粗提的DNJ進行了純化，將粗提的DNJ用蒸餾水溶解后經(jīng)制備型液相色譜儀分離，通過LC-MS對收集液進行鑒定，然后50℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈，-50℃下冷凍干燥后經(jīng)柱前熒光衍生反相高效液相色譜法檢測，發(fā)現(xiàn)DNJ純度高于95%。

3 結語與展望

目前，國內(nèi)外關于桑葉中DNJ的提取與分離純化研究還處于起步階段，并且提取及分離純化的方法研究與優(yōu)化較為局限，提取上仍集中在熱溶劑浸提、超聲波輔助萃取、微波輔助萃取等，而在其他提取方法（如超臨界流體輔助萃取等）研究很少。新的提取分離方法可以為工業(yè)化提取DNJ開辟新的途徑，然而其應用還處于起步階段，許多技術條件還不成熟，還不適宜大規(guī)模生產(chǎn)，但就其方法本身而言，比現(xiàn)有方法具有更大的優(yōu)越性。

我國是世界上最大的桑樹種植國，桑樹資源豐富，而我國的桑葉資源開發(fā)利用率很低，且大都處于較為簡單的初級加工階段，桑葉中的DNJ具有很好的降血糖、抗氧化等功能，因此了解、掌握、尋求新的桑葉中DNJ的分離純化技術，對充分利用我國桑葉資源優(yōu)勢，有效開發(fā)桑葉中所含有效物質(zhì)具有重要的現(xiàn)實意義。

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Review on the Methods of Extraction，Isolation and Purification of 1-Deoxynojirimycin in Mulberry Leaf

NI Qin1，ZHU Bo-yu1，JIANG Huan-zhu1，ZHENG Xiao-jian1，LU Xiao-ping2，CAO Xia-min1，*
（1.School of Biology&Basic Medical Science，Medical College，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China；2.Gold Mantis School of Architecture，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China）

2017-03-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.042

蘇州大學大學生創(chuàng)新項目（2016xj058）

倪沁（1995—），女（漢），本科生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

*通信作者：曹霞敏（1986—），女，講師，博士，研究方向：果蔬非熱加工。