傳統(tǒng)醬香大曲與機(jī)械化醬香大曲中酵母菌的初步研究

蔣思峽，邱樹毅，鄒江鵬，陳琳琳，羅小葉，王曉丹，4*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州國臺酒業(yè)有限公司，貴州仁懷564501；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

傳統(tǒng)醬香大曲與機(jī)械化醬香大曲中酵母菌的初步研究

蔣思峽1，2，邱樹毅1，2，鄒江鵬3，陳琳琳1，2，羅小葉1，2，王曉丹1，2，4*

（1.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；3.貴州國臺酒業(yè)有限公司，貴州仁懷564501；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

采用可培養(yǎng)方法從傳統(tǒng)醬香大曲和機(jī)械化醬香大曲中分離篩選酵母，并對這些酵母的數(shù)量、種類及功能差異進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，機(jī)械化醬香大曲中酵母數(shù)量為傳統(tǒng)醬香大曲的1.44倍；傳統(tǒng)醬香大曲中酵母種類為機(jī)械化醬香大曲的2倍；相同條件下兩者中產(chǎn)酒性能最高的酵母產(chǎn)酒精度在20℃時(shí)均為10.2%vol，機(jī)械化醬香大曲中篩選得到的酵母菌株平均產(chǎn)酒性能為傳統(tǒng)醬香大曲的1.04倍；從產(chǎn)香上看，兩種大曲中的產(chǎn)香酵母均能產(chǎn)生醇、酸、酯、酮類揮發(fā)性物質(zhì)。

醬香型；傳統(tǒng)大曲；機(jī)械大曲；酵母；功能

醬香型白酒屬于大曲酒，大曲具有糖化、發(fā)酵、生香等作用，原料經(jīng)自然界的微生物接種、繁殖，在高溫堆積及入窖貯存的過程中與環(huán)境中的微生物發(fā)生復(fù)雜的生化反應(yīng)，為醬香型白酒獨(dú)特風(fēng)味形成提供基礎(chǔ)[1]。

醬香型大曲傳統(tǒng)制曲是將水和母曲加入粉碎的小麥中攪拌，轉(zhuǎn)入木盒，工人站在曲盒中踩曲，制成曲塊。這種方法勞動強(qiáng)度大，效率低，因人的體質(zhì)量和技術(shù)有差異，做成的曲塊也會有差異[2]。20世紀(jì)80年代以來，茅臺、瀘州老窖、四特酒、會稽山紹興酒業(yè)等酒企用一些簡單的機(jī)械設(shè)備來節(jié)約人力[3-7]，機(jī)械化制曲具有節(jié)省人力、效率高、均一性好、節(jié)約生產(chǎn)場地等優(yōu)點(diǎn)。目前醬香型大曲的生產(chǎn)還基本采用傳統(tǒng)制曲。2013年貴州國臺酒莊有限公司開始研發(fā)機(jī)械化成套制曲設(shè)備，并投入生產(chǎn)使用，降低勞動力強(qiáng)度50%以上，從根本上改善了人工操作憑經(jīng)驗(yàn)、靠感覺的不確定性，確保了曲塊質(zhì)量的穩(wěn)定性和食品安全性。

酵母作為大曲微生物區(qū)系中最重要的類群之一，其種類和數(shù)量的差異，影響著酒質(zhì)和出酒率[8]。酵母在白酒釀造過程中除了表現(xiàn)出很強(qiáng)的酒精生成能力，還可以產(chǎn)生酯類、醇類、酮類、烯類、酚類等揮發(fā)性化合物[9]。對于傳統(tǒng)大曲和機(jī)械大曲的質(zhì)量，主要集中在曲塊外觀、理化指標(biāo)、微生物數(shù)量等方面的比較研究上，對兩者微生物類群結(jié)構(gòu)及功能研究還尚未見報(bào)道[5-7]。因此對傳統(tǒng)大曲和機(jī)械大曲中的酵母進(jìn)行比較研究具有重要意義。

本研究對醬香型傳統(tǒng)大曲和機(jī)械大曲中的酵母采用可培養(yǎng)方法進(jìn)行分離篩選，對酵母的數(shù)量、種類及功能差異進(jìn)行分析比較，探討酵母類群結(jié)構(gòu)，為提高機(jī)械化制曲的大曲品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 大曲樣品來源

GT01：貴州國臺酒莊有限公司生產(chǎn)車間儲存6個(gè)月大曲，采用自主研發(fā)的機(jī)械化制曲方式生產(chǎn)。

GT02：貴州國臺酒業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)車間儲存6個(gè)月大曲，采用醬香型高溫大曲的傳統(tǒng)制曲工藝生產(chǎn)。

兩種大曲在制酒生產(chǎn)前將大曲曲塊粉碎成曲粉，在曲粉的存放處隨機(jī)20個(gè)點(diǎn)取樣，混合均勻，保證其微生物種類的多樣性和均勻性，樣品4℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

酵母基因組DNA提取試劑盒：美國Biomiga公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy ribonucleoside triphosphate，dNTP）、TaqDNA聚合酶：北京天根生物技術(shù)有限公司；糖化酶（5000U/g）：湖南鴻鷹祥生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純和生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂（malt extract agar，MEA）培養(yǎng)基、麥芽汁液體培養(yǎng)基：上海博微生物科技有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract dextrose medium，YEPD）液體培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%。115℃滅菌20 min。

產(chǎn)酒初篩培養(yǎng)基：

上層培養(yǎng)基采用紅四氮唑培養(yǎng)基：紅四氮唑（2,3,5-triph enyltetrazoliumchloride，TTC）0.05g，葡萄糖0.5g，瓊脂1.5g，蒸餾水100mL。（將未加入TTC的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃左右，再加入TTC溶液）。

下層培養(yǎng)基采用YEPD固體培養(yǎng)基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%。115℃滅菌20 min。

產(chǎn)酒復(fù)篩培養(yǎng)基（葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基）：葡萄糖200g/L，酵母膏10 g/L，（NH4）2SO41 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，115℃滅菌30 min。

產(chǎn)香培養(yǎng)基（高粱-小麥培養(yǎng)基）：將小麥全部粉碎，高粱整粒和碎粒比為3∶1（g∶g），高粱和小麥比1∶1（g∶g），混勻，加入60%左右95℃水潤糧5 h，按200 U/g淀粉加入糖化酶，60℃糖化2 h，裝瓶，115℃滅菌20 min[12]。

生理生化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，參考《酵母菌的特征與鑒定手冊》等[10-11]。

1.2 儀器與設(shè)備

YS100光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司；50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭、手動SPME進(jìn)樣器：美國Supelco公司；HP7890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：美國Agilent公司；Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo公司；Flex cycler多功能PCR儀：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 醬香大曲的理化指標(biāo)測定

參見國標(biāo)QBT4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[13]。

1.3.2 酵母菌的計(jì)數(shù)及分離篩選

分別稱取10 g樣品至加有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，160 r/min振蕩30 min，分別按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的梯度稀釋，各梯度取1 mL菌液在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行和傾注培養(yǎng)和平板涂布，每個(gè)梯度3個(gè)平行，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，選擇菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的傾注平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。挑取涂布平板上典型酵母菌落在PDA培養(yǎng)基平板上劃線純化，將純化后的菌種編號，接種于MEA培養(yǎng)基試管斜面28℃培養(yǎng)3 d后4℃保藏。

1.3.3 酵母菌的單菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)鑒定以及生理生化鑒定

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》進(jìn)行[10]。

1.3.4 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

挑取酵母菌單菌落接種到30mLYEPD液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，吸取1 mL菌懸液，采用Biomiga公司的酵母DNA基因組試劑盒提取DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增采用酵母序列通用引物NL1（5′-GGTCCGTATTTCAAGACG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTATTTCAAGACGG-3′）。

PCR反應(yīng)體系（25μL體系）：primer1和primer2各1μL，DNA模板2μL，ddH2O8.5μL，Mix12.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，最后72℃繼續(xù)延伸10 min。

引物對合成及PCR產(chǎn)物測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索（BLAST search，http：//blast.ncb-i.nlm.nih.gov/Blast.cgi），選取同源性較高的菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列作為參比對照[14]，用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3.5 產(chǎn)酒酵母的一級篩選

酵母菌在YEPD固體培養(yǎng)基上純化，28℃培養(yǎng)2d，然后傾入50℃左右的TTC上層培養(yǎng)基，28℃條件下避光保存2h，觀察菌落顏色變化。選取顏色較深的菌株進(jìn)行產(chǎn)酒實(shí)驗(yàn)[16]。

1.3.6 產(chǎn)酒酵母的二級篩選

將上述顏色較深的酵母，挑取單菌落接入20mLYEPD液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)28 h，再按體積分?jǐn)?shù)5%接種至140 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵8 d，記錄CO2總質(zhì)量損失，測定20℃時(shí)酒精度（%vol）及殘?zhí)呛浚╣/100 g）[17]。

1.3.7 酒精含量測定

取100 mL發(fā)酵液和50 mL蒸餾水于裝有數(shù)粒玻璃珠的蒸餾瓶，蒸餾，收集100 mL餾出液，控制蒸餾時(shí)間在30～40 min以內(nèi)。用酒精濃度計(jì)記錄此時(shí)的刻度即酒精濃度，同時(shí)測定溫度，按照酒精溫度與濃度換算表，換算成20℃時(shí)的酒精度（%vol）[18]。

1.3.8 CO2質(zhì)量損失測定

在發(fā)酵前測定三角瓶和發(fā)酵液的總質(zhì)量，發(fā)酵開始后定期測量三角瓶和發(fā)酵液總質(zhì)量。當(dāng)12 h內(nèi)質(zhì)量損失小于0.1 g時(shí)即可認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)的總質(zhì)量損失即可認(rèn)為發(fā)酵過程中CO2的總質(zhì)量損失。

1.3.9 殘?zhí)呛繙y定

參見國標(biāo)GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的直接滴定法[19]。

1.3.10 酵母菌株的固態(tài)發(fā)酵[12，19]

挑取活化后的酵母菌株，接入50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min搖瓶培養(yǎng)36 h，將菌懸液按質(zhì)量濃度4g/100mL的比例接入盛有50g產(chǎn)香培養(yǎng)基，28℃固態(tài)發(fā)酵7 d，對發(fā)酵后樣品的酯味（10分）、酸味（10分）、酒味（10分）進(jìn)行評定，總分（30分），氣味強(qiáng)度按照數(shù)字1～10逐漸升高，可接受性數(shù)值越高接受性越強(qiáng)[20]。邀請10位專業(yè)人員對樣品的酯、酸、酒味及總體可接受性評分，篩選出感官評定總體可接受性評分較高的菌株樣品。

1.3.11 揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)對菌株固態(tài)發(fā)酵樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析檢測。

HS-SPME條件：菌株固態(tài)發(fā)酵樣品在60℃下，用50/30 μm DVB/CAR/PDMS Supelco纖維頭，手動SPME進(jìn)樣器，頂空萃取40 min。

GC條件：DB-CP97723A色譜柱，載氣為He（99.999%），載氣流速為1mL/min；程序升溫：起始溫度40℃，保持5min，以5℃/min升溫至200℃，并保持9 min；不分流進(jìn)樣；溶劑延遲時(shí)間：2 min。

MS條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 125 V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍20～450 u。以峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型大曲理化指標(biāo)對比

兩種醬香型大曲理化指標(biāo)測定結(jié)果見表1。

表1 醬香型大曲理化指標(biāo)對比Table 1 Physical and chemical indexes comparison of sauce-flavorDaqu

由表1可知，采用兩種工藝操作制得的大曲理化指標(biāo)均符合制曲標(biāo)準(zhǔn)，GT02的水分、淀粉含量、酸度高于GT01，糖化力小于GT01。大曲的水分和大曲成型力度有關(guān)，機(jī)械方法比人工踩曲受力更均勻，壓力更大，使得機(jī)械曲曲料間的間隙較傳統(tǒng)曲小，這些原因可能導(dǎo)致機(jī)械曲的水分低于傳統(tǒng)曲；大曲的酸度差異在于產(chǎn)酸微生物的數(shù)量及功能差異比如醋酸菌、乳酸菌的差異，這些微生物的數(shù)量也與大曲水分相關(guān)；淀粉含量和糖化力有關(guān)，GT01的糖化力高于GT02，故GT01中剩余淀粉量低于GT02。

2.2 酵母菌的計(jì)數(shù)、分離篩選及鑒定

采用平板稀釋涂布法，從GT01中分離篩選到9株酵母，將這些菌株按FBKL2.0200—FBKL2.0208編號；從GT02中分離篩選到12株酵母，將這些菌株按FBKL2.0209—FBKL 2.0220編號。

通過這些酵母菌株在PDA培養(yǎng)基上的單菌落形態(tài)圖、1 000×光學(xué)顯微鏡下鏡檢圖和細(xì)胞顯微形態(tài)，進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，菌株鑒定結(jié)果及來源見表2。

表2 酵母菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Morphologic,physiological and biochemical identification results of yeast strains

計(jì)數(shù)得到GT01酵母菌數(shù)為（4.71±0.11）×104CFU/g，GT02酵母菌數(shù)為（3.28±0.13）×103CFU/g。傳統(tǒng)認(rèn)為高溫大曲中酵母數(shù)量較少，現(xiàn)在通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度電泳技術(shù)對中國白酒微生物群落結(jié)構(gòu)的分析得知，在成品高溫大曲中仍存在大量酵母[21]?？赡苁窃诟邷刂魄^程中，多數(shù)酵母死亡，但依然有部分酵母處于存活或休眠狀態(tài)，且成品曲出房后儲存在常溫下，可以繼續(xù)網(wǎng)絡(luò)環(huán)境中的酵母，因而導(dǎo)致成品曲粉中酵母數(shù)量較多。酵母的數(shù)量與大曲的水分有關(guān)[7]，水分含量高會使產(chǎn)酸微生物數(shù)量增加，這些微生物的生長會在一定程度上抑制酵母的數(shù)量，所以可能導(dǎo)致了GT02中的酵母數(shù)量低于GT01。由表2可知，GT01中酵母的種類少于GT02，由于GT01生產(chǎn)的曲塊全程機(jī)械化生產(chǎn)，許多微生物在環(huán)境中還沒有穩(wěn)定，GT02是傳統(tǒng)制曲工藝，在長期的制曲環(huán)境中已經(jīng)經(jīng)過選擇形成穩(wěn)定的菌群，在制曲過程中通過傳統(tǒng)工人操作也會被帶入大曲的大量微生物，所以這些原因可能導(dǎo)致GT01與GT02中酵母種類上的差異。

2.3 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索，同源性均≥99%，MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。GT01和GT02中酵母種類維恩圖見圖2。

圖1 酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of yeast strains

圖2 GT01和GT02中酵母種類維恩圖Fig.2 Yeast classies Venn diagram in GT01 and GT02

結(jié)合酵母菌的形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，確定GT01中篩選出來的酵母共有3種：扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuliqura）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、長孢婁德酵母（Lodderomycese longisporus）；GT02中篩選出來的酵母共有6種：扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsisfibuliqura）、釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）長孢婁德酵母（Lodderomyces elongisporus）、伯頓畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）、粉狀畢赤酵母（Pichia farinosa）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzeviil）。

扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuliqura）大量存在于酸性潮濕的環(huán)境，為大曲上霉主要微生物，和釀酒酵母（S.cerevisiae）一樣在白酒成品曲中廣泛存在，具有較好的產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力[22-23]。畢赤酵母屬（Pichiasp.）也屬于大曲中的常見酵母屬[24]，從醬香白酒酒醅中篩選出來的庫德里阿茲威氏畢赤酵母（P.kudriavzeviil）具有高產(chǎn)乙酸苯乙酯的能力，對白酒有增香作用[25]，這種酵母對葡萄糖、酒精度、pH值具有較高耐受性，也用來作為果酒發(fā)酵專用菌種[26]；粉狀畢赤酵母（P.farinosa）具有高產(chǎn)甘油的能力[27]。伯頓畢赤酵母（H.burtonii）可能在大曲中對白酒香味的形成有影響[28]。從濃香型白酒酒窖中篩選出的長孢婁德酵母（L.elongisporus）具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，在葡萄酒釀造過程中與其余酵母混菌發(fā)酵時(shí)能夠明顯提高葡萄酒的香氣感官品質(zhì)[29]，粉狀畢赤酵母（P.farinosa）和長孢婁德酵母（L.longisporus）這兩種酵母的功能雖然目前在醬香型白酒釀造過程中還未見報(bào)道，但是它們產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和胞外酶等在一定程度上能提高白酒風(fēng)味的復(fù)雜性[30]，隨著人們對白酒釀造微生物認(rèn)識的不斷深入，這類酵母在醬香型白酒釀造中的具體功能將逐漸被揭示。

2.4 酵母菌的產(chǎn)酒功能

表3 TTC培養(yǎng)基上的顯色反應(yīng)結(jié)果Table 3 Chromogenic reaction results in TTC medium

TTC是一種無色顯色劑，能和酵母細(xì)胞中的還原性脫氫物質(zhì)發(fā)生顯色反應(yīng)，因此可以根據(jù)酵母菌株在TTC培養(yǎng)基上的顯色程度，初步判定酵母呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)酒精能力的大小[31]。呼吸酶活力較強(qiáng)的菌株顯色較深，即顯色較深的酵母菌株產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)[32]。酵母菌株在TTC培養(yǎng)基上顯色反應(yīng)結(jié)果如表3所示。

通過顯色反應(yīng)，選擇表3中顏色為玫紅色、深玫紅、深紅色的17株酵母菌株進(jìn)行產(chǎn)酒復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，以市售安琪酵母菌株為對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以發(fā)酵8d后的CO2質(zhì)量損失，20℃時(shí)的酒精度和殘?zhí)呛繛閰⒖贾笜?biāo)，對這些酵母的產(chǎn)酒性能進(jìn)行進(jìn)一步的比較，結(jié)果見圖3。

圖3 不同菌株的CO2質(zhì)量損失、20℃時(shí)酒精度及殘?zhí)呛糠治鯢ig.3 Analysis of CO2weightloss,alcohol content at 20℃and residual sugar content of different strains

從圖3可以看出，GT01中篩選出來的產(chǎn)酒精度最高的酵母菌株為FBKL2.0207，發(fā)酵8 d后，發(fā)酵液殘?zhí)呛繛椋?.10±0.6）g/100 g，CO2質(zhì)量損失為（13.06±0.02）g，20℃時(shí)酒精度為（10.2±0.1）%vol；GT02中篩選出來的產(chǎn)酒精度最高的酵母菌株為FBKL2.0217，發(fā)酵8 d后，發(fā)酵液殘?zhí)呛繛椋?.10±0.4）g/100 g，CO2質(zhì)量損失為（12.68±0.01）g，20℃時(shí)酒精度為（10.2±0.4）%vol；這兩株酵母都為釀酒酵母（S.cerevisiae）。對照組市售安琪酵母菌株，發(fā)酵8 d后，發(fā)酵液殘?zhí)呛繛椋?.7±0.3）g/100 g，CO2質(zhì)量損失為（12.87±0.09）g，20℃時(shí)酒精度為10.2%vol；與對照組相比，兩者中的其余菌株產(chǎn)酒性能均較弱。通過計(jì)算GT01和GT02中進(jìn)行產(chǎn)酒復(fù)篩實(shí)驗(yàn)的菌株在20℃時(shí)產(chǎn)酒精度平均值，發(fā)現(xiàn)GT01中篩選出的菌株的平均產(chǎn)酒性能為GT02的1.04倍。兩者中產(chǎn)酒精度最強(qiáng)的菌株在相同條件下產(chǎn)酒精度基本一致?？傮w來看GT01中酵母菌株的產(chǎn)酒精度較強(qiáng)。

2.5 酵母菌的產(chǎn)香功能

酵母菌株經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后的產(chǎn)物，以酯味（10分）、酸味（10分）、酒味（10分）、總分（30分）為評定指標(biāo)，邀請10位專業(yè)人員進(jìn)行感官評定，感官評定結(jié)果見表4。

表4 菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評定結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of product from strains with solid state fermentation

根據(jù)表4的感官評定結(jié)果，可以看出大曲中篩選出來的不同種屬的酵母產(chǎn)香能力各異，同種屬酵母間產(chǎn)香功能差異不大。選擇感官評定總體評分≥15分的菌株作為產(chǎn)香優(yōu)勢菌株，將它們的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)HS-SPME后進(jìn)行GC-MS分析檢測，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對百分含量，篩選出來的優(yōu)勢菌株FBKL2.0207、FBKL2.0211、FBKL2.0217固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分的相對含量結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在菌株FBKL2.0207固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性香氣成分中檢測到醇類物質(zhì)5種，相對含量總和為37.356%；酯類物質(zhì)6種，相對含量總和為17.453%；酮類物質(zhì)1種，相對百分含量為0.603%；酸類物質(zhì)2種，相對含量總和為13.167%；烯類物質(zhì)1種，相對含量為1.101%。其中帶有水果香氣的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為17.526%，帶甜味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為16.645%，帶有芳香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量為1.101%，帶有奶油香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量為0.603%，帶酸味的揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量為11.261%，帶有愉快的玫瑰香氣的物質(zhì)相對含量為17.788%。

圖4 產(chǎn)香優(yōu)勢菌株揮發(fā)性成分相對含量Table 4 Relative content of volatile components of aroma-producing superiority strains

在菌株FBKL2.0211固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性香氣成分中檢測到醇類物質(zhì)6種，相對含量總和為18.252%；酮類物質(zhì)3種，相對含量總和為58.479%；酸類物質(zhì)2種，相對含量總和為2.306%。其中帶有水果香氣的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為5.943%，具有芳香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量為0.1%，帶有草藥香味揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量為0.7%，帶有青草香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為0.232%，帶有蠟香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為11.322%，帶有奶油香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為56.654%，帶酸味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為0.534%，帶有愉快的玫瑰香氣的揮發(fā)性物質(zhì)含量為4.086%。

在菌株FBKL2.0217固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性香氣成分中檢測到醇類物質(zhì)4種，相對含量總和為38.821%；酯類物質(zhì)3種，相對含量總和為17.092%；酮類物質(zhì)2種，相對含量總和為1.416%；酸類物質(zhì)1種，相對含量為0.802%。其中帶有水果香氣的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為17.797%，帶甜味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為1.751%，帶有草藥香味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為1.051%，帶有奶油香氣味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為1.264%，帶酸味的揮發(fā)性物質(zhì)相對含量為0.802%，帶有愉快的玫瑰香氣的揮發(fā)性物質(zhì)含量為37.119%。

綜上，兩種大曲中的產(chǎn)香酵母均能產(chǎn)生醇、酸、酯、酮類揮發(fā)性物質(zhì)。揮發(fā)性化合物在白酒風(fēng)味中扮演著重要的角色，這些揮發(fā)性化合物一些來自原料老熟過程，但主要為酵母在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生[33]。醬香型白酒的風(fēng)味與揮發(fā)性成分所占比例密切相關(guān)，這些成分之間相互協(xié)調(diào)的比例，才使醬香型白酒具有了獨(dú)特的風(fēng)味。

3 結(jié)論

GT01中酵母菌的數(shù)量為GT02的1.44倍，GT02中的酵母種類為GT01的2倍；兩個(gè)大曲中同時(shí)存在的酵母屬有復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsissp.）、婁德酵母菌屬（Lod deromycessp.）、酵母屬（Saccharomycessp.）。兩種大曲中數(shù)量最多的酵母均是扣囊復(fù)膜酵母（S.fibuligera）。GT01和GT02中產(chǎn)酒精度最高的兩株菌均為釀酒酵母（S.cerevisiae），且在相同條件下兩株菌的產(chǎn)酒精度相同。從產(chǎn)酒精度平均值水平上看，GT01中篩選出來的酵母菌株的產(chǎn)酒功能為GT02的1.04倍。從產(chǎn)香上看，兩種大曲中的產(chǎn)香酵母均能產(chǎn)生醇、酸、酯、酮類揮發(fā)性物質(zhì)。通過對GT01和GT02中酵母菌的初步研究，可以看出兩者各有優(yōu)劣，科學(xué)技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)新，可使機(jī)械大曲逐步改良優(yōu)化使其性能更接近于傳統(tǒng)大曲，同時(shí)結(jié)合機(jī)械化生產(chǎn)節(jié)省人力物力，降低成本的優(yōu)點(diǎn)，未來大規(guī)模的機(jī)械化生產(chǎn)在保證大曲質(zhì)量的前提下，還能提高企業(yè)生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。

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Preliminary studies on yeasts from sauce-flavorDaqumade by traditional and mechanical methods

JIANG Sixia1,2,QIU Shuyi1,2,ZOU Jiangpeng3,CHEN Linlin1,2,LUO Xiaoye1,2,WANG Xiaodan1,2,4*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.Guizhou Guotai Distillery Co.,Ltd.,Renhuai 564501,China;4.College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The yeasts were screened and isolated from sauce-flavorDaqumade by traditional and mechanical methods.The quantity,species and functional differences of yeasts were analyzed and compared.Results showed that the quantity of yeasts in mechanical-madeDaquwas 1.44 times than that in traditional-madeDaqu;but the yeasts species in traditional-madeDaquwas 2 times than that in the mechanical-madeDaqu.In the same condition,the alcohol content of the highest performance yeast by both methods at 20℃were 10.2%vol,the alcohol production capacity of yeasts screened from mechanical-madeDaquwas 1.04 times than that from traditional-madeDaquin average.In aroma-producing aspect,bothDaqucan produce alcohols,acids,esters and ketones.

sauce-flavor;traditional-madeDaqu;mechanical-madeDaqu;yeast;function

TS261.1

0254-5071（2017）03-0059-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.013

2016-10-17

貴州省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2016]2340）；貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字[2014]3012）；貴州省重大專項(xiàng)項(xiàng)目（黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6012）

蔣思峽（1993-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c發(fā)酵技術(shù)。

*通訊作者：王曉丹（1980-），女，高級實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。