能量策略對酶法合成谷胱甘肽效率影響

孫維景，段超，孫怡然，萬偉建，段學(xué)輝*

（南昌大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047）

能量策略對酶法合成谷胱甘肽效率影響

孫維景，段超，孫怡然，萬偉建，段學(xué)輝*

（南昌大學(xué)食品學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047）

通過比較和調(diào)控細胞酶催化前體氨基酸合成谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)過程中的能量類型和添加策略，跟蹤反應(yīng)過程中合成GSH的濃度變化，考察能量種類和添加模式對酶法合成GSH轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，葡萄糖作為能量碳源對酵母細胞酶催化合成GSH轉(zhuǎn)化率的影響明顯，初始反應(yīng)液添加100 mmol/L葡萄糖酶法合成GSH轉(zhuǎn)化率為27.88%，分批定點流加葡萄糖(第2、3、4小時各添加27.78 mmol/L)酶法合成GSH轉(zhuǎn)化率可達到35.81%；在酶反應(yīng)過程能量供應(yīng)策略中，初始反應(yīng)液中添加0.5 g/L的腺苷時，酶法合成GSH的轉(zhuǎn)化率提高到36.37%；初始反應(yīng)液添加0.5 g/L腺苷結(jié)合分批定點流加葡萄糖(第2、3、4小時各添加27.78 mmol/L)，酶法合成GSH轉(zhuǎn)化率達到41.57%。

谷胱甘肽；細胞酶；催化合成；能量

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的同時具有γ-谷氨?；蛶€基的活性三肽化合物[1-2]。GSH是一種廣泛存在于生物體中的活性物質(zhì)，具有解毒、抗氧化性、維持細胞內(nèi)氧化還原平衡和輔助蛋白質(zhì)復(fù)性等重要的生理功能[3-5]。近幾年，谷胱甘肽在醫(yī)療、保健、食品和日化行業(yè)的應(yīng)用越來越廣泛[6]。酶法合成GSH是在反應(yīng)體系中加入前體氨基酸，供給能量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、輔助因子（Mg2+），利用酵母細胞中的GSH合成酶系催化合成GSH方法[7-8]。近年來，酶法合成GSH的研究主要集中在兩個方面，一是構(gòu)建高表達GSHⅠ和GSHⅡ酶的工程菌來提高GSH的合成能力[9-11]，二是通過調(diào)控細胞酶催化反應(yīng)動力學(xué)影響因素來提高GSH的轉(zhuǎn)化效率[12-14]。在后者的研究中，ATP能量的有效供給是影響酶反應(yīng)效率的主要因素之一。LIN J等[15]利用大腸桿菌（Escherichia coil）的GSH合成酶系和釀酒酵母（Saccha romyces cerevisiae）WSH2中ATP合成酶系，構(gòu)建以葡萄糖為能源的ATP再生系統(tǒng)，同時向反應(yīng)液里添加腺苷脫氨酶抑制劑、敲除能量再生細胞中的腺苷脫氨酶基因，切斷腺苷到次黃嘌呤的轉(zhuǎn)化途徑，提高ATP的再生效率，進而增加GSH產(chǎn)量。YOSHIDAH等[16]通過代謝工程手段，構(gòu)建高GSH合成酶系工程菌，細胞催化合成GSH產(chǎn)量相對于原始菌提高了2.6倍。

本實驗研究主要考察酶催化合成GSH反應(yīng)過程中的能量作用，通過調(diào)控能量添加模式，探討組合能量添加模式，保持反應(yīng)系統(tǒng)中能量再生水平和有效供應(yīng)，對酶法合成谷胱甘肽轉(zhuǎn)化效率的促進作用。本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^改變酶法合成GSH過程中能量的供給方式來提高GSH的產(chǎn)率，為酶法合成GSH的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SP5：南昌大學(xué)食品科學(xué)國家重點實驗保藏。

還原型谷胱甘肽（純度98%）、四氧嘧啶（純度98%）、腺苷（純度≥99%）、L-谷氨酸（純度99%）、L-半胱氨酸（純度99%）、甘氨酸（純度＞99%）：上海晶純試劑有限公司；水合氯化鎂（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：汕頭市西隴化工股份有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。

酶催化合成GSH反應(yīng)液：磷酸鉀緩沖液100 mmol/L，L-Glu 20 mmol/L，L-Cys 20 mmol/L，葡萄糖100 mmol/L，Gly 40 mmol/L，MgCl2·6H2O 10 mmol/L，pH 7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

756PC紫外可見光分光光度計：上海光譜儀器有限公司；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜：蘇凈集團安泰公司；DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器：江蘇太倉試驗設(shè)備廠；DSX-280A手提式蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；AL104電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

將在-20℃保藏的酵母菌種接種到活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2 d；接種到裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h；種子液以10%（V/V）接種量添加至裝有50 mL發(fā)酵液的250 mL錐形瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h[17]；離心，收集酵母細胞，放-20℃冰箱里冷凍保存。

1.3.2 不同碳源和濃度對酶催化合成GSH的影響

取冷凍酵母細胞2g放入裝有10mL酶反應(yīng)液的100mL錐形瓶中，酶反應(yīng)液的糖源分別為葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖，其初始濃度分別為50mmol/L、100mmol/L和150mmol/L，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，過程跟蹤檢測GSH轉(zhuǎn)化率。

1.3.3 葡萄糖及其添加策略對酶催化合成GSH的影響

（1）不同初始葡萄糖濃度對酶催化合成GSH的影響

初始葡萄糖添加量分別為50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L，測定合成GSH含量。

（2）一次性添加不同量的葡萄糖對酶催化合成GSH的影響

選擇在第4小時分別添加葡萄糖濃度55.56 mmol/L，83.33 mmol/L和111.11 mmol/L，測定其對合成GSH含量的影響。

（3）不同時間一次性添加83.33 mmol/L葡萄糖對酶催化合成GSH的影響

選擇分別在第2、3、4小時添加83.33 mmol/L的葡萄糖，跟蹤檢測酶催化反應(yīng)過程中合成GSH含量。

（4）不同時間分別流加葡萄糖對酶催化合成GSH的影響

在第2、3、4小時各添加一次葡萄糖（27.78 mmol/L），使葡萄糖總量83.33 mmol/L保持不變，跟蹤測定酶催化反應(yīng)過程中合成GSH含量。

1.3.4 添加不同質(zhì)量濃度腺苷對酶催化合成GSH的影響

分別向初始反應(yīng)液中添加0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L的腺苷，跟蹤測定酶催化反應(yīng)過程中合成GSH含量。

1.3.5 添加三磷酸腺苷和流加葡萄糖組合對酶催化合成

GSH的影響

在初始反應(yīng)液中添加0.5 g/L三磷酸腺苷，同時在第2、3、4小時各添加一次葡萄糖（27.78 mmol/L），使葡萄糖總含量為83.33mmol/L保持不變，跟蹤測定酶催化反應(yīng)過程中合成GSH含量。

1.3.6 GSH測定方法

準確稱量用濾紙吸干的釀酒酵母2g，加入到含有10mL酶法反應(yīng)液的100mL錐形瓶里，37℃、200r/min反應(yīng)。過程檢測時，將反應(yīng)液和酵母細胞轉(zhuǎn)入20mL離心管，6000r/min離心10 min，取上清液按照四氧嘧啶法[18]測定其吸光度值，按照GSH標準曲線回歸方程計算酶反應(yīng)液中GSH含量。GSH轉(zhuǎn)化率的計算公式如下：

式中：OD305nm表示在波長305 nm處的吸光度值；N表示酶反應(yīng)液稀釋倍數(shù)；C表示初始添加的半胱氨酸的質(zhì)量濃度，mmol/L；0.011 2表示截距；9.016 7表示斜率；307.33表示GSH的分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH標準曲線

圖1 谷胱甘肽標準曲線Fig.1 Standard curve of glutathione

用GSH標準品配制0.1mg/mL的GSH標準溶液，依次稀釋得到質(zhì)量濃度分別為0、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的GSH標準溶液。每組依次加入0.1 mol/L的四氧嘧啶溶液1 mL，0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.5）1 mL，0.1 mol/L的NaOH溶液1 mL，立即搖勻，放置6 min，加入1 mol/L的NaOH溶液1 mL，再次搖勻，在波長305 nm處測定其吸光度值。以GSH的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制GSH標準曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，GSH標準曲線回歸方程：y=9.016 7x+ 0.011 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。表明GSH質(zhì)量濃度在0～0.10 g/L范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

2.2 不同碳源和濃度對GSH合成的影響

反應(yīng)液中加入不同濃度、不同糖源細胞酶催化合成GSH實驗，跟蹤測定GSH含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同碳源和濃度對酶催化谷胱甘肽合成的影響Table 1 Effect of different carbon sources and concentration on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

從表1可以看出，不同濃度麥芽糖與乳糖為碳源時，細胞酶催化合成GSH的轉(zhuǎn)化率較低（僅為7.01%～9.55%），可能是由于酵母細胞利用麥芽糖和乳糖合成ATP的轉(zhuǎn)化率較低[19]。在蔗糖和葡萄糖初始添加量≥100 mmol/L時，酵母細胞利用蔗糖催化合成GSH轉(zhuǎn)化率的效果低于葡萄糖，故選擇葡萄糖作為碳源。當初始葡萄糖添加量分別為100 mmol/L、150 mmol/L時，GSH轉(zhuǎn)化率分別達到27.88%、28.34%。因此，選擇葡萄糖作為碳源，從經(jīng)濟角度考慮，選擇初始葡萄糖添加量為100 mmol/L。

2.3 葡萄糖能量供應(yīng)策略對酶催化合成GSH的影響

2.3.1 不同初始葡萄糖濃度對酶催化合成GSH的影響

不同初始葡萄糖濃度酶催化合成GSH實驗結(jié)果見圖2。

圖2 不同初始葡萄糖濃度對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.2 Effect of initial glucose concentration on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

由圖2可知，當初始葡萄糖的濃度為50mmol/L時，反應(yīng)液中合成GSH轉(zhuǎn)化率為16.92%；與100 mmol/L葡萄糖GSH轉(zhuǎn)化率27.88%相比低10.96個百分點。說明低的初始葡萄糖濃度影響酶催化合成GSH的連續(xù)合成。當初始葡萄糖的濃度為150mmol/L時，合成GSH轉(zhuǎn)化率相對100 mmol/L葡萄糖效果沒有明顯提高，說明酶催化反應(yīng)過程中能量的轉(zhuǎn)化利用效率和酶催化反應(yīng)機制共同影響GSH的轉(zhuǎn)化[8]。結(jié)果表明，初始葡萄糖濃度添加量為100mmol/L時，GSH轉(zhuǎn)化率較高，達到27.88%。

2.3.2 補加葡萄糖質(zhì)量濃度對酶催化合成GSH的影響

在酶催化合成GSH反應(yīng)4 h時，向反應(yīng)液中分別補加55.56 mmol/L、83.33 mmol/L和111.11 mmol/L葡萄糖，考察GSH轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，過程（反應(yīng)4 h時）補加83.33 mmol/L的葡萄糖GSH轉(zhuǎn)化率為30.80%；補加111.11 mmol/L葡萄糖GSH轉(zhuǎn)化率30.56%，轉(zhuǎn)化率增量與添加83.33 mmol/L相近，但達到轉(zhuǎn)化率高點的時間比補加83.33mmol/L葡萄糖明顯延長2h；補加55.56mmol/L葡萄糖最終GSH轉(zhuǎn)化率28.90%，其效果明顯低于添加83.33mmol/L葡萄糖（GSH轉(zhuǎn)化率30.80%）。結(jié)果表明，補加83.33mmol/L的葡萄糖效果較優(yōu)。

圖3 在第4小時添加不同濃度葡萄糖對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.3 Effect of adding different glucose concentration at 4 h on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

2.3.3 葡萄糖補加時機對酶催化合成GSH的影響

圖4 在不同時間添加相同量葡萄糖對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.4 Effect of adding the same glucose concentration at different time on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

分別在酶反應(yīng)第2、3、4小時添加83.33 mmol/L葡萄糖，檢測反應(yīng)過程中合成GSH的濃度，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在第2小時補加葡萄糖，GSH轉(zhuǎn)化率為30.20%；在第3小時補加葡萄糖，其高點GSH轉(zhuǎn)化率達到33.08%；在第4小時補加葡萄糖的效果與在第2小時補加相近。結(jié)果表明，在第3小時補加葡萄糖時機合適。

2.3.4 葡萄糖多點流加策略對酶催化合成GSH的影響

選擇在第2、3、4小時各流加27.78 mmol/L葡萄糖，流加總量控制83.33 mmol/L葡萄糖，并以第3小時添加葡萄糖作為對照，實驗跟蹤反應(yīng)過程中合成GSH的濃度，結(jié)果見圖5。由圖5可知，采用多點葡萄糖能量流加操作時，反應(yīng)液中GSH轉(zhuǎn)化合成含量穩(wěn)定增加，其GSH轉(zhuǎn)化率最高達到35.81%。結(jié)果表明，分批多次流加葡萄糖能夠避免一次性添加所引起的葡萄糖過快消耗而導(dǎo)致的反應(yīng)過程區(qū)間能量供應(yīng)不足現(xiàn)象，能夠較好地穩(wěn)定和維持反應(yīng)系統(tǒng)的能量再生和供應(yīng)，保障細胞酶催化合成GSH的能量需求，提高酶催化轉(zhuǎn)化效率[20]。

圖5 不同補加葡萄糖方式對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.5 Effect of different adding ways of glucose on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

2.4 添加能量前體腺苷對酶催化合成GSH的影響

圖6 添加不同濃度腺苷對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.6 Effect of different adenosine concentrations on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

腺苷是能量ATP的前體，添加少量腺苷，有利于改善初始酶反應(yīng)液的能量水平，提高GSH合成效率。實驗向反應(yīng)液中分別添加0.2 g/L、0.5 g/L、0.8 g/L的腺苷，考察過程GSH催化轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果見圖6。由圖6可知，向初始反應(yīng)液中添加不同濃度腺苷后，細胞酶催化合成GSH的起動和反應(yīng)速度明顯加快，當添加0.2 g/L腺苷時，反應(yīng)6 h，GSH轉(zhuǎn)化率為32.26%；初始反應(yīng)液中添加0.5 g/L的腺苷時，合成GSH速度在第4～6小時間明顯提高，反應(yīng)6 h合成GSH轉(zhuǎn)化率最高為36.37%；當初始反應(yīng)液中添加0.8 g/L腺苷時，其GSH合成速度和轉(zhuǎn)化率提高不大，其原因可能是由于反應(yīng)液中腺苷濃度過高，ATP轉(zhuǎn)化率降低而且大量未轉(zhuǎn)化的中間體ADP抑制GSH的合成致使GSH轉(zhuǎn)化率降低[21-22]。結(jié)果表明，添加適當濃度的腺苷，能夠提高初始反應(yīng)液中能量ATP的濃度，有利細胞酶催化合成GSH。

2.5 添加腺苷和葡萄糖流加組合能量策略對酶催化合成GSH的影響

反應(yīng)液初始添加0.5 g/L腺苷，酶催化合成反應(yīng)至第2、3、4小時分別流加27.78 mmol/L的葡萄糖，組合調(diào)控反應(yīng)系統(tǒng)中的能量供應(yīng)，跟蹤測定酶反應(yīng)過程中合成GSH的濃度，結(jié)果見圖7。由圖7可知，組合添加腺苷和葡萄糖流加能量供應(yīng)操作時，反應(yīng)液中合成積累的GSH濃度穩(wěn)定上升，GSH轉(zhuǎn)化效率明顯提高，其反應(yīng)液中合成GSH轉(zhuǎn)化率最高達到41.57%。結(jié)果表明，過程中能量的穩(wěn)定有序供應(yīng)對酶反應(yīng)GSH的合成和轉(zhuǎn)化效率提高有促進作用。

圖7 添加腺苷同時流加葡萄糖對酶催化合成谷胱甘肽的影響Fig.7 Effect of adding adenosine combined with fed-batch glucose on the enzyme catalytic synthesis of glutathione

3 結(jié)論

生物酶催化合成GSH是大多數(shù)生物體內(nèi)重要的合成代謝活動之一。能量的供應(yīng)直接影響著GSH的合成效率。篩選合適的能量糖源，調(diào)控酶催化合成GSH反應(yīng)中的能量水平和再生效率，選擇組合腺苷預(yù)加和葡萄糖流加能量策略，對酵母細胞酶催化合成GSH的轉(zhuǎn)化效率有明顯的提高作用。酶催化合成GSH研究結(jié)果表明，多次分批流加葡萄糖有利于穩(wěn)定酶反應(yīng)中的ATP再生和能量供應(yīng)，提高合成GSH的轉(zhuǎn)化率；采用組合初始反應(yīng)液添加0.5 g/L腺苷和過程流加能量葡萄糖策略，能夠提高初始反應(yīng)液中ATP的濃度和穩(wěn)定細胞酶催化合成GSH反應(yīng)過程中的能量供給，其合成GSH轉(zhuǎn)化率最高達到41.57%。結(jié)果表明，添加0.5 g/L腺苷和過程流加能量葡萄糖策略可以提高GSH的合成效率。

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Effect of energy strategy on the efficiency of enzymatic synthesis of glutathione

SUN Weijing,DUAN Chao,SUN Yiran,WAN Weijian,DUAN Xuehui*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology,School of Food Science and Technology,Nanchang University, Nanchang 330047,China)

Through the comparison and regulation of energy types and adding strategy in the process of glutathione(GSH)synthesis by cell enzyme catalytic precursor amino acids,the changes of GSH content in the reaction process were detected.The effects of energy types and adding modes on the conversion efficiency of GSH were investigated.The results showed that the glucose as energy carbon source had obvious effect on the conversion rate of GSH by yeast cells enzyme catalytic synthesis.The conversion rate of GSH by enzyme catalytic synthesis was 27.88%with addition of glucose 100 mmol/L in the initial reaction solution and 35.81%using batch addition glucose operation(adding glucose 27.78 mmol/L at 2 h,3 h, 4 h,respectively)in the initial reaction solution.In the process of energy supply strategy of enzyme reaction,the conversion rate of GSH by enzyme catalytic synthesis was increased to 36.37%with addition of adenosine 0.5 g/L in the initial reaction solution.When adding adenosine 0.5 g/L combined with glucose(adding glucose 27.78 mmol/L at 2 h,3 h,4 h,respectively)in the initial reaction solution,the conversion rate of GSH reached to 41.57%.

glutathione;cell enzymes;catalytic synthesis;energy

TQ920.1

0254-5071（2017）03-0049-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.011

2016-12-22

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-TS-201113）

孫維景（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。

*通訊作者：段學(xué)輝（1958-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。