利用楊木水解液制備細菌纖維素

陳慧慧 劉玉 王慧梅

（齊魯工業(yè)大學 制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室，濟南 250353）

利用楊木水解液制備細菌纖維素

陳慧慧 劉玉 王慧梅

（齊魯工業(yè)大學 制漿造紙科學與技術教育部重點實驗室，濟南 250353）

選用楊木木屑水解液為發(fā)酵基質，利用木醋桿菌發(fā)酵制備細菌纖維素。研究還原糖濃度、初始pH值、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響。結果表明，生產細菌纖維素的適宜條件為：楊木木屑水解液還原糖濃度為2.5%，初始pH為6.0，接種量為6%，發(fā)酵時間6 d，發(fā)酵溫度30℃，在此條件下，細菌纖維素產量為3.14 g/L，持水性為98.72%，復水率為86.69%。采用掃描電鏡、紅外光譜、熱失重分析法等技術分析了所制備的細菌纖維素的結構與性能，結果表明合成產物為超微細網狀結構，且產物中含有的基團與纖維素結構相符合。

楊木木屑水解液；掃描電鏡；紅外光譜；熱失重分析法

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由部分細菌產生的纖維素。木醋桿菌在靜化培養(yǎng)時，培養(yǎng)基氣液交界處會形成一層白色透明的膜，這種膜被鑒定為纖維素，由Brown首次報道［1］。細菌纖維素相對于其他纖維素，具有很多優(yōu)良的特性，如高持水性、高結晶度和高聚合度等［2，3］。BC在許多領域都有廣泛應用［3-5］，在醫(yī)藥方面，BC具有改善消化系統(tǒng)功能、降低膽固醇、避免便秘、預防癌癥和延緩衰老等獨特功能［6，7］。在食品行業(yè)，BC可以作為一種膳食纖維［8］、乳化劑和增稠劑［9］。在造紙行業(yè)，把BC添加到紙張中，紙張的強度、彈性、膨脹性和耐用性都有相應的提高，同時還可以增加紙張吸水性能［10］。在紡織行業(yè)，細菌纖維素可作為Lyocell人造纖維原料［11］和人造皮革制品等。

目前，利用單糖等合成或半合成培養(yǎng)基碳源制備細菌纖維素效果較好，但其成本太高，限制了細菌纖維素的規(guī)?；a。尋找產量大且價低的天然培養(yǎng)基是實現細菌纖維素規(guī)?；a的突破口，而水果類原料、低值淀粉類原料、糖質原料和廢棄纖維類原料成為尋找的方向。Kurosumi等［12］利用各種果汁，如橘子汁、菠蘿汁、蘋果汁、梨汁等作為發(fā)酵碳源生產細菌纖維素。水果類原料雖來源豐富，但其季節(jié)波動性和地域局限性比較大，限制其大規(guī)模推廣。2010年，韓國Jung等［13］分別利用糖蜜和玉米漿為碳氮源制備細菌纖維素，8 d后產量最高達3.12 g/L。糖蜜和低值淀粉類原料因含糖高，來源廣泛，被作為生產細菌纖維素的優(yōu)良碳源，但如果將其作為大規(guī)模生產細菌纖維素的碳源，可能會存在與其他行業(yè)（如燃料酒精）爭奪原料的問題。而木質纖維類原料不存在占用耕地等問題，來源廣泛且價格低廉。東華大學的洪楓等［14-17］以農作物秸稈為原料制備出了細菌纖維素，經過兩步法水解，脫毒得到水解液，然后配成發(fā)酵培養(yǎng)基來制備細菌纖維素。2010年，Chia-Hung等［18］研究了通過對廢棄纖維織物做不同的預處理，進而比較了不同的預處理方法對細菌纖維素產量的影響。楊木木屑是一種纖維素廢料，來源廣且價格低廉，最主要的是纖維素含量高。本研究是以楊木木屑為原料，經過預處理，酶水解，脫毒和發(fā)酵4個過程制備細菌纖維素，研究發(fā)酵條件對BC產量、持水性、復水率的影響，并對BC的結構與性質進行分析，旨在為BC的低成本生產提供新的可能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌種 木醋桿菌（Acetobacter xylinum），由齊魯工業(yè)大學造紙重點實驗室提供；楊木木屑（40目），由濟南市齊河冠軍紙業(yè)提供。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鈉、檸檬酸、葡萄糖均為分析純，購自天津大茂化學試劑廠；蛋白胨、酵母浸粉均為生物試劑，購自北京奧博里生物技術有限公司；磷酸氫二鈉為分析純，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基（用于菌種的活化）：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、檸檬酸0.1%、瓊脂2% pH6.0，121℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（擴種培養(yǎng)）：葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、檸檬酸0.1%、pH 6.0，121℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（用于細菌纖維素的制備）：（1）葡萄糖2%、蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、檸檬酸0.1%，121℃高壓滅菌20 min；（2）在楊木木屑水解液中添加蛋白胨0.5%、酵母粉0.5%、磷酸氫二鈉0.5%、檸檬酸0.1%，121℃高壓滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設備 Agilent8453紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；數顯生化培養(yǎng)箱（正基儀器有限公司）；壓力蒸汽滅菌器（武漢市鴻雁醫(yī)療器械制造有限公司）；氣浴恒溫振蕩器（金壇市國旺實驗儀器廠）；SU8010場發(fā)射掃描電鏡（日本日立）；IRPrestige-21傅里葉紅外光譜測定儀（日本島津公司）；TGA Q50熱重分析儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 楊木木屑水解液制備 稱取一定質量絕干原料放入反應器中，加入5%的稀硫酸進行預水解，底物濃度為5%，反應結束后用氫氧化鈉將pH調至5。向預水解液中加入纖維素酶50 FPU/g，將反應器放入搖床中，溫度設為50℃，轉速設為150 r/min，反應48 h。反應完畢后進行抽濾，將水解液進行稀釋中和后，用紫外分光光度計測定還原糖的含量。水解液經過活性炭脫毒處理后，放入冰箱中備用。

1.2.2 培養(yǎng)方法 斜面菌種的活化：將冷凍保存的木醋桿菌接種到新的斜面培養(yǎng)基中，在30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出新菌落，反復接種到新的斜面培養(yǎng)基，至在短時間內長出新的菌落為止。

種子培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取一環(huán)活化好的菌落接種到裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于30℃下160 r/min搖床培養(yǎng)24 h（菌懸液濃度約為1×107個/mL）使用。

發(fā)酵培養(yǎng)：用移液槍從種子培養(yǎng)基中吸取一定量的種子培養(yǎng)液，接入分別以葡萄糖和楊木木屑水解液所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基，紗布封口，恒溫靜置培養(yǎng)數天。

1.2.3 細菌纖維素處理 在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)數天后，取出BC，先用去離子水進行多次沖洗，然后將BC放入0.1 mol/L的NaOH溶液中，在90℃的水浴中加熱4 h至BC呈半透明乳白色，此過程是除去菌體和殘余培養(yǎng)基，然后將BC放入0.1 mol/L HCl溶液中，30 min后再用去離子水反復沖洗至pH為中性。

1.2.4 以楊木木屑水解液制備細菌纖維素條件的優(yōu)化

1.2.4.1 還原糖濃度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 在培養(yǎng)溫度30℃，發(fā)酵時間5 d，pH5，接種量為4%的條件下，以楊木木屑水解液所配制的培養(yǎng)基來制備細菌纖維素，探究培養(yǎng)基中還原糖濃度對細菌纖維素產量、持水率和復水率的影響。

1.2.4.2 pH對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 在還原糖濃度2.5%，培養(yǎng)溫度30℃，接種量為4%，發(fā)酵時間5 d的條件下，以楊木木屑水解液所配制的培養(yǎng)基來制備細菌纖維素，探究初始pH對細菌纖維素產量、持水率和復水率的影響。

1.2.4.3 接種量對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 在還原糖濃度2.5%，培養(yǎng)溫度30℃，pH6.0，發(fā)酵時間5 d的條件下，以楊木木屑水解液所配制的培養(yǎng)基來制備細菌纖維素，探究接種量對細菌纖維素產量、持水率和復水率的影響。

1.2.4.4 溫度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 在還原糖濃度2.5%，pH6.0，接種量6%，發(fā)酵時間5 d的條件下，以楊木木屑水解液所配制的培養(yǎng)基來制備細菌纖維素，探究溫度對細菌纖維素產量、持水率和復水率的影響。

1.2.4.5 發(fā)酵時間對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 在還原糖濃度2.5%，pH6.0，接種量6%，溫度為30℃的條件下，以楊木木屑水解液所配制的培養(yǎng)基來制備細菌纖維素，探究發(fā)酵時間對細菌纖維素產量、持水率和復水率的影響。

1.2.5 細菌纖維素產量的計算 將處理后的細菌纖維素放入烘箱中將其烘干后，用分析天平測得其干重，細菌纖維素的產量的計算公式為：

1.2.6 細菌纖維素持水率的計算

（1）BC的持水性：將細菌纖維素濕膜經過適當的處理，用濾紙對濕膜表面水分進行吸附，然后對細菌纖維素濕膜進行稱重，重復此操作至恒重，接著將細菌纖維素濕膜放入80℃的烘箱中烘24 h至重量不在變化，最后對細菌纖維素的干膜進行稱重，按下列公式 計算BC持水性：

（2）BC干膜復水率：對細菌纖維素干膜稱質量后，將細菌纖維素干膜浸在蒸餾水中。室溫下過夜，直到細菌纖維素膜不在吸水為止，稱量細菌纖維素膜吸水后的質量，計算BC復水率：

1.2.7 掃描電鏡（SEM）觀察細菌纖維素干膜的形貌 將干燥后的細菌纖維素膜分成直徑約為0.2 cm小碎片，然后把細菌纖維素固定在樣品臺上，用掃描電子顯微鏡觀察其微纖維結構。

1.2.8 細菌纖維素膜紅外光譜的測定 紅外光譜采用傅里葉紅外光譜儀（FTIR）進行測定。波長范圍400-4 000 cm-1。干燥的KBr粉末與細菌纖維素樣品（1∶60）充分研磨混合，壓片進行檢測。

1.2.9 熱失重分析法 采用熱重分析儀（TGA）進行測定。取一定量的細菌纖維素干膜于加熱爐中，升溫速率為10℃/min，觀察在25-800℃溫度范圍內，細菌纖維素質量的變化情況。

2 結果

2.1 以楊木木屑水解液制備細菌纖維素條件優(yōu)化

2.1.1 還原糖濃度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)基中還原糖濃度的增加，細菌纖維素的產量、持水率和復水率均呈現先增加后減少的趨勢，在還原糖濃度為2.5%時達到最大，細菌纖維素產量為1.62 g/L，細菌纖維素持水率和復水率分別為97.87%和84.13%。

2.1.2 pH對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 從圖2可以觀察到，細菌纖維素的產量、持水性和復水率隨pH值的增加呈現出先增加后減少的趨勢，當pH值為6.0時，細菌纖維素產量為1.86 g/L，細菌纖維素持水性和復水率分別為97.87%和84.33%，均達到最大值。因此，適合木醋桿菌生長的最適pH值為6.0。

圖1 還原糖濃度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響

圖2 初始pH對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響

2.1.3 接種量對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 從圖3可以觀察到，在2%-6%的接種量范圍內，細菌纖維素的產量、持水性和復水率增長趨勢比較快，當接種量為6%時，細菌纖維素產量、持水性和復水率達到最大值，分別為2.71 g/L，98.56%和84.41%，接種量超過6%時，細菌纖維素產量，持水性和復水率出現下降趨勢。所以最適的接種量為6%。

圖3 接種量對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響

2.1.4 溫度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 從圖4可以明顯的觀察到，溫度對木醋桿菌的生長影響比較大，在溫度為20-40℃范圍內，細菌纖維素的產量、持水性和復水率均呈現出先增后減的趨勢，并且當溫度為30℃時，細菌纖維素產量、持水性和復水率相比其他溫度下所以制備的細菌纖維素高的多，分別達到2.79 g/L，98.71%和84.61%。所以由此可以看出，木醋桿菌最適的發(fā)酵溫度為30℃。

圖4 發(fā)酵溫度對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響

2.1.5 發(fā)酵時間對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響 從圖5可以觀察到，在前6 d發(fā)酵階段，細菌纖維素產量、持水性和復水率增長趨勢比較明顯，在發(fā)酵到6 d時，細菌纖維素的產量為3.14 g/L，細菌纖維素的持水性和復水率分別為98.72%和86.69%。當發(fā)酵時間超過6 d時，細菌纖維素的產量、持水性和復水率變化非常不明顯。所以選取木醋桿菌的發(fā)酵時間為6 d。

2.2 以楊木木屑為碳源制備的細菌纖維素的掃描電鏡

從圖6可以觀察到，以楊木木屑為碳源制備的細菌纖維素由高密度微纖維相互纏繞而成，具有超微細網狀結構特點，纖維屬于納米尺寸。正是由于細菌纖維素具有這種結構，才使得細菌纖維素具有很好的透水性能及較強的親水性能。

圖5 發(fā)酵時間對細菌纖維素產量、持水性和復水率的影響

圖6 BC的電鏡照片

2.3 不同碳源所制細菌纖維素的紅外光譜圖

從BC的紅外圖譜（圖7）可得到，以不同的碳源所制備的產物都含有纖維素分子的特征峰，3 351 cm-1處的吸收峰反映了O-H鍵的伸縮振動；2 924 cm-1處的吸收峰是CH2-CH伸縮產生的；1 652 cm-1處的吸收峰是C-H鍵伸縮振動引起的，1 059 cm-1處的吸收峰是由C-O的伸縮振動引起的，是纖維素分子的特征峰；約900 cm-1處的吸收峰是糖苷鍵的特征峰；在620 cm-1處的吸收峰可能為一些無機鹽的雜質峰，基本符合標準峰的結構，由此可以得出產物為細菌纖維素。

圖7 BC膜的紅外光譜圖

2.4 細菌纖維素的熱重分析

從圖8和圖9中觀察到，以葡萄糖和楊木木屑水解液分別為碳源制備細菌纖維素的TG-DTG曲線大致相同。

從TG曲線和DTG曲線可以看出在溫度為0-100℃范圍內，細菌纖維素質量稍有下降。隨著溫度的逐漸升高，細菌纖維素質量變化明顯。在溫度大約為240-400℃范圍內，細菌纖維素的質量呈現出急劇下降的趨勢，在此溫度范圍內，兩種細菌纖維素的質量損失率分別達到64.28%和73.64%，最大失重速率溫度分別為327.93℃和330.09℃。400℃以后，細菌纖維素下降緩慢，到700℃時，纖維素的失重率分別達到了71.64%和79.27%。

圖8 葡糖糖合成BC的TG-DTG曲線

圖9 楊木木屑水解液合成BC的TG-DTG曲線

3 討論

楊木木屑經過預處理、酶解、脫毒制備的水解液可以作為一種優(yōu)質、廉價且來源豐富的培養(yǎng)基碳源用于細菌纖維素生產。細菌纖維素的制備受多種因素的影響，本研究主要是利用單因素實驗考察了培養(yǎng)基中還原糖濃度、pH值、溫度、接種量和發(fā)酵時間等因素對纖維素產量、持水性和復水率的影響。還原糖濃度對細菌纖維素產量、持水性和復水率有較大影響，細菌纖維素產量、持水性和復水率隨著還原糖濃度的增加呈現先增后減的趨勢。這可能是在發(fā)酵初期還原糖作為營養(yǎng)物質和能源物質，被菌體快速利用，滿足菌體細胞的生長進而促進纖維素的產生，但還原糖濃度的增加會加速產酸過程，反而抑制菌體生長，限制纖維素的產生。木醋桿菌雖適合在酸性條件下生長，但過酸的環(huán)境不利于木醋桿菌的生長，從而抑制細菌纖維素的合成。溫度主要通過影響微生物細胞膜的流動性和生物大分子的活性來影響微生物的生命活動［19］，每一種微生物都有其最適的生長溫度。本實驗確定木醋桿菌最適生長溫度為30℃，這與黃丹［20］等研究木醋桿菌QAX993發(fā)酵合成細菌纖維素的最適溫度為30℃相符合。接種量大小會影響木醋桿菌在發(fā)酵體系內的生長、代謝、繁殖的速度。接種量過大，會導致底物前期消耗過快，不利于后期產物積累；接種量過少，會延長發(fā)酵周期，對生產纖維素不利。該實驗確定的適宜接種量為6%。這與趙克勤［21］利用谷氨酸提取液制備細菌纖維素使用3%-4%的接種量較為接近。發(fā)酵周期也是影響細菌纖維素合成量的一個因素，本實驗確定最適的發(fā)酵周期為6 d。這與湯衛(wèi)華［22］等研究的利用木葡糖酸醋桿菌的突變株合成細菌纖維素的最佳發(fā)酵時間為6 d相一致。

通過掃描電鏡可以看出，利用楊木木屑水解液所制備的細菌纖維素微纖維直徑不足100 nm，屬于納米級尺寸，而棉花纖維直徑一般在10-100 μm，超細人造纖維直徑約為1 μm。通過掃描電鏡還可以看出，細菌纖維素膜表面有許多納米極的小孔，這可能與細菌纖維素具有高的持水性相關，也有可能與細菌纖維素外面的物質交換有關，這方面的研究未見報道，具體情況有待進一步研究。通過紅外光譜可以觀察到，以楊木木屑水解液和葡萄糖分別為碳源所制備的細菌纖維素含有相同基團。這與沈金朋等［5］利用酒糟浸出液制備細菌纖維素的紅外光譜圖基本一致。這證明了以楊木木屑為原材料制備細菌纖維素的可行性。由于細菌纖維素含有水分，所以在0-100℃會出現質量緩慢下降趨勢。在溫度大約為240-400℃范圍內，為細菌纖維素分解過程，細菌纖維素發(fā)生各種物理化學反應，在分解產物產生的同時放出大量的熱，所以質量出現急劇下降趨勢，兩種細菌纖維的最大失重溫度分別為327.93℃和330.09℃。在溫度為400-700℃范圍內，為分解產物煅燒階段。這與George等［23］研究通過NaOH處理后的細菌纖維素分解溫度為350℃結果基本一致。從兩種細菌纖維素DTG曲線可以得出，所制備的細菌纖維素純度較高。也由此得出在細菌纖維素材料應用處理過程中，溫度不能超過240℃。

楊木木屑為實現細菌纖維素規(guī)?；a提供了可能，但如何降低水解液制備成本問題，還有待深入研究。

4 結論

楊木木屑水解液進行木醋桿菌發(fā)酵制備細菌纖維素，利用單因素實驗確定生產細菌纖素的培養(yǎng)條件為：楊木木屑水解液還原糖濃度為2.5%，接種量為6%，初始pH6.0，30℃恒溫靜止發(fā)酵6 d，細菌纖維素產量達3.14 g/L，持水性為98.72%，復水率為86.69%。掃描電鏡表明合成產物是一種超微網狀結構，其纖維直徑屬于納米尺寸，是由高密度的微纖維相互纏繞而成的。紅外光譜分析驗證了合成的產物確為細菌纖維素。熱重曲線顯示兩種細菌纖維素最大失重溫度分別為327.93℃和330.09℃，熱穩(wěn)定性好。

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（責任編輯 狄艷紅）

Employing Poplar Wood Hydrolysate to Prepare Bacterial Cellulose

CHEN Hui-hui LIU Yu WANG Hui-mei
（Key Laboratory of Pulp and Paper Science & Technology of Ministry of Education，Qilu University of Technology，Jinan 250353）

Selecting the hydrolysate of poplar wood sawdust for fermentation substrate，we used Acetobacter xylinum to prepare bacterial cellulosee，and further studied the effect of reducing sugar concentration，the initial pH，inoculum size，fermentation temperature，and fermentation time on production，water holding capacity，and rehydration rate of bacterial cellulose. The results showed that the production of bacterial cellulose was 3.14 g/L，water holding capacity of bacterial cellulose was 98.72%，and bacterial cellulose rehydration was 86.69% when reducing sugar concentration of hydrolyzed poplar wood sawdust was 2.5%，the initial pH was 6.0，inoculum size was 6%，fermentation time was 6 d，and fermentation temperature was 30℃.The detection results of scanning electron microscope，infrared spectroscopy，and thermo-gravimetric analysis indicated that the structure of synthetic product was super fine mesh and the groups of the product corresponded to the structure of cellulose.

hydrolysate of poplar wood sawdust；scanning electron microscope；infrared spectroscopy；thermo-gravimetric analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.021

2016-07-08

國家自然科學基金項目（31270626）

陳慧慧，女，碩士研究生，研究方向：植物資源化學工程與木質纖維基功能材料；E-mail：chhuihui2016054@163.com

劉玉，男，博士，教授，研究方向：植物資源化學工程與木質纖維基功能材料；E-mail：leoliuyu@163.com