響應(yīng)面法優(yōu)化生香酵母C42增殖培養(yǎng)基

郭凱元，亢春雨，李志輝，徐宏偉，孫思明，任蓓蕾，馬雯，李英軍，檀建新*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北黃驊061100）

響應(yīng)面法優(yōu)化生香酵母C42增殖培養(yǎng)基

郭凱元1，亢春雨1，李志輝2，徐宏偉1，孫思明1，任蓓蕾1，馬雯1，李英軍1，檀建新1*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北黃驊061100）

在搖瓶水平上對(duì)生香酵母C42培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。首先用單因子法篩選最優(yōu)碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽。采用Plackett-Burman法篩選影響生香酵母C42生長(zhǎng)的主要因素、再利用最陡爬坡試驗(yàn)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，得到生香酵母C42的優(yōu)化培養(yǎng)基配比。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為葡萄糖7.12%、酵母浸粉3.28%、KH2PO40.2%、(NH)2SO40.6%、NaCl 0.5%、MgSO40.03%。優(yōu)化后的活菌數(shù)量可達(dá)到1.26×109CFU/mL，比優(yōu)化前的活菌數(shù)7.65×108CFU/mL提高了64.7%。

生香酵母；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法

生香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，主要屬于假絲酵母和產(chǎn)膜酵母，在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生酸、酯、高級(jí)醇和醛等多種香味物質(zhì)。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地和色澤的形成起到重要的作用[1]。目前在葡萄酒、白酒、食醋等發(fā)酵行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[2-6]。在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株產(chǎn)酯能力較高的酵母菌C42，經(jīng)鑒定為異常維克漢遜酵母（Wickerhamomyces anomalus），具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值[7-8]。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種的兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以用最少的試驗(yàn)次數(shù)從眾多的因素中高效地篩選出影響最為顯著的幾個(gè)因素[9]。響應(yīng)面法則是在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)這幾個(gè)重要因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化，并尋求最優(yōu)的參數(shù)，與傳統(tǒng)優(yōu)化方法相比所需的試驗(yàn)組數(shù)更少。目前已成為優(yōu)化試驗(yàn)條件、節(jié)約試驗(yàn)成本的一種十分有效的方法，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)試驗(yàn)和科學(xué)研究[10-11]。本試驗(yàn)以生香酵母C42作為研究對(duì)象，以Plackett-Burman設(shè)計(jì)及響應(yīng)面優(yōu)化其培養(yǎng)基成分，提高酵母生物量，旨在為該菌種的后續(xù)研究和生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

異常維克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）C42：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物試驗(yàn)室保存；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂糖、KH2PO4、（NH）2SO4、NaCl、MgSO4等（均為分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。滅菌條件：121℃、20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ZHWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；DSX-280A手提壓力滅菌鍋：上海申安儀表有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將生香酵母C42接入YEPD液體培養(yǎng)基中活化2次，將活化過(guò)的菌種按以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入盛有各培養(yǎng)基的三角瓶（50 mL/250 mL），30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

先用單因素試驗(yàn)篩選出合適的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，然后用Plackett-Burman設(shè)計(jì)找出對(duì)生香酵母C42增殖有顯著影響的因子，通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Benhnken試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析，獲得培養(yǎng)基組分的最優(yōu)添加量組合。通過(guò)比較生香酵母C42在普通YEPD培養(yǎng)基和響應(yīng)面法優(yōu)化后的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況從而評(píng)價(jià)優(yōu)化后的培養(yǎng)基[12]。

1.3.3 測(cè)定方法

比濁法：菌體生物量與吸光度值成正比，測(cè)定適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液在波長(zhǎng)560 nm處的吸光度OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源種類及添加量?jī)?yōu)化

選擇添加量均為2%葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、乳糖和β-環(huán)糊精7種不同碳源替換YEPD培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行酵母發(fā)酵試驗(yàn)?？疾觳煌荚磳?duì)生香酵母C42生長(zhǎng)狀況的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同碳源對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on growth of yeast C42

由圖1可知，不同的碳源對(duì)菌株的生長(zhǎng)有不同的影響，其中葡萄糖最適合生香酵母C42的生長(zhǎng)，因此接下來(lái)的優(yōu)化培養(yǎng)選擇葡萄糖作為碳源。

確定葡萄糖為最佳碳源后，考察不同葡萄糖含量對(duì)生香酵母C42生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同葡萄糖含量對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.2 Effects of different glucose concentration on growth of yeast C42

由圖2可知，菌液吸光度值隨葡萄糖含量的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，葡萄糖含量為10%時(shí)菌液吸光度值達(dá)到最大值，因此選擇葡萄糖的最適含量為10%。

2.1.2 氮源種類及添加量?jī)?yōu)化

選擇添加量均為2%酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨6種不同氮源替換YEPD培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行酵母發(fā)酵試驗(yàn)，考察不同氮源對(duì)生香酵母C42生長(zhǎng)狀況的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同氮源對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on growth of yeast C42

由圖3可知，生香酵母C42既可以利用有機(jī)氮源，又可以利用無(wú)機(jī)氮源。當(dāng)用酵母浸粉作單一氮源時(shí)生物量最大，其次為蛋白胨，無(wú)機(jī)氮源中硫酸銨效果最好。由于酵母浸粉和蛋白胨價(jià)格昂貴，不適宜作單一氮源，因此接下來(lái)的優(yōu)化中考慮用有機(jī)氮源酵母浸粉和無(wú)機(jī)氮源硫酸銨作為復(fù)合氮源。

確定酵母浸粉、硫酸銨作為復(fù)合氮源后，考察酵母浸粉和硫酸銨含量對(duì)生香酵母C42生長(zhǎng)狀況的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，酵母浸粉含量為2.5%、硫酸銨含量為0.5%時(shí)吸光度值達(dá)到最大值，因此選擇酵母浸粉最適含量為2.5%、硫酸銨最適含量為0.5%。

圖4 不同酵母浸粉（A）及硫酸銨（B）含量對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.4 Effects of different concentration of yeast extract powder（A）and（NH）2SO4(B)on growth of yeast C42

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽種類及添加量?jī)?yōu)化

選擇添加量均為0.5%硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鋅和磷酸二氫鉀5種不同無(wú)機(jī)鹽加入YEPD培養(yǎng)基中，以不加任何無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），進(jìn)行酵母發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.5 Effects of different inorganic salt on growth of yeast C42

由圖5可知，硫酸鎂，磷酸氫二鉀、氯化鈉對(duì)酵母的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，因此選用以上3種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行下一步試驗(yàn)的無(wú)機(jī)鹽。

硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈉含量對(duì)生香酵母C42生長(zhǎng)狀況的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉的最適含量分別為0.5%、0.15%、0.4%。

圖6 不同濃度的硫酸鎂（A），磷酸二氫鉀（B）及氯化鈉（C）含量對(duì)酵母菌C42生長(zhǎng)狀況的影響Fig.6 Effects of different concentration of MgSO4(A),KH2PO4(B) and NaCl(C)on growth of yeast C42

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用葡萄糖（X1）、酵母浸粉（X2）、（NH4）2SO4（X3）、KH2PO4（X4）、NaCl（X5）、MgSO4（X6）6個(gè)因素作為研究對(duì)象，另外設(shè)置5項(xiàng)虛擬項(xiàng)（X7～X11），以考察誤差。每個(gè)因子選取高低2個(gè)水平，其因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design-Expert軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

表1 Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and resutls of Plackett-Burman experiments

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman experiments

由表3可知，6個(gè)因素對(duì)應(yīng)響應(yīng)值影響的顯著性順序?yàn)榻湍附郏酒咸烟牵綤H2PO4＞NaCl＞MgSO4＞（NH4）2SO4，其中葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4對(duì)生香酵母C42具有顯著影響，酵母浸粉具有極顯著效應(yīng)（P＜0.01），葡萄糖和KH2PO4具有顯著效應(yīng)（0.01＜P＜0.05）。應(yīng)針對(duì)以上3因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，其他因素影響相對(duì)不顯著，呈正效應(yīng)的因素維持在高水平，呈負(fù)效應(yīng)的維持在低水平[13]。酵母浸粉、KH2PO4、（NH4）2SO4、NaCl為正效應(yīng)，說(shuō)明這4個(gè)因素在高水平時(shí)對(duì)生香酵母C42的增殖更有利，因此選取酵母浸粉、KH2PO4、（NH4）2SO4、NaCl的含量分別為3%、0.2%、0.6%、0.5%。葡萄糖、MgSO4為負(fù)效應(yīng)，說(shuō)明這2個(gè)因素在低水平濃度時(shí)對(duì)生香酵母C42的增殖更有利，因此選取葡萄糖、MgSO4的含量為8%、0.03%。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

在篩選出主要影響因素后，根據(jù)回歸方程中各顯著性因素對(duì)響應(yīng)值的影響，減少葡萄糖的用量，增加酵母浸粉、KH2PO4的用量，根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例確定它們的步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，以逼近最佳響應(yīng)區(qū)域[14]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table4 Experimental design and results of the steepest ascent tests

由表4可知，當(dāng)葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4含量分別為7%、3.25%、0.3%時(shí)最利于酵母生長(zhǎng)，故以此組合試驗(yàn)條件作為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得的3個(gè)重要因素及最陡爬坡試驗(yàn)得到的最佳濃度分別選取3個(gè)水平，利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 培養(yǎng)基組成優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of response surface methodology for medium composition optimization

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，三元二次回歸擬合方程如下：

Y=14.54+0.12A+0.14B+0.24C-0.10AB+0.005AC+0.17BC-0.47A2-0.61B2-0.90C2。

回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表7表明，模型的P值＜0.000 1，說(shuō)明模型極其顯著。該模型的決定系數(shù)R2=0.983，校正決定系數(shù)R2Adj=0.961，說(shuō)明該模型能解釋98.3%的響應(yīng)值的變化，只有變異2.2%不能由該模型來(lái)解釋，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間擬合度好。該模型的失擬項(xiàng)P=0.074 1＞0.05，可知該模型失擬不顯著[15]。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）的值越低表明試驗(yàn)的可靠性越高，試驗(yàn)中變異系數(shù)為1.68%，證明試驗(yàn)結(jié)果可信。因此可用此回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。方程中一次項(xiàng)中A和B對(duì)結(jié)果有顯著影響，C對(duì)結(jié)果具有極顯著影響；二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果均有有極顯著影響，交互項(xiàng)中BC交互作用顯著，表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。

3個(gè)因子交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)曲圖以及等高線圖見(jiàn)圖7。

表7 Box-Benhnken試驗(yàn)回歸模型方差分析Table7 Variance analysis of Box-Benhnken tests

圖7 葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4添加量交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glucose,yeast extract and KH2PO4addition on viable counts

由圖7可以看出，隨著葡萄糖和酵母浸粉質(zhì)量濃度的升高，OD560nm值表現(xiàn)為先升高后降低，葡萄糖和酵母浸粉對(duì)生香酵母C42的生長(zhǎng)影響顯著，說(shuō)明碳源和氮源的增加有利于生酵母C42的生長(zhǎng)，但是過(guò)高或者過(guò)低都不利于菌株的生長(zhǎng)繁殖，因此合適的C/N比對(duì)于酵母菌的增長(zhǎng)繁殖至關(guān)重要。葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4中任一種組分質(zhì)量濃度較低時(shí)，適量增加其他組分的質(zhì)量濃度均可促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)葡萄糖、酵母浸粉和KH2PO4質(zhì)量濃度之間存在最佳值，超過(guò)最佳值后，增加任一組分的質(zhì)量濃度均不能提高菌體生物量，甚至使菌體生物量有所下降，為了使生香酵母C42快速增殖并形成最大生物量，選取適宜的葡萄糖濃度、酵母浸粉濃度和KH2PO4濃度都是至關(guān)重要的。

為求得模型極值點(diǎn)，對(duì)回歸方程求解[16]，得出在葡萄糖7.119%，酵母浸粉3.282%，KH2PO40.2%的條件下，生香酵母C42發(fā)酵液OD560nm值的預(yù)測(cè)值最高為14.59。

2.5 驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果

為了方便實(shí)際操作，修改最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖7.119%，酵母浸粉3.282%，KH2PO40.2%，采取經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)生香酵母C42，重復(fù)試驗(yàn)3次，培養(yǎng)后生香酵母C42的發(fā)酵液OD560nm值為14.57，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說(shuō)明預(yù)測(cè)結(jié)果能較好的反映實(shí)際情況，證明了模型的有效性，優(yōu)化后的的酵母活菌數(shù)達(dá)1.26×109CFU/mL。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果證明，Plackett-Burman試驗(yàn)與響應(yīng)面法相結(jié)合的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地從眾多影響生香酵C42增殖的因素中篩選出比較重要的影響因素，優(yōu)化條件并得到最佳培養(yǎng)基配比。本研究通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出具有顯著效果的3個(gè)因素分別為葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4。在此基礎(chǔ)上經(jīng)最陡爬坡路徑試驗(yàn)找出其峰值，快速逼近最佳值區(qū)域，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化酵母菌培養(yǎng)基配方。最終確定其發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖7.119%、酵母浸粉3.282%、KH2PO40.2%、（NH4）2SO40.6%、NaCl 0.5%，MgSO40.03%。在此優(yōu)化的培養(yǎng)基中活菌數(shù)為最高（1.26×109CFU/mL），較優(yōu)化前（7.65×108CFU/mL）提高了64.7%，為生香酵母C42的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Optimization of aroma-producing yeast C42 culture medium by response surface method

GUO Kaiyuan1,KANG Chunyu1,LI Zhihui2,XU Hongwei1,SUN Siming1,REN Beilei1,MA Wen1,LI Yingjun1,TAN Jianxin1*
(1.Engineering Research Center of Hebei Province for Agricultural Products Processing,College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;2.College of Science and Technology,Hebei Agricultural University, Huanghua 061100,China)

The fermentation medium for aroma-producing yeast C42 was optimized based on response surface method.Single-factor experiments were firstly performed to select the optimal carbon source,nitrogen source and inorganic salt.The significant factors which affect the growth of aromaproducing yeast C42 were filtered out through the Plackett-Burman experiments,and then the aroma-producing yeast C42 medium formula was obtained based on the steepest ascent tests and Box-Behnken design.Based on the statistical analysis,the optimal fermentation medium compositions were glucose 7.12%,yeast extract 3.28%,KH2PO40.2%,(NH)2SO40.6%,NaCl 0.5%,MgSO40.03%.After optimization,the number of viable yeast increased from 7.65×108CFU/ml to 1.26×109CFU/ml,which increased by 64.7%.

aroma-producing yeast;medium optimization;response surface methodology

TQ92

0254-5071（2017）03-0103-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.022

2016-12-01

河北省食品科學(xué)與工程學(xué)科“雙一流”建設(shè)資金項(xiàng)目（2016SPGCA18）；河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（16275505D）

郭凱元（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。

*通訊作者：檀建新（1968-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開(kāi)發(fā)與利用。