siRNA沉默Ran基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞株凋亡和Caspase-3、PARP表達(dá)的影響*

汪 鑫 耿 蕾 孫麗娜 孫利慧 盧瑗瑗 王 新

第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院 腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(710032)

·論 著·

siRNA沉默Ran基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞株凋亡和Caspase-3、PARP表達(dá)的影響*

汪 鑫 耿 蕾 孫麗娜 孫利慧 盧瑗瑗 王 新

第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院 腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(710032)

背景：結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌特異性抗原類硫氧還蛋白-2(Txl-2)的亞型之一Txl-2b可與Ras相關(guān)核蛋白(Ran)相互作用，但Ran在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用和機(jī)制鮮有報(bào)道。目的：以RNA干擾技術(shù)靶向沉默結(jié)腸癌細(xì)胞株Ran基因，觀察該方法對(duì)細(xì)胞凋亡和半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)表達(dá)的影響。方法：設(shè)置si-1、si-2、si-3以及陰性對(duì)照(NC)組，分別將終濃度為20、40、60 nmol/L的Ran小干擾RNA(siRNA)-1、siRNA-2、siRNA-3以及NC siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、DLD-1。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)siRNA干擾效率以及caspase-3、PARP表達(dá)的變化；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2抑制Ran表達(dá)的效果最佳。si-1組HCT116、DLD-1細(xì)胞的早期凋亡率較NC組顯著增加(19.37%±7.57%對(duì)4.83%±1.72%；16.53%±3.38%對(duì)6.27%±3.13%；P均<0.05)。si-1組、si-2組HCT116、DLD-1細(xì)胞的晚期凋亡率較NC組顯著增加(15.97%±3.31%、16.33%±5.40%對(duì) 6.40%±1.05%；22.93%±1.57%、11.50%±0.70%對(duì)6.20%±0.98%；P均<0.05)。si-1組、si-2組DLD-1細(xì)胞與NC組相比，被切割的caspase-3(活性形式)和被切割的PARP(非活性形式)表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論：沉默Ran基因能明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)控caspase-3、PARP表達(dá)有關(guān)。

結(jié)腸腫瘤； Ras相關(guān)核蛋白； RNA，小分子干擾； 細(xì)胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3； 聚ADP核糖聚合酶類

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。本課題組前期研究[1]采用分離自結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的癌細(xì)胞免疫BALB/c小鼠，以淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備了一組抗結(jié)腸癌單克隆抗體，命名為結(jié)腸癌單克隆抗體(monoclonal antibodies, MCs)系列。其中，MC3所識(shí)別的抗原MC3-Ag在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性率達(dá)90%以上[2]，且表達(dá)水平與結(jié)腸癌TNM分期、腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。其后本課題組進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法鑒定并驗(yàn)證了MC3-Ag為硫氧還蛋白家族新成員類硫氧還蛋白-2(thioredoxin like-2, Txl-2)[4]。Txl-2b是 Txl-2的一種亞型[5]，酵母雙雜交和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Txl-2b可與Ras相關(guān)核蛋白(Ras-related nuclear protein, Ran)相互作用[6]。Ran為Ras超家族成員，是細(xì)胞中含量最豐富的小G蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為25 kDa(1 Da=0.992 1 u)。Ran具有兩種形式，即GDP狀態(tài)下的非活性形式和GTP狀態(tài)下的活性形式[7]。Ran在生物體基本生理過程中發(fā)揮重要作用，如在分裂間期調(diào)節(jié)大分子物質(zhì)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[8]、在分裂前期促進(jìn)紡錘體形成、在分裂末期參與核膜再組裝[9]等。近年研究指出，Ran在諸多惡性腫瘤中呈高表達(dá)，包括結(jié)直腸癌[10]、胰腺癌[11]、胃癌[12]、乳腺癌[13]、卵巢癌[14]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[15]、非小細(xì)胞肺癌[16]等，且與腫瘤的惡性表型和不良預(yù)后密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[11]、侵襲和轉(zhuǎn)移[17]，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[13]等。然而，目前尚無研究證實(shí)Ran是否影響結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。本研究通過合成Ran特異性小干擾RNA(siRNA)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Ran表達(dá)，旨在探討Ran對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、DLD-1(ATCC細(xì)胞庫(kù))。DMEM培養(yǎng)基、0.25% EDTA-胰蛋白酶、胎牛血清、Opti-MEMTM無血清培養(yǎng)基(Gibco公司)；DharmaFECTTM1轉(zhuǎn)染試劑(GE Healthcare公司)；siRNA寡核苷酸(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)；Ran單克隆抗體、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Biosciences公司)；半胱天冬酶-3(caspase-3)、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、GAPDH單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；β-actin單克隆抗體(Sigma公司)；山羊抗鼠、抗兔HRP標(biāo)記IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

二、方法

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：HCT116、DLD-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2. siRNA轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116、DLD-1細(xì)胞接種至6孔板，以含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。第2 d待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)到30%時(shí)，每孔更換為1 600 μL Opti-MEMTM無血清培養(yǎng)基。設(shè)置si-1、si-2、si-3以及陰性對(duì)照(NC)組，分別將終濃度為20、40、60 nmol/L的三種不同序列片段的Ran siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)以及NC siRNA(表1)與200 μL Opti-MEMTM無血清培養(yǎng)基混合。將5 μL DharmaFECTTM1轉(zhuǎn)染試劑與200 μL Opti-MEMTM無血清培養(yǎng)基混合，室溫孵育5 min。將稀釋后的siRNA與稀釋后的DharmaFECTTM1轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20 min。每孔加入400 μL siRNA與DharmaFECTTM1轉(zhuǎn)染試劑混合液混勻，24 h后更換為完全培養(yǎng)基，72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 3種Ran siRNA和NC siRNA序列信息

3. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)siRNA干擾效率：收集細(xì)胞，提取總蛋白行蛋白定量，變性，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，非特異封閉，加入Ran單克隆抗體(滴度 1∶2 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(滴度 1∶4 000)，室溫孵育，ECL顯影，灰度分析，篩選最佳siRNA干擾序列。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4. 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將篩選出的siRNA序列按優(yōu)化濃度再次轉(zhuǎn)染HCT116、DLD-1細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)步驟同前)，72 h后離心消化，PBS清洗2遍，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，操作步驟參照試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)caspase-3、PARP表達(dá)變化：將篩選出的siRNA序列按優(yōu)化濃度再次轉(zhuǎn)染DLD-1細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)步驟同前)，72 h后離心消化，收集細(xì)胞提取總蛋白，以蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)caspase-3、PARP表達(dá)(實(shí)驗(yàn)步驟同前)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、Ran siRNA對(duì)HCT116、DLD-1細(xì)胞Ran表達(dá)的抑制效率

siRNA轉(zhuǎn)染HCT116、DLD-1細(xì)胞后，20、40、60 nmol/L si-1、si-2、si-3組的Ran蛋白表達(dá)水平均顯著低于NC組(P<0.05 )，其中以20 nmol/L si-1、si-2組的抑制效果最佳，抑制率均>50%，顯著高于其他濃度組以及si-3組(P均<0.01)(圖1、圖2)。故選擇20 nmol/L siRNA-1、siRNA-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、Ran siRNA對(duì)HCT116、DLD-1細(xì)胞凋亡的影響

NC組、si-1組、si-2組HCT116細(xì)胞早期凋亡率分 別為4.83%±1.72%、19.37%±7.57%和 21.10%±13.46%，si-1組早期凋亡率較NC組顯著增加(P<0.05)；三組晚期凋亡率分別為6.40%±1.05%、15.97%±3.31%和16.33%±5.40%，si-1組、si-2組晚期凋亡率均較NC組顯著增加(P<0.05)(圖3)。

NC組、si-1組、si-2組DLD-1細(xì)胞早期凋亡率分別為6.27%±3.13%、16.53%±3.38%和10.57%±0.85%，si-1組早期凋亡率較NC組顯著增加(P<0.05)；三組晚期凋亡率分別為6.20%±0.98%、22.93%±1.57%和11.50%±0.70%，si-1組、si-2組晚期凋亡率均較NC組顯著增加(P<0.01)(圖4)。

三、Ran siRNA對(duì)DLD-1細(xì)胞caspase-3、PARP表達(dá)的影響

si-1組、si-2組DLD-1細(xì)胞與NC組相比，未被切割的caspase-3(非活性形式，位于35 kDa處)表達(dá)無明顯變化，被切割的caspase-3(活性形式， 位于17 kDa和19 kDa處)表達(dá)水平顯著升高。si-1組、si-2組DLD-1細(xì)胞與NC組相比，未被切割的PARP(活性形式，位于116 kDa處)表達(dá)有所下降，被切割的PARP(非活性形式，位于89 kDa處)表達(dá)水平顯著升高(圖5)。

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01

*P<0.05, **P<0.01，***P<0.001

圖5 Ran siRNA對(duì)DLD-1細(xì)胞caspase-3、PARP蛋白表達(dá) 的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

討 論

細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活和表達(dá)調(diào)控。Caspases家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其激活和異常表達(dá)均可引起細(xì)胞凋亡。Caspases家族成員按其在凋亡中發(fā)揮的作用可分為啟動(dòng)型、效應(yīng)型和炎癥型三種類型。Caspase-3屬于效應(yīng)型，正常情況下，胞質(zhì)中的caspase-3以無活性的酶原形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，caspase-3被啟動(dòng)型caspases切割成小片段，成為有活性的caspase-3，進(jìn)而剪切細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白，如PARP、DNA裂解因子(DNA fragmentation factor, DFF)、核纖層蛋白A(lamin A)等。PARP屬于DNA修復(fù)酶，與DNA修復(fù)、基因完整性有關(guān)，是caspase-3最主要的切割底物。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，PARP被剪切成小片段，不能發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致DNA裂解，細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果表明，以siRNA抑制Ran表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、DLD-1細(xì)胞凋亡明顯增多；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中被切割的caspase-3和被切割的PARP表達(dá)水平均顯著升高，提示抑制Ran表達(dá)可通過誘導(dǎo)caspase-3活化和PARP失活促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

目前關(guān)于下調(diào)Ran引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未明確，相關(guān)研究數(shù)量有限。Yuen等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞在Ran下調(diào)后更易發(fā)生凋亡，可能與PI3K/Akt/mTORC1、Ras/MEK/ERK通路激活有關(guān)。Ran下調(diào)可影響細(xì)胞的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子核質(zhì)定位異常，進(jìn)而影響特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性表型發(fā)生。Schnepp等[15]的研究表明，LIN28B可作為Ran mRNA的結(jié)合蛋白促進(jìn)Ran轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞功能改變。此外，Guvenc等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，Ran對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制與存活素(survivin)表達(dá)下調(diào)有關(guān)，survivin 表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致凋亡抑制蛋白表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)caspase-3激活，從而引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，沉默Ran基因可通過誘導(dǎo)caspase-3活化和PARP失活促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一發(fā)現(xiàn)為臨床治療結(jié)腸癌提供了新思路，但下調(diào)Ran引起腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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(2016-11-08收稿；2016-12-14修回)

Effect of Silencing Ran Gene by siRNA on Apoptosis and Expressions of Caspase-3 and PARP in Colon Cancer Cell Lines

WANGXin,GENGLei,SUNLina,SUNLihui,LUYuanyuan,WANGXin.

XijingHospitalofDigestiveDiseases&StateKeyLaboratoryofCancerBiology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian(710032)

Background: Colon cancer is one of the common malignant tumors of digestive system. In our previous study, it has been demonstrated that colon cancer specific antigen thioredoxin like-2b (Txl-2b) can interact with Ras-related nuclear protein (Ran). However, there are few reports about the role and mechanism of Ran in tumorigenesis of colon cancer. Aims: To investigate the effect of Ran-targeting RNA interference on apoptosis and expressions of caspase-3 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) in colon cancer cell lines.Methods: 20, 40 and 60 nmol/L siRNA-1 (si-1 group), siRNA-2 (si-2 group), siRNA-3 (si-3 group) targeting to Ran gene and normal control siRNA (NC group) were transfected into colon cancer cell line HCT116 and DLD-1, respectively. The interference efficiency of siRNAs and expressions of caspase-3 and PARP were detected by Western blotting. Cell apoptosis was determined by flow cytometry. Results: 20 nmol/L siRNA-1 and siRNA-2 had the best effect on inhibiting expression of Ran. Early apoptosis rates of HCT116 and DLD-1 cells in si-1 group were significantly higher than those in NC group (19.37%±7.57%vs. 4.83%±1.72%; 16.53%±3.38%vs. 6.27%±3.13%;Pall <0.05). Late apoptosis rates of HCT116 and DLD-1 cells in si-1 and si-2 groups were significantly higher than those in NC group (15.97%±3.31%, 16.33%±5.40%vs. 6.40%±1.05%; 22.93%±1.57%, 11.50%±0.70%vs. 6.20%±0.98%;Pall <0.05). Compared with NC group, expressions of cleaved caspase-3 (active form) and cleaved PARP (inactive form) were significantly increased in DLD-1 cells of si-1 and si-2 groups. Conclusions: Silencing Ran gene can significantly promote the apoptosis of colon cancer cells, and its mechanism is related to the regulation of caspase-3 and PARP expression.

Colonic Neoplasms; Ras-Related Nuclear Protein; RNA, Small Interfering; Apoptosis; Caspase 3; Poly(ADP-ribose) Polymerases

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.03.003

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272650、81472701、81572929)