miR-125a-5p在大鼠終板軟骨細(xì)胞自然退變中的表達(dá)及其靶基因預(yù)測(cè)

徐永明，徐宏光，張曉玲，高智，肖良

（1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽蕪湖241001；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海200025）

miR-125a-5p在大鼠終板軟骨細(xì)胞自然退變中的表達(dá)及其靶基因預(yù)測(cè)

徐永明1，徐宏光1，張曉玲2，高智1，肖良1

（1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院脊柱外科，安徽蕪湖241001；2.中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院骨科細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海200025）

目的：通過(guò)建立體外大鼠終板軟骨細(xì)胞自然退變模型，探討miR-125a-5p在自然傳代誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變中的表達(dá)，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因.方法：取大鼠原代終板軟骨細(xì)胞，應(yīng)用胰酶消化法和自然傳代法培養(yǎng)終板軟骨細(xì)胞，分別選取P2、P5、P8代細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)及阿辛藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)改變.qRT-PCR檢測(cè)終板軟骨細(xì)胞中miR-125a-5p表達(dá)情況，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因.結(jié)果：細(xì)胞傳到P5代時(shí)細(xì)胞由多角形變成長(zhǎng)梭形，外基質(zhì)分泌減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生退變改變，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示miR-125a-5p表達(dá)含量隨細(xì)胞代數(shù)增加逐漸減少.結(jié)論：大鼠終板軟骨細(xì)胞自然傳代至P5代出現(xiàn)退變改變，miR-125a-5p與終板軟骨退變有密切聯(lián)系.

miR-125a-5p；終板軟骨細(xì)胞；軟骨退變

隨著人口結(jié)構(gòu)老齡化，脊柱退行性疾病發(fā)病率不斷上升，越來(lái)越多人們長(zhǎng)期被頸腰痛所折磨，在引起頸腰痛諸多因素中椎間盤退變被視為最為重要因素之一[1].盡管目前在臨床中可采取藥物、理療、手術(shù)等多種治療手段，但是臨床療效往往無(wú)法令患者達(dá)到滿意的效果，也無(wú)法從根本上去預(yù)防和阻止椎間盤退變進(jìn)一步發(fā)展.終板軟骨是構(gòu)成椎間盤一重要結(jié)構(gòu)，是椎間盤營(yíng)養(yǎng)獲得主要途徑，終板軟骨退變進(jìn)一步導(dǎo)致椎間盤退變，相反通過(guò)保護(hù)終板軟骨可以有效延緩椎間盤退變的發(fā)生[2,3]，因此對(duì)終板軟骨相關(guān)病理生理研究意義十分重要.

MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性表達(dá)，非編碼小RNA，能通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄抑制或切割進(jìn)而起到對(duì)mRNA基因表達(dá)抑制作用.盡管估計(jì)miRNAs在人類基因組只占1%–3%，但是它們?nèi)∧軌蛟谌祟愔姓{(diào)節(jié)大約30%的蛋白編碼基因[4].miR-125a-5p作為miRNA家族中一員，目前在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、胰腺腫瘤等方面研究廣泛受到人們的關(guān)注[5-7]，然而目前其在骨科領(lǐng)域尤其涉及到終板軟骨有關(guān)研究中報(bào)道甚少，本研究旨在揭示miR-125a-5p在終板軟骨退變中表達(dá)及相關(guān)意義.

1 材料與方法

1.1 材料

10只Sprague Dawley（SD）大鼠（160±15g，雌雄不限）購(gòu)買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2012-0002］.二型膠原酶（Sigma;美國(guó)）；0.25%Trypsin-EDTA溶液、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗溶液100×（Gibico;美國(guó)）；DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone;美國(guó)）；甲苯胺藍(lán)染色試劑盒、阿辛藍(lán)染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所;中國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Trizol試劑（Invitrogen;美國(guó)）；Realtime PCR試劑盒（takara;大連）；實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)儀（RocheLightCycler480;德國(guó)）；倒置熒光顯微鏡（Leica;德國(guó)）.

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代終板軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

10只SD級(jí)大鼠按500mg/kg藥物量腹腔注射濃度為4%水合氯醛處死，常規(guī)消毒后在超凈臺(tái)內(nèi)取出整段腰椎，用組織剪剔除腰椎附屬的肌肉、韌帶、軟組織，尖刀片分別切取各個(gè)節(jié)段腰椎間盤組織并用含1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2-3次，眼科剪再將獲得的終板軟骨組織剪碎成大小接近1mm3，0.25%Trypsin-EDTA溶液消化30min后加入0.2%II型膠原酶消化6h，將所得懸液過(guò)濾2-3次后離心懸液5mi（1000r/min）去除消化液，加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液吹打均勻并種植于10cm培養(yǎng)皿后放入無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（37℃含5%CO2），培養(yǎng)液每3天更換一次，細(xì)胞融合至大約90%時(shí)按1：2傳代.

1.2.2 甲苯胺藍(lán)染色

分別將P2、P5、P8代細(xì)胞種植在12孔培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至90%時(shí)收集細(xì)胞后用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定15min后PBS再次洗滌2次，每孔加入1ml甲苯胺藍(lán)染色60min去除染液后PBS洗滌3次，自然晾干后分別用倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞改變.

1.2.3 阿辛藍(lán)染色

如1.2.2所述，收集細(xì)胞后向12孔培養(yǎng)皿中每孔分別加阿辛藍(lán)染液1ml染色30分鐘，PBS洗滌3次，每次5分鐘，自然晾干后分別用倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞鏡改變.

1.2.4 RNA提取及RT-PCR

分別將不同代數(shù)的大鼠終板軟骨細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，用0.25%Trypsin-EDTA溶液消化細(xì)胞并離心后分別吸取至1.5ml EP管中，每管中加入0.5ml Trizol在冰上裂解提取RNA，按20μl反轉(zhuǎn)體系反轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行RT-PCR，每個(gè)樣品均設(shè)三個(gè)重復(fù)孔.設(shè)U6為內(nèi)部參照.反應(yīng)條件：95℃預(yù)變30s；95℃變性5s；60℃退火延伸25s，擴(kuò)增50個(gè)循環(huán).使用Roche LightCycler480軟件自動(dòng)分析結(jié)果，計(jì)算2-△△Ct值，rno-miR-125a-5p引物由廣州銳博生物公司合成.

1.2.5 靶基因預(yù)測(cè)及Gene Ontology（Go）分析

對(duì)miR-125a-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析時(shí)，為了增加靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，選取了miranda、mirbase、mirdb等3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)有關(guān)交集的靶基因作為最終預(yù)測(cè)結(jié)果.通過(guò)應(yīng)用David軟件對(duì)所得到的靶基因進(jìn)行Go分析，將靶基因按照參與有相關(guān)生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行分類.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本間t檢驗(yàn)，設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 大鼠終板軟骨細(xì)胞通過(guò)體外自然傳代發(fā)生退變改變

大鼠終板軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外自然傳代至P5代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，由多角形逐漸變成長(zhǎng)梭形，細(xì)胞排列較紊亂，生長(zhǎng)速度減慢，甲苯胺藍(lán)及阿辛藍(lán)染色見細(xì)胞外基質(zhì)分泌減少，細(xì)胞發(fā)生退變改變（見圖1）.

圖1 P2、P5、P8代大鼠終板軟骨細(xì)胞阿辛藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色（×100倍）

2.2 miR-125a-5p在大鼠終板軟骨細(xì)胞中表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示miR-125a-5p表達(dá)在大鼠終板軟骨細(xì)胞中隨著細(xì)胞代數(shù)增大呈逐漸減少趨勢(shì)，miR-125a-5p與軟骨細(xì)胞退變存在密切聯(lián)系（見圖2）.

圖2 大鼠不同代數(shù)終板軟骨細(xì)胞與原代比較miR-125a-5p表達(dá)情況（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01）

2.3 miR-125a-5p相關(guān)靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)3種不同生物軟件預(yù)測(cè)miR-125a-5p靶基因有1334個(gè)，其中3種軟件共同涉及到的靶基因有8個(gè)，有2種軟件共同涉及到的靶基因有112個(gè)，部分靶基因列出見表1、圖3.

表1 分別通過(guò)miranda、mirbase、mirdb3種生物信息軟件預(yù)測(cè)rno-miR-125a-5p可能結(jié)合的靶基因

圖3 miranda、mirbase、mirdb 3個(gè)生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-125a-5p有關(guān)靶基因韋恩圖

2.4 miR-125a-5p相關(guān)Go（Gene Ontology）分析

通過(guò)Go分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p主要通過(guò)參生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能3大方面進(jìn)行相應(yīng)靶基因的調(diào)控（見圖4）.

圖4 David軟件進(jìn)行miR-125a-5p有關(guān)Go分析

3 討論

當(dāng)今社會(huì)中腰腿痛不斷的影響著人類健康，椎間盤退變是引起腰痛的諸多病因中最常見原因之一.終板軟骨是構(gòu)成椎間盤重要組成部分，其主要由終板軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、二型膠原組成.對(duì)人日?；顒?dòng)過(guò)程中所產(chǎn)生的不同力學(xué)刺激具有重要調(diào)節(jié)功能，椎間盤獲取營(yíng)養(yǎng)途徑主要來(lái)源終板軟骨，終板軟骨的退變進(jìn)而引起椎間盤退變.研究通過(guò)保護(hù)終板軟骨可有效緩解椎間盤退變[2].通過(guò)對(duì)終板軟骨的研究對(duì)明確椎間盤退變有著重要意義.

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在1993年第一個(gè)miRNA被Lee等人發(fā)現(xiàn)[8].在不同物種中miRNA具有高度保守性，越來(lái)越多的miRNA被鑒定和研究在人類、動(dòng)物、植物以及病毒中，到目前大約超過(guò)2000多個(gè)miRNAs在人類中被發(fā)現(xiàn).目前發(fā)現(xiàn)的microRNA主要依賴與靶基因mRNA3’-UTR不完全互補(bǔ)及完全互補(bǔ)進(jìn)而影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性.對(duì)維系組織或器官系統(tǒng)的正常發(fā)育等方面有著重要作用.

目前miRNA與椎間盤退變相關(guān)研究漸有報(bào)道，胡凱等[9]發(fā)現(xiàn)在人退變椎間盤髓核組織中miR-663b表達(dá)水平明顯降低.miR-663b通過(guò)負(fù)向調(diào)控matrix metallopeptidase2（MMP-2）最終導(dǎo)致MMP-2在退變椎間盤組織中明顯增多.同時(shí)陳宇飛等[10]發(fā)現(xiàn)miR-129-5p表達(dá)在退變椎間盤髓核組織中顯著下調(diào)，并且通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miR-129-5p的靶基因?yàn)棰裥湍z原基因和整合素α1基因，從而引起細(xì)胞功能學(xué)的改變.并在小鼠體內(nèi)通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-129-5p可明顯抑制Ⅰ型膠原基因和整合素α1基因，從而抑制椎間盤中蛋白Ⅰ型膠原和整合素α1的合成，相反抑制miR-129-5p可上調(diào)Ⅰ型膠原基因和整合素α1基因，進(jìn)而對(duì)椎間盤退變起調(diào)控作用.

前期我們通過(guò)生物學(xué)芯片發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在腰椎退變的人終板軟骨中明顯比正常人椎間盤表達(dá)量低，并在人終板軟骨細(xì)胞體外得以驗(yàn)證.本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)自然傳代誘導(dǎo)大鼠終板軟骨細(xì)胞退變，qRT-PCR結(jié)果表明miR-125a-5p在自然傳代誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞退變隨細(xì)胞代數(shù)增多表達(dá)量逐漸減低，間接證實(shí)miR-125a-5p可能參與軟骨退變過(guò)程，并通過(guò)多種靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)Galnt14、Gcnt1、Itga7、Pipox、Prim2、Rhot2、Slc35a4、Sstr3最為有可能的靶基因，同時(shí)Go分析提示其參與多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中的調(diào)控.因此我們希望通過(guò)進(jìn)一步研究明確miR-125a-5p在椎間盤退變中調(diào)控的相關(guān)靶基因，闡明其在椎間盤退變中有關(guān)作用，目前miRNA作為椎間盤退變新的治療靶點(diǎn)，望今后在治療椎間盤退變等相關(guān)疾病帶來(lái)了新的曙光.

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R-332

：A

：1673-260X（2017）03-0039-03

2016-11-10

國(guó)家自然科學(xué)基金（81572185）

徐宏光，男，博士研究生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：脊柱外科與老年骨病