全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定大米蛋白質(zhì)

郭應(yīng)時(shí) Ying-shi 曹小彥 - 鄒杭君 - 郭明義 - 張 威

(1. 廣電計(jì)量檢測(cè)﹝湖南﹞有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2. 長(zhǎng)春市食品藥品監(jiān)督管理局，吉林 長(zhǎng)春 130000)

目前已報(bào)道的蛋白質(zhì)測(cè)定方法可分為兩類：間接法和直接法。間接法根據(jù)定氮后的氮含量，利用蛋白質(zhì)系數(shù)計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法是使用最廣泛的間接方法；直接法利用蛋白質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)，采用儀器通過建立工作曲線得出蛋白質(zhì)含量[1-3]，直接方法有近紅外光譜法[4]、紫外分光光度法[5]、電泳法[6]、紫外吸收光譜法[7]和Bradford法[8]。

凱氏定氮法憑借著靈敏度高、穩(wěn)定性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，成為了目前分析含氮化合物最常用的方法，被國(guó)內(nèi)外作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[9]。由于傳統(tǒng)的半微量定氮法檢測(cè)時(shí)間需要4～6 h，效率低下，全自動(dòng)凱氏定氮法得到了較快發(fā)展。目前對(duì)凱氏定氮法測(cè)定食品蛋白質(zhì)進(jìn)行的研究已有不少[10-11]，但是利用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定特定食品蛋白質(zhì)的研究報(bào)道僅見于大豆、小麥、乳制品。盡管供應(yīng)商都會(huì)根據(jù)各自儀器的特性提供一個(gè)基本方法以滿足大部分樣品的分析，但是由于食品基質(zhì)復(fù)雜，普適性再?gòu)?qiáng)的方法具體到特定的樣品時(shí)不一定是最佳方法，希望用同一處理方法來處理所有類型的樣品是不切實(shí)際的，需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和改進(jìn)。有針對(duì)性地優(yōu)化建立最優(yōu)的大米處理方法，在最短的時(shí)間內(nèi)得出更精準(zhǔn)的結(jié)果十分必要。本試驗(yàn)擬采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定大米中蛋白質(zhì)的含量，通過考查樣品質(zhì)量、濃硫酸添加量、消化溫度、消化時(shí)間等關(guān)鍵因素對(duì)蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響，確定最佳試驗(yàn)條件，得出最佳分析程序，以提高分析效率，節(jié)約試驗(yàn)試劑，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)大批量樣品的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

大米：產(chǎn)地分別為東北、江蘇、新疆、湖南、海南，均為當(dāng)?shù)刂放频拇竺住?/p>

1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、濃硫酸、硼酸、甲基紅：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

溴甲酚綠：指示劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

尿素：99.9%，GBW09201，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW(E)100126，國(guó)家糧食局科學(xué)研究院；

銅催化劑：4.5 g K2SO4+0.5 g CuSO4·5H2O/片，福斯華(北京)科貿(mào)有限公司。

1.3 試劑配置

1.3.1 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.1 mol/L) 按GB/T 601—2016配置及標(biāo)定。

1.3.2 氫氧化鈉溶液(400 g/L) 稱取4 000 g氫氧化鈉溶于水，冷卻后稀釋至10 L。

1.3.3 硼酸吸收溶液(含溴甲酚綠和甲基紅指示劑)

(1) 1%硼酸：將100 g硼酸溶于10 L純水中。

(2) 0.1%溴甲酚綠溶液：0.1 g溴甲酚綠溶于100 mL 95%乙醇中。

(3) 0.1%甲基紅溶液：0.11 g甲基紅溶液100 mL 95%乙醇中。

(4) 在10 L 1%的硼酸溶液中加入100 mL 1%溴甲酚綠和70 mL 1%甲基紅溶液混勻。

1.4 主要儀器設(shè)備

凱氏定氮儀：8400型，福斯華(北京)科貿(mào)有限公司；

消化爐：DT220型，福斯華(北京)科貿(mào)有限公司；

中藥粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子天平：ME204E型，梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 樣品制備 用中藥粉碎機(jī)粉碎大米，并過100目篩。

1.5.2 單因素試驗(yàn) 參考GB 5009.5-2016及定氮儀簡(jiǎn)報(bào)，用消化爐消化樣品，全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定蛋白質(zhì)。以蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)，分別考察樣品質(zhì)量(0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.75 g，固定濃硫酸添加量12 mL，消化溫度420 ℃、消化時(shí)間60 min，添加1片催化劑)、濃硫酸添加量(6.00，8.00，10.00，12.00，14.00，16.00，18.00 mL，固定樣品質(zhì)量0.50 g，消化溫度420 ℃，消化時(shí)間60 min，添加1片催化劑)、消化溫度(320，340，360，380，400，420，440 ℃，固定樣品質(zhì)量0.50 g，濃硫酸添加量12 mL，消化時(shí)間60 min，添加1片催化劑)、消化時(shí)間(30，40，50，60，70，80，90 min，固定樣品質(zhì)量0.50 g，濃硫酸添加量12 mL，消化溫度420 ℃，添加1片催化劑)4個(gè)因素對(duì)大米蛋白質(zhì)測(cè)定值的影響。

1.5.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取合理水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。

1.5.4 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) 稱取6個(gè)平行樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，稱取3個(gè)平行樣品，加入尿素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，同時(shí)利用全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)考察準(zhǔn)確度。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析并進(jìn)行Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

分析過程中，樣品稱取量一般依照樣品含氮量和均勻度而定[12]。一般來說，減少樣品質(zhì)量可以減少消化時(shí)間；同時(shí)，在保證試樣均勻的情況下，增加樣品質(zhì)量能夠減少系統(tǒng)誤差，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性。但是隨著樣品量的增加，消化過程需要消耗更多的硫酸、消化時(shí)間也會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)，因此，試驗(yàn)過程中確定合理的稱樣量十分必要。

由圖1可知，當(dāng)其他影響因素固定不變時(shí)，樣品質(zhì)量在0.25～0.75 g時(shí)，消化效果最好，蛋白質(zhì)測(cè)定值相對(duì)較高。當(dāng)樣品質(zhì)量超過0.75 g以后，隨著樣品質(zhì)量的增加，蛋白質(zhì)測(cè)定值有下降趨勢(shì)。在測(cè)定大米蛋白質(zhì)時(shí)，為保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，稱樣量可控制在0.25～0.75 g。

2.2 硫酸量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

大米中有機(jī)氮與濃硫酸共熱，在催化條件下被分解為無機(jī)氮，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合[13]，因此，濃硫酸在消化過程中起直接消化作用，濃硫酸用量直接影響消化結(jié)果。硫酸量過少會(huì)導(dǎo)致樣品消化不完全，試驗(yàn)結(jié)果偏低；濃硫酸用量過多，又會(huì)浪費(fèi)試劑。因此，確定合適的硫酸用量十分必要。由圖2可知，當(dāng)濃硫酸量為10～12 mL時(shí)消化效果最好，蛋白質(zhì)測(cè)定值最高。當(dāng)硫酸量<10 mL時(shí)，隨著濃流酸使用量的增加，蛋白質(zhì)測(cè)定值增大，硫酸量>10 mL后，隨著硫酸量的增加，蛋白質(zhì)測(cè)定值有下降趨勢(shì)。因此樣品量為0.5 g時(shí)，濃硫酸添加量宜控制在10 mL左右。

2.3 消化時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

消化時(shí)間關(guān)系到樣品中蛋白質(zhì)能否完全被分解，對(duì)測(cè)定結(jié)果有重要影響。由圖3可知，消化時(shí)間<50 min時(shí)，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)含量測(cè)定值增加，消化時(shí)間為50～90 min時(shí)，蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果差異不大。有研究[14]表明，消化時(shí)間過長(zhǎng)，氮元素會(huì)隨蒸氣逸出，造成結(jié)果偏低。為節(jié)約時(shí)間，測(cè)定大米蛋白質(zhì)時(shí)可將時(shí)間控制在50 min。

2.4 消化溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

消化過程本質(zhì)上是使大米中有機(jī)氮轉(zhuǎn)換成銨離子，氮的臨界分解溫度為373 ℃，理論上溫度越高，消化速度越快，但是過高的溫度勢(shì)必會(huì)引起氮元素的損失。由圖4可知，在溫度<400 ℃時(shí)，隨著消化溫度的升高，蛋白質(zhì)測(cè)定值也隨之增加，380～440 ℃時(shí)蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果最高，且無顯著差異?？梢娤瘻囟仁怯绊懴Ч牧硪粋€(gè)重要因素，并且消化溫度過低會(huì)造成消化不完全，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果偏低；消化溫度過高也對(duì)消化過程無益，有研究[15]表明，消化溫度過高容易造成氮元素?fù)p失，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。因此，進(jìn)行大米樣品處理時(shí)，宜將消化溫度控制在400 ℃左右。

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取樣品量、濃硫酸量、消化時(shí)間、消化溫度4個(gè)因素各取4個(gè)水平采用湖南大米作為試驗(yàn)材料進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表1。方差分析見表2。

由表2～6可知：消化溫度和消化時(shí)間的顯著值分別為0.000 1(P<0.05)和0.045 1(P<0.05)，可見消化溫度和消化時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響十分顯著；濃硫酸量的顯著值為0.095 2(0.050.10)，對(duì)測(cè)定結(jié)果無十分顯著影響。各因素影響次序分別為消化溫度>消化時(shí)間>濃硫酸量>樣品質(zhì)量。

因此，當(dāng)樣品質(zhì)量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時(shí)間為50 min時(shí)，消化效果最為理想，大米蛋白質(zhì)測(cè)定值最高。

2.6 精密度試驗(yàn)和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按照優(yōu)化后的樣品處理方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)，5種大米樣品各測(cè)定6次，計(jì)算均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。各稱取3個(gè)平行樣品，加入一定量的尿素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，同時(shí)稱取3份全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，檢驗(yàn)該處理方法的準(zhǔn)確性。

由表7可知：當(dāng)樣品質(zhì)量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時(shí)間為50 min時(shí)，5種大米蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最大值為0.101 1，說明該方法精密度高、穩(wěn)定性好。由表8可知：該處理?xiàng)l件下，試驗(yàn)回收率結(jié)果理想，平均回收率達(dá)到了100.1%。由表9可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率也達(dá)到了98.5%，說明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠 。

? 樣品測(cè)定值和加標(biāo)樣品測(cè)定值均以0.40 g樣品中氮含量計(jì)。

2.7 全自動(dòng)凱氏定氮法與半微量蒸餾法的比較

采用優(yōu)化后的全自動(dòng)凱氏定氮法和國(guó)標(biāo)方法中半微量蒸餾法(GB 5009.5—2016第一法5.1部分)分別測(cè)定5種大米的蛋白質(zhì)含量，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表10。

由表10可知，全自動(dòng)凱氏定氮法和半微量蒸餾法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)果的差值均為正值，在0.213 2～0.381 8；測(cè)定結(jié)果比值均>1，在1.023 4～1.079 4。說明2種方法的測(cè)定結(jié)果差異不大，且全自動(dòng)凱氏定氮法的測(cè)定值均要比半微量蒸餾法高，這是由于半微量蒸餾法涉及到多次樣品轉(zhuǎn)移，氮元素的損失不可避免。同時(shí)，全自動(dòng)凱氏定氮法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均要小于半微量蒸餾法，說明該方法穩(wěn)定性要要比半微量蒸餾法好；另一方面，全自動(dòng)凱氏定氮法與半微量蒸餾法相比，檢測(cè)時(shí)間由4 h縮短到1 h，并且減少了人為操作誤差，既提高了效率，又提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

消化溫度、消化時(shí)間和濃硫酸量對(duì)大米蛋白質(zhì)的測(cè)定結(jié)果有顯著影響，樣品質(zhì)量亦對(duì)測(cè)定結(jié)果有一定影響，4個(gè)影響因素的影響次序?yàn)橄瘻囟?消化時(shí)間>濃硫酸量>樣品質(zhì)量。

在測(cè)定大米蛋白質(zhì)過程中，控制試樣質(zhì)量為0.40 g，濃硫酸量為12 mL，消化溫度為420 ℃，消化時(shí)間為50 min，消化效果最佳，大米蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果較為理想，精密度試驗(yàn)和準(zhǔn)確度試驗(yàn)均達(dá)到了試驗(yàn)要求。該方法與傳統(tǒng)方法相比，操作更簡(jiǎn)便，減少了人為誤差，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)耗時(shí)短，提高了工作效率。

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